1、三生飲對局灶性腦缺血大鼠海馬區(qū)Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響 作者：王長松,王媛媛,晉光榮摘要目的：探討三生飲對大鼠局灶性腦缺血后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響。方法：用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，用SP免疫組織化學(xué)方法，檢測再灌注后3、6、12、24 h及3 d不同時段海馬區(qū)Bcl2和Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞平均計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析三生飲治療組和模型組的表達(dá)量。結(jié)果：兩組海馬區(qū)神經(jīng)元均大量表達(dá)Bax蛋白，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比，三生飲治療組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)Bcl2蛋白表達(dá)增多，表達(dá)時程延長（P0.05）；在缺血側(cè)海馬不同區(qū)域，Bcl2/Bax之值不同。結(jié)論：

2、大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)神經(jīng)元均有Bcl2和Bax蛋白的表達(dá)，而灌給三生飲可促進(jìn)海馬區(qū)Bcl2陽性細(xì)胞的表達(dá)，提高Bcl2/Bax值；但三生飲治療組大鼠海馬區(qū)腦細(xì)胞仍然過度表達(dá)Bax陽性蛋白，最終發(fā)生凋亡。 關(guān)鍵詞三生飲；腦缺血；海馬；Bcl2蛋白；Bax蛋白；大鼠 三生飲是治療卒中的代表方劑。以往的研究表明，該方可以縮小腦缺血大鼠的梗死體積，在局灶性腦缺血再灌注損傷中，可增加缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Bcl2的表達(dá)，延長表達(dá)時程，提高Bcl2/Bax之值，減少腦缺血后的細(xì)胞凋亡1。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步觀察該方對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響，以期為揭示三生飲的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)

3、依據(jù)。 1 材料與方法 11 動物健康成年SD（Sprague Dawley）大鼠99只，雌雄不拘，體重200250 g。 12 試劑兔抗Bcl2、Bax單克隆抗體（美國Santa crus公司），通用濃縮型SP（過氧化酶標(biāo)記的鏈霉親合素簡稱SP）試劑盒（山羊血清封閉液，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素）、DAB顯色液。以上抗體與試劑均從北京中山生物技術(shù)有限公司購得。13 藥物三生飲生藥包括生南星30 g、生川烏15 g、生附子15 g、木香7.5 g、生姜18 g，均由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)水煎，濃縮至實(shí)驗(yàn)所需濃度。 14 模型制作參照Zea Longa線栓法制作大

4、鼠局灶性腦缺血再灌注模型2。大鼠稱重后，用0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定于手術(shù)臺上；分離右側(cè)頸總動脈及同側(cè)迷走神經(jīng)，避免誤扎；分離頸內(nèi)及頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈近心端，用微動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，于頸總動脈遠(yuǎn)心端剪一小口插入尼龍線；松開微動脈夾，沿頸總動脈輕推線入頸內(nèi)動脈至有阻力時止，系緊結(jié)扎線，縫合切口，線尾端露于體外；從頸總動脈分叉處算起進(jìn)線約（18.50.5）mm，記錄結(jié)扎時間，1.5 h后拔出尼龍線10 mm行再灌注；假手術(shù)組插入深度小于9 mm。 15 分組及給藥造模后參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)評定，剔除0分及4分大鼠。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和三生飲治療組（簡稱治療

5、組）各30只；分別在缺血再灌注后3、6、12、24 h及3 d 5個時間點(diǎn)處死大鼠，每個時間點(diǎn)6只。另設(shè)正常對照組（簡稱正常組）3只，假手術(shù)組6只。給藥：術(shù)前1 d開始灌胃給藥，每12 h 1次。其中，治療組灌給濃度為1 gml-1的三生飲煎劑，每次2 ml，其它各組灌給蒸餾水每次2 ml。 16 取材與切片用0.4%戊巴比妥鈉過量麻醉大鼠，開胸腔經(jīng)心灌注固定后取腦，后固定2 h，置30%蔗糖磷酸緩沖液中4 過夜沉底；自視交叉后2 mm處，切取厚為2 mm的腦組織塊，置Leica冰凍切片機(jī)切片，片厚78 m，隔5張取1張貼片，-20 冰箱保存。 17 Bcl2、Bax免疫組化檢測取出冰凍切片，

6、室溫融化，磷酸鹽緩沖溶液(PBS）沖洗5 min3次，分別滴加0.3%雙氧水(H2O2）10 min、羊血清封閉液（110）15 min，一抗（1100），4 冰箱過夜。生物素標(biāo)記羊抗兔IgG（1300），37 恒溫箱30 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（1300），37 恒溫箱30 min。以上各步驟均以0.01 molL-1PBS（pH 7.27.4）沖洗3 min3次，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，終止反應(yīng)；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。對照試驗(yàn)用PBS代替一抗，余同上，結(jié)果陰性。 18 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理每張切片隨機(jī)采集6個具有代表性的高倍視野，采用網(wǎng)格計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

7、結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，P0.05表示有顯著性差異。 2 結(jié) 果 21 海馬區(qū)神經(jīng)元在腦缺血再灌注后不同時間Bcl2的表達(dá)正常組與假手術(shù)組均未見Bcl2陽性細(xì)胞表達(dá)，而治療組和模型組海馬區(qū)Bcl2陽性細(xì)胞在再灌注后3、6 h均有表達(dá)，表達(dá)量無顯著性差異；隨時間延長兩組均有不同程度增加，至再灌注后12 h模型組Bcl2陽性細(xì)胞達(dá)峰值，而治療組于再灌注后24 h表達(dá)數(shù)最多，之后呈減少趨勢；再灌注后3 d，治療組Bcl2陽性細(xì)胞表達(dá)量較多，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。見表1。22 海馬區(qū)神經(jīng)元在腦缺血再灌注后不同時間Bax的表達(dá)正常組和假手術(shù)

8、組海馬區(qū)均未見Bax陽性細(xì)胞表達(dá)，而治療組和模型組在再灌注3、6、12 h，海馬區(qū)Bax陽性細(xì)胞表達(dá)隨時間增加而增多，至24 h呈峰值，兩組表達(dá)數(shù)量無顯著性差異；再灌注24 h后Bax陽性細(xì)胞減少，兩組比較也無顯著性差異。見表1。表1 腦缺血再灌注后不同時間海馬區(qū)Bcl2、Bax的表達(dá) 3 討 論腦缺血屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，急性期以風(fēng)痰血瘀為主要病理因素，而“毒損腦絡(luò)”是其重要的病理機(jī)制3，辨證選用中藥可取得良好效果。然而，長期以來，由于畏懼藥物的毒性，許多療效獨(dú)特的中藥方劑被束之高閣。實(shí)際上，有毒中草藥有其毒性的一面，也有其治療作用的一面。只要正確使用，往往能產(chǎn)生顯著的治療效果。對于有毒中藥，

9、不僅可以通過合理配伍減毒增效，而且可以通過控制劑量、改變用藥途徑、選擇用藥對象等，達(dá)到特定的治療效果。中藥天南星、川烏、附子均是有毒之品，生用毒性更大。但三生飲的配方卻別出心裁，竟以三味大毒之品不經(jīng)炮制直接入方，用于治療中風(fēng)急癥寒痰壅滯之證。古人對本方多有應(yīng)用和論述，清姚濟(jì)蒼的卒中厥證輯要甚至將其列為治療卒中的主方。然而，由于本方的竣烈毒性，當(dāng)代醫(yī)家對其效果少有探索。瀏覽近10年全國中文期刊，有關(guān)該方的研究論文寥寥無幾，但研究結(jié)果值得重視。孫愛續(xù)等通過動物實(shí)驗(yàn)證明，三生飲能顯著增加腦血流量和股動脈血流量，降低腦氧耗量，且全方作用效果明顯優(yōu)于拆方；同時該方的療效與其毒性密切相關(guān)45；楊萬章等證明

10、該方對大鼠腦出血具有確切效果67。因此，有必要用現(xiàn)代藥理學(xué)和動物試驗(yàn)方法研究三生飲的毒性和效用，這是開發(fā)腦缺血急性期高活性新藥的重要途徑，也是發(fā)揮中醫(yī)優(yōu)勢的新思路。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，其血管構(gòu)筑非常獨(dú)特，是腦內(nèi)對缺血最敏感的區(qū)域。局灶性腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，而Bcl2基因及Bax參與凋亡的調(diào)節(jié)：由Bcl2基因編碼的Bcl2蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的存活，而Bax蛋白則加速細(xì)胞的死亡；當(dāng)Bcl2過量表達(dá)時，其與Bax形成的異源二聚體可以抑制細(xì)胞的凋亡；而當(dāng)細(xì)胞中Bax過量表達(dá)時，凋亡效應(yīng)則增強(qiáng)8。本實(shí)驗(yàn)提示，三生飲有促進(jìn)海馬區(qū)Bcl2陽性細(xì)胞表達(dá)的作用，但這一作用還不足以

11、抑制細(xì)胞的凋亡，因而海馬區(qū)腦細(xì)胞仍然過度表達(dá)Bax陽性蛋白，最終發(fā)生凋亡。作者在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在缺血不同區(qū)域，Bcl2/Bax之值完全不同：CA1區(qū)Bcl2表達(dá)量極少，Bcl2/Bax值較小，細(xì)胞趨于死亡；而CA3區(qū)Bcl2表達(dá)量增加，Bcl2/Bax值也隨之增大，有可能減緩細(xì)胞的凋亡?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，三生飲中的5味藥所含成分有相當(dāng)一部分可起協(xié)同作用，起到抗氧化、擴(kuò)張血管、降低血壓、抑制血小板聚集等作用。作者以往的研究發(fā)現(xiàn)，該方可在腦缺血再灌注12 h促進(jìn)大腦皮質(zhì)的Bcl2的表達(dá)，增加Bcl2/Bax值，抑制Bax蛋白表達(dá)引起的凋亡1。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)一些星形膠質(zhì)細(xì)胞也有Bcl2及Bax蛋白的

12、表達(dá)，其意義有待于進(jìn)一步的研究。當(dāng)然，三生飲作為復(fù)方制劑，其治療腦缺血損傷的具體機(jī)制尚不能用一兩種基因的表達(dá)來解釋。為明確其機(jī)理，還需在組織或系統(tǒng)的水平進(jìn)一步研究。 參考文獻(xiàn) 1王媛媛，王長松，胡曼菁，等.三生飲對大鼠局灶性腦缺血Bcl2、Bax蛋白表達(dá)的影響J.遼寧中醫(yī)雜志,2005，32（5）：492494. 2ZEA L,WEINSTEN P R,CARLSON S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke,1989,20(1):8491. 3王永炎.關(guān)于

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