1、LMP1與綠色熒光蛋白融合基因慢病毒的制備(1)】 目的: 制備EB病毒LMP1與綠色熒光蛋白（GFP）融合基因慢病毒. 方法: 采用RT PCR方法獲得LMP1全外顯子片段,使之克隆到帶綠色熒光蛋白慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒FUGW中. 經(jīng)限制性酶切、PCR擴(kuò)增和測序鑒定重組載體. 在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將慢病毒包裝系統(tǒng)的包裝結(jié)構(gòu)基因pCMV.8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGWLMP1導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞293FT， 熒光顯微鏡檢測基因的表達(dá)，包裝成病毒后，收集病毒上清，濃縮，PCR鑒定. 結(jié)果： 限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序分析證實(shí)RTPCR獲得的LMP1 cDNA片段與GenBank中的數(shù)據(jù)完全吻合

2、; LMP1準(zhǔn)確克隆入FUGW的多克隆位點(diǎn). 慢病毒的3種質(zhì)?？筛咝мD(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察可見大量的綠色熒光. 綠色熒光位于細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì). 結(jié)論: 成功制備了LMP1與GFP融合基因慢病毒，為研究EBV瘤基因LMP1在多種疾病中的作用機(jī)制提供適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體.【關(guān)鍵詞】 潛伏膜蛋白1;聚合酶鏈反應(yīng);慢病毒0引言EB病毒(EpsteinBarr virus,EBV)與淋巴瘤、鼻咽癌、傳染性單核細(xì)胞增多癥等多種疾病密切相關(guān). 該EB病毒可編碼至少60種產(chǎn)物,其中潛伏膜蛋白1 (latentmembrane protein 1, LMP1)具有廣泛的細(xì)胞生物學(xué)功能1，在淋

3、巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化和永生化的過程中起重作用; 經(jīng)LMP1轉(zhuǎn)化了的B淋巴細(xì)胞不僅在形態(tài)上發(fā)生了改變,而且具有使裸鼠致瘤的能力2,3. 如何將基因高效轉(zhuǎn)染及長期穩(wěn)定表達(dá)成為人們研究的熱點(diǎn). 近期研究者把目光投向了以型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1, HIV1)為代表的慢病毒不僅具有可感染非分裂期的細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)4，而且對(duì)重組包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒及重組目的基因穿梭質(zhì)粒進(jìn)行了改造后，極大降低了其自我復(fù)制能力,使安全性大大提高，有望成為理想的基因載體5. 我們采用RTPCR方法獲得LMP1全外顯子片段,并將其克

4、隆入慢病毒表達(dá)載體并進(jìn)行了序列測定,利用包裝細(xì)胞293FT制備了慢病毒，旨在制備LMP1與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合基因慢病毒，為研究EBV瘤基因LMP1在多種疾病中的作用機(jī)制提供適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體.1材料和方法11材料質(zhì)粒pCMV.8.9, FUGW及VSVG由美國Carlos Lois博士惠贈(zèng)，pCMV.8.9為包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒，主起病毒包裝功能，表達(dá)酶蛋白形成病毒衣殼結(jié)構(gòu)； VSVG為包膜質(zhì)粒;大腸桿菌JM109(本室凍存菌種); EBV感染絨猴淋巴細(xì)胞株95.8(本室凍存細(xì)胞株)一步法RTPCR試劑盒,購自Gibco公司;限制性內(nèi)切

5、酶BamH和Taq酶、T4 DNA連接酶、RNase, 瓊脂(B.M.,寶靈曼);低熔點(diǎn)瓊脂糖(FMC);dNTP, PCR marker, 普通瓊脂糖、10 g/L EB(華美生物公司);胰蛋白胨和酵母提取物(Oxiod); Tris堿();其他試劑(均為國產(chǎn)分析純).12方法121引物設(shè)計(jì)根據(jù)EBV基因組(95.8來源)序列,設(shè)計(jì)合成了兩條引物, 上游和下游引物分別對(duì)應(yīng)于EBV基因組的169 474169 456 bp與168 163168 181 bp處,并且引入了限制性內(nèi)切酶BamH的識(shí)別位點(diǎn)(上海生工生物工程公司合成).122RTPCR法擴(kuò)增LMP1 cDNA以下所用的常規(guī)方法參照文

6、獻(xiàn)6. 總RNA抽提用TRIzol試劑抽提95.8細(xì)胞的總RNA,DNAse處理去除DNA污染. 瓊脂糖凝膠電泳觀察有無降解,測定其在260與280下的吸光度,計(jì)算吸光度比值和總RNA的含量. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：使用SUPERCRIPTTM ONE STEP RTPCR system進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR. 反應(yīng)體系為: 2 L(約為2 g)總RNA模板,2反應(yīng)液25 ,下游引物(10 mol/L) 1 L, 2.5 mmol/L MgCl2溶液0.6 L,酶混合物1 L,最后用滅菌DEPC水補(bǔ)足至49 L,50下,保溫60 min. 加上游引物(10 mol/) 1 L,在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng):

7、 94, 2 min; 94, 40 s56, 1 min72, 1 min 30 s,共35個(gè)循環(huán); 72延伸8 min. 取5 L反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析.123FUGWLMP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因與FUGW質(zhì)粒的酶切及純化常規(guī)方法制備并純化質(zhì)粒. 目的基因和FUGW經(jīng)BamH單酶切后,用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的純化片段. FUGW質(zhì)粒純化片段去磷酸化處理. 目的基因與FUGW的連接反應(yīng)FUGW酶切純化質(zhì)粒1 L(約0.1 g), LMP1 cDNA酶切純化產(chǎn)物5 L(約0.4 g),4連接酶1 L (1 ), 10反應(yīng)緩沖液1 L,用水補(bǔ)足至10 L, 16連接20 h.

8、 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5. 將10 L連接產(chǎn)物加入100 L感受態(tài)菌中,冰浴30 min,42熱休克90 s,立即靜置冰浴2 min,加入800 L LB培養(yǎng)基, 37 100 r/min振搖45 min. 用無菌擴(kuò)散棒將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含有100 mg/氨芐的LB選擇平板上倒置培養(yǎng)過夜.作者：李先茂，趙彤,朱梅剛,張三泉，張進(jìn)華【關(guān)鍵詞】聚合酶鏈反應(yīng)Production of lentivirus of LMP1 and GFP re 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)

9、習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。124LMP1基因表達(dá)載體的限制性酶切鑒定及序列測定篩選數(shù)個(gè)陽性菌落,微量快速法提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行限制性酶切和PCR擴(kuò)增. 委托上海博亞公司對(duì)重組載體進(jìn)行序列測定,取與GenBank所公布的相應(yīng)序列正向相符的質(zhì)粒.125慢病毒的包裝、濃縮及鑒定按照操作說明，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)染. 在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將上述質(zhì)粒分兩組（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組）混合轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞，質(zhì)粒為3種質(zhì)?；旌?，即包膜質(zhì)粒（VSVG）、包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒（8.9）、目的基因重組質(zhì)粒（FUGWLMP1為實(shí)驗(yàn)組，F(xiàn)UGW為對(duì)照組），3種粒濃度

10、混合比例（g/L）為543. 2448 h后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)大量熒光后收集病毒上清，收集的病毒上清濃縮后分裝備用或立即使用. 重組慢病毒活性測定: 將濃縮后的病毒貯存液作不同比例稀釋，熒光分光光度計(jì)檢測上清中病毒. 另外取500 L加至293FT細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入polybrene（聚凝安）終濃度為8 mg/L于37吸附30 min，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1824 h，于熒光顯微鏡下觀察.2結(jié)果總RNA抽提用TRIzol試劑抽提的B95.8細(xì)胞總RNA的質(zhì)量良好. A260 nm/A280 nm=1.8. LMP1 cDNA的RTPCR所設(shè)計(jì)引物位于LMP1全外顯子的上下游,包含起始密碼

11、子,不包含終止密碼子，擴(kuò)增片段大小為1.1 kb. RTPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見一清晰的特異性擴(kuò)增條帶,其大小與理論預(yù)期值相符. 基因慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定：構(gòu)建的基因表達(dá)載體經(jīng)BamH單酶切,獲得與目的基因一致的清晰條帶,而空載質(zhì)粒上只有9956 bp的單一片段（Fig 1）. 測序：DNA測序的結(jié)果表明，我們所獲得的LMP1 cDNA與GenBank所公布的相應(yīng)序列正向相符，無堿基缺失及錯(cuò)誤. 慢病毒包裝結(jié)果： 用質(zhì)脂體將已構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)中3種質(zhì)粒成分轉(zhuǎn)移至包裝細(xì)胞293FT中,熒光顯微鏡下見大量綠色熒光,證實(shí)已有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞，綠色熒光位于細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)（Fi

12、g 2,3）這與LMP1的表達(dá)位置一致. 熒光分光光度計(jì)檢測病毒上清 ,設(shè)激發(fā)波長為470 nm,測到510 nm處激發(fā)出熒光; 取病毒上清感染293FT，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞膜上及胞質(zhì)中有綠色熒光分布，說明制備的慢病毒有活性.3討論我們選用復(fù)制HIV1作為載體，制備了EB病毒LMP1與熒光蛋白融合基因慢病毒. 復(fù)制缺陷型HIV1載體由目的基因載體成分、包裝結(jié)構(gòu)成分和包膜結(jié)構(gòu)成分三部分組成. 目的基因載體成分是將HIV 3端LTR中的U3部分切短，使之喪失啟動(dòng)病毒復(fù)制功能，同時(shí)插入CMV啟動(dòng)子的調(diào)控，即成為復(fù)制缺陷型病毒載體. 包裝結(jié)構(gòu)成分由HIV1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用

13、序列而構(gòu)建，但能夠提供產(chǎn)生病毒顆粒所必須的蛋白，如gag和pol蛋白，極大降低了其自我復(fù)制能力,使安全性大大提高. 為了便于觀察研究,本研究中采用新型報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)基因,將其與LMP1基因共同構(gòu)建至載體上.GFP作為報(bào)告基因的特點(diǎn)和優(yōu)勢在于: GFP在470 nm波長處可吸收激發(fā)光,在510 nm發(fā)射綠色熒光, 只有足夠的表達(dá),在紫外光照射下,無需引入別的物質(zhì),在活體內(nèi)通過顯微鏡就能清晰地觀察到. 而其他一些報(bào)告基因如氯霉素、乙酰轉(zhuǎn)移酶7、半乳糖苷酶、熒光素酶等都需用底物、輔助因子等參與才能檢測其活性. 因此, GFP作為報(bào)告基因具有觀察簡單方便和直觀的優(yōu)點(diǎn)8. 本研究在質(zhì)粒轉(zhuǎn)

14、染后,通過熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞膜上及胞質(zhì)中有大量綠色熒光,說明已有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞;進(jìn)一步收集病毒上清,初步證實(shí)了慢病毒包裝成功,存在于病毒上清中，為研究EBV瘤基因LMP1在多種疾病中的作用機(jī)制提供適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體.【參考文獻(xiàn)】1 Panagopoulos D, Victoratos P, Alexiou M, et al. Comparative analysis of signal transduction by CD40 and the EpsteinBarr virus oncoprotein LMP1 in vivoJ. J Virol, 2004;78(23)

15、:13253-13261.2 Li W, Wu BA, Zeng YM, et al. EpsteinBarr virus in hepatocellular carcinogenesisJ. World J Gastroenterol, 2004;10(23):3409-3413.3 Cherney BW, Sgadari C, Kanegane C, et al. Expression of the EpsteinBarr virus protein LMP1 mediates tumor regression in vivoJ. Blood, 1998;91(7):2491.4 Ouya

16、ng J, Alway SE. Transgene expression in hypertrophied and aged skeletal muscle in vivo by lentivirus deliveryJ. J Gene Med, 2004;6(3): 278-287.5 Lois C, Hong EJ, Pease S, et al. Germline transmission and tissuespecific expression of transgenes delivered by lentiviral vectorsJ. Science, 2002;295(5556):868-872.6 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M. 第3版. 黃培覺譯. 北京：科學(xué)出版社，2002： 516-540.7 郭軍,丁杰,樊代明,等. 小鼠1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2