1、第第1515章章 核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的超速離心核酸的超速離心核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳核酸的核苷酸序列測(cè)定核酸的核苷酸序列測(cè)定DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）DNA的化學(xué)合成的化學(xué)合成 制備天然核酸必需采用溫和的條件，制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測(cè)定一、核酸的分離、提純和定量測(cè)定真核真核DNA以核蛋白（以核蛋白（DNP）形式存在，）形式存在，DNP溶于溶于水或高鹽溶液（

2、水或高鹽溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低鹽），但不溶于低鹽溶液（溶液（0.14mol/L NaCl），據(jù)此，細(xì)胞破碎后采），據(jù)此，細(xì)胞破碎后采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與與RNA核蛋核蛋白分開，提取出白分開，提取出DNP。去除蛋白質(zhì)去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇乙醇（一）（一）DNA分離純化分離純化也可用也可用SDS破碎細(xì)胞，蛋白酶破碎細(xì)胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚降解蛋白后，苯酚抽提，再用抽提，再用RNase分解除去分解除去RNA而獲得純化的而獲得純化的DNA。制備制備RNA時(shí)

3、，最重要的是使時(shí)，最重要的是使RNase滅活：滅活：容器用容器用0.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。處理。然后經(jīng)過然后經(jīng)過高溫處理高溫處理。 DEPC能使蛋白質(zhì)乙基化而破壞能使蛋白質(zhì)乙基化而破壞RNase活性；活性；加入加入強(qiáng)變性劑強(qiáng)變性劑（如胍鹽：（如胍鹽：可使所有蛋白質(zhì)變性可使所有蛋白質(zhì)變性）使使RNase失活；失活；在在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的的抑制劑抑制劑（如（如RNasin)（二）（二）RNA的分離的分離 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。鹽酸胍、苯酚等去蛋白用酸性胍鹽用酸性胍鹽/ /苯酚苯酚/ /氯

4、仿抽提：異硫氰酸胍是極氯仿抽提：異硫氰酸胍是極強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑。后用苯酚和氯仿多次除凈蛋強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑。后用苯酚和氯仿多次除凈蛋白質(zhì)白質(zhì)用胍鹽用胍鹽/ /氯化銫將細(xì)胞抽提物進(jìn)行密度梯度離氯化銫將細(xì)胞抽提物進(jìn)行密度梯度離心，蛋白質(zhì)在最上面，心，蛋白質(zhì)在最上面，DNADNA在中間，在中間，RNARNA沉在底部沉在底部mRNA的制備：oligo(dT)纖維素（瓊脂糖凝膠）親合層析法 制備制備RNA的方法：的方法：（三）核酸含量的測(cè)定（三）核酸含量的測(cè)定2、定糖法定糖法 RNA：核糖核糖 糠醛糠醛 綠色物質(zhì)（綠色物質(zhì)（670-680nm） DNA：脫氧核糖脫氧核糖+二苯胺二苯胺蘭色物質(zhì)（蘭色物質(zhì)（5

5、95-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法紫外吸收法1個(gè)個(gè)A50g/ml 雙鏈雙鏈DNA 40g/ml RNA或單鏈或單鏈DNA3、定磷法定磷法 核酸含磷量為核酸含磷量為9.5% 1g磷相當(dāng)于磷相當(dāng)于10.5g核酸核酸4、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 溴乙錠溴乙錠能插入能插入DNA分子的分子的堿基堿基對(duì)對(duì)間形成復(fù)合物間形成復(fù)合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光 熒光強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比含量成正比細(xì)胞或組織中核酸含量測(cè)定方法細(xì)胞或組織中核酸含量測(cè)定方法生物組織生物組織酸溶性物質(zhì)酸溶性物質(zhì)殘留物殘留物冷的稀酸抽提冷的稀酸抽提脂類物質(zhì)脂類

6、物質(zhì)殘留物殘留物熱酸法熱酸法冷酸法冷酸法堿法堿法殘留物殘留物 酸抽提液酸抽提液(RNA + DNA)熱酸提取熱酸提取殘留物殘留物殘留物殘留物酸抽提液酸抽提液 (DNA)熱酸提取熱酸提取酸抽提液酸抽提液 (RNA)冷酸提取冷酸提取酸抽提液酸抽提液 (RNA)殘留物殘留物(DNA)有機(jī)溶劑抽提有機(jī)溶劑抽提堿降解再酸化堿降解再酸化純純DNA DNA 比值比值1.81.8， 1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染純純RNA RNA 比值比值2.02.0， 2.0 DNA 2.0 DNA、 PrPr、苯酚污染、苯酚污染（四）、核酸純度的測(cè)定OD260OD280二、核酸的沉降特性與超速離心二、核酸的

7、沉降特性與超速離心 利用超離心技術(shù)，可以測(cè)定核酸的沉降常數(shù)利用超離心技術(shù)，可以測(cè)定核酸的沉降常數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量。密度梯度沉降平衡超離心法在和相對(duì)分子質(zhì)量。密度梯度沉降平衡超離心法在核酸分子構(gòu)象的研究中應(yīng)用頗廣。核酸分子構(gòu)象的研究中應(yīng)用頗廣。DNA分析時(shí)，分析時(shí)，常用氯化銫密度梯度。主要應(yīng)用于以下方面：常用氯化銫密度梯度。主要應(yīng)用于以下方面：核酸密度的測(cè)定核酸密度的測(cè)定測(cè)定測(cè)定DNA中的中的G-C含量含量溶液中核酸構(gòu)象的研究溶液中核酸構(gòu)象的研究1.用于核酸的制備用于核酸的制備8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡時(shí)：浮力密度平衡時(shí)：浮力密

8、度=CsCl密度密度=離心力離心力=0 +4.22（r2 - r02） 10-10 ：未知：未知DNA的密度的密度0：為標(biāo)準(zhǔn)：為標(biāo)準(zhǔn)DNA的密度的密度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離r0：已知：已知DNA到轉(zhuǎn)軸的距離到轉(zhuǎn)軸的距離（一）核酸密度的測(cè)定G-C含量與含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系，的浮力密度之間呈正比關(guān)系，因此可用能用該方法計(jì)算因此可用能用該方法計(jì)算DNA堿基成分，堿基成分，計(jì)算公式為：計(jì)算公式為：=0.1 xG-C + 1.658xG-C =（-1.658） 10需注意的是：需注意的是： 含含5-甲基胞嘧啶多的甲基胞嘧啶多的DNA

9、，其，其實(shí)際浮力密度會(huì)降低，低于理論值，不能實(shí)際浮力密度會(huì)降低，低于理論值，不能用該公式計(jì)算。用該公式計(jì)算。（二）測(cè)定（二）測(cè)定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA變性變性DNA雙鏈雙鏈DNA 蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構(gòu)象（三）研究核酸的構(gòu)象（四）用于核酸的制備（四）用于核酸的制備 不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不不同，用密度梯度離心可以將不同構(gòu)象同構(gòu)象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分與蛋白質(zhì)區(qū)分開來，利用開來，利用EB（溴化乙錠

10、）與核（溴化乙錠）與核酸結(jié)合，能在紫外燈下發(fā)出熒光酸結(jié)合，能在紫外燈下發(fā)出熒光的特性，將目的區(qū)帶收集。的特性，將目的區(qū)帶收集。是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法。有許多的是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法。有許多的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、靈敏、成本低。常用的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、靈敏、成本低。常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。三、核酸的凝膠電泳三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于大片段用于大片段DNA或或RNA的分離，精度低，但分的分離，精度低，但分離范圍廣。離范圍廣。電泳遷移率決定于：電泳遷移率決定于：（1）核酸分子的大小）核酸分子的大小

11、（遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成反比）（遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成反比）（2）膠濃度）膠濃度 （遷移率與膠濃度成反比，常用（遷移率與膠濃度成反比，常用0.71%）（3）DNA的構(gòu)象：的構(gòu)象：超螺旋線狀分子開環(huán)狀分子超螺旋線狀分子開環(huán)狀分子（4 4）電壓）電壓 （一般（一般5V/cm,5V/cm,電壓與遷移率成正比電壓與遷移率成正比) )（5 5）堿基組成（影響不大）堿基組成（影響不大）（6 6）溫度（）溫度（4 43030都可以，常室溫進(jìn)行）都可以，常室溫進(jìn)行） 瓊脂糖凝膠電泳常用于瓊脂糖凝膠電泳常用于DNADNA分析；分析分析；分析RNARNA時(shí)需加時(shí)需加入蛋白質(zhì)變性劑甲醛。電泳完畢用溴化乙錠入

12、蛋白質(zhì)變性劑甲醛。電泳完畢用溴化乙錠（0.5g/mL0.5g/mL）染色，用紫外光檢測(cè)）染色，用紫外光檢測(cè)瓊脂糖電泳用于瓊脂糖電泳用于DNA分子量的測(cè)定分子量的測(cè)定在同一凝膠中加入已知相對(duì)分子質(zhì)量的樣品（分子marker) ，在電泳完成后，通過染色，照相，從照片上比較待測(cè)樣品的DNA片段與標(biāo)準(zhǔn)樣品的中的已知大小片段，可以推測(cè)待測(cè)未知DNA片段的分子大小。用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相對(duì)分子質(zhì)量小于相對(duì)分子質(zhì)量小于1000bp1000bp的的DNADNA片斷片斷和和RNARNA的電泳。的電泳。PAGEPAGE中一般不含中一般不含RNaseRNase，用于，用于RNARNA分分析時(shí)不會(huì)分

13、解樣品。析時(shí)不會(huì)分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）（一）（一）DNADNA的酶法測(cè)定的酶法測(cè)定四、核酸的核苷酸序列測(cè)定四、核酸的核苷酸序列測(cè)定英國(guó)英國(guó) SangerSanger1955 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，1958 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1975 1975 設(shè)計(jì)出設(shè)計(jì)出DNADNA測(cè)序法，測(cè)序法，1980 1980 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)合成一系列與待測(cè)合成一系列與待測(cè)DNADNA序列互補(bǔ)的序列互補(bǔ)的DNADNA片段群。片段群。 末端終止法末端終止法Sanger22，33雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸

14、（ddNTPddNTP）是）是DNADNA合成鏈延伸的合成鏈延伸的抑制抑制劑劑。DNA序列分析儀：序列分析儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP（二）（二）DNADNA的化學(xué)法測(cè)序：由的化學(xué)法測(cè)序：由MaxamMaxam和和GilbertGilbert所所發(fā)明。其基本原理是用特異的發(fā)明。其基本原理是用特異的化學(xué)試劑化學(xué)試劑作用于作用于DNADNA分子中的不同堿基，然后用分子中的不同堿基，然后用哌啶哌啶切斷反應(yīng)堿切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈。用基的多核苷酸鏈。用4 4組不同的特異反應(yīng)，可使組不同的特異反應(yīng)，可使末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的DNADNA分子切成不同長(zhǎng)度的片斷，其末分子切成不同長(zhǎng)度的片斷，其末端都是該特

15、異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測(cè)序圖譜顯影得到測(cè)序圖譜 4 4組特異的反應(yīng)如下：組特異的反應(yīng)如下：（1 1）G G反應(yīng)：用硫酸二甲酯反應(yīng)：用硫酸二甲酯DMSDMS使鳥嘌呤上的使鳥嘌呤上的N N7 7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂鏈可在此處斷裂（2 2）G+AG+A反應(yīng)：用甲酸使反應(yīng)：用甲酸使A A和和G G嘌呤環(huán)上的嘌呤環(huán)上的N N原子原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂啶使鍵斷裂（3 3）T+CT+C反應(yīng)：用肼使反應(yīng)：用肼使

16、T T和和C C的嘧啶環(huán)斷裂，再的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基用哌啶除去堿基（4 4）C C反應(yīng)：當(dāng)有鹽存在時(shí)，只有反應(yīng)：當(dāng)有鹽存在時(shí)，只有C C與肼反應(yīng)，與肼反應(yīng)，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂（三）（三）RNA的測(cè)序的測(cè)序 RNA的測(cè)序方法有的測(cè)序方法有3個(gè)：個(gè)：（1）用酶特異切斷）用酶特異切斷RNA鏈：鏈：胰RNase A：嘧啶核苷酸鍵米曲霉RNase T1：鳥苷酸核苷酸鍵黑粉菌RNase U2：腺苷酸核苷酸鍵多頭黏菌RNase Phy I：A、G、U核苷酸鍵（2）用化學(xué)試劑裂解）用化學(xué)試劑裂解

17、RNA（與（與DNA化學(xué)化學(xué)測(cè)序法類似）測(cè)序法類似）（3）逆轉(zhuǎn)錄成）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA19951995年年K.MullisK.Mullis發(fā)明?；静襟E為：發(fā)明。基本步驟為：1.1.設(shè)計(jì)一對(duì)引物以便有效擴(kuò)增所需要的設(shè)計(jì)一對(duì)引物以便有效擴(kuò)增所需要的DNADNA序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物2.2.優(yōu)化反應(yīng)體系：包括適量模板、引物、優(yōu)化反應(yīng)體系：包括適量模板、引物、4 4種種dNTPdNTP、耐高溫的、耐高溫的DNADNA聚合酶和適量聚合酶和適量MgMg2+2+五、五、DNADNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）3.3.選擇選擇3 3個(gè)溫度進(jìn)行

18、熱循環(huán)：個(gè)溫度進(jìn)行熱循環(huán)：變性變性9494，454560s60s；退火，根據(jù)引物的退火，根據(jù)引物的TmTm，一般為兩引物中較，一般為兩引物中較低的低的TmTm值減值減2 2，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。熱循環(huán)。熱循環(huán)25-3025-30個(gè)周期，個(gè)周期，最后延伸最后延伸1010分鐘。分鐘。4.4.擴(kuò)增完成后取出一定量的反應(yīng)產(chǎn)物，檢擴(kuò)增完成后取出一定量的反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果：先進(jìn)行凝膠電泳，用溴化乙測(cè)擴(kuò)增結(jié)果：先進(jìn)行凝膠電泳，用溴化乙啶染色，紫外光下檢測(cè)結(jié)果啶染色，紫外光下檢測(cè)結(jié)果y=產(chǎn)物；產(chǎn)物；x=擴(kuò)增效率；擴(kuò)增效率；n循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)(1)nyx PCR技術(shù)十分靈敏，擴(kuò)展效率非常高，通?？杉夹g(shù)十分靈敏，擴(kuò)展效率非常高，通常可擴(kuò)增擴(kuò)增106倍，其擴(kuò)增產(chǎn)量可按下列公式計(jì)算。倍，其擴(kuò)增產(chǎn)量可按下列公式計(jì)算。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用-：（1）遺傳病和某些疑難病的診斷以及孕婦的產(chǎn)前檢查）遺傳病和某些疑難病的診斷以及孕婦的產(chǎn)前