1、血凝抑制（HI）試驗1 阿氏（Alsevers）液配制稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4保存?zhèn)溆谩? 10%和1%雞紅細胞液的制備2.1 采血 用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗證明體內無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約24mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。2.2 洗滌雞紅細胞 將離心管中的血液經(jīng)15001800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)15001800 r/m

2、in離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，再重復2次以上過程后，加入阿氏液20 mL，輕輕混合成紅細胞懸液，4保存?zhèn)溆茫怀^5天。2.3 10%雞紅細胞懸液 取阿氏液保存不超過5天的紅細胞，在錐形刻度離心管中離心15001800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準確觀察刻度離心管中紅細胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復吹吸使生理鹽水與紅細胞混合均勻。2.4 1%雞紅細胞液 取混合均勻的10%雞紅細胞懸液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混合均勻即可。3 抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）3.1 在微量反應板的1孔12孔均加入0.025mL PBS，

3、換滴頭。3.2 吸取0.025mL病毒懸液（如感染性雞胚尿囊液）加入第l孔，混勻。3.3 從第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。3.4 每孔再加入0.025mL PBS。3.5 每孔均加入0.025mL 體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）見附錄B。3.6 振蕩混勻，在室溫（2025）下靜置40min后觀察結果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下反應1小時）。對照孔紅細胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。3.7 結果判定 將板傾斜，觀察血凝板，判讀結果（見下表）。 表1：血

4、凝試驗結果判讀標準類別孔 底 所 見結果12345紅細胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細胞凝集紅細胞凝集基本同上，但孔底有大圈紅細胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊紅細胞于孔底形成小圓點，四周有少許凝集塊紅細胞于孔底呈小圓點，邊緣光滑整齊，即紅細胞完全不凝集+-能使紅細胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意對照孔應呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效。4 血凝抑制（HI）試驗（微量法）4.1 根據(jù)3的試驗結果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例

5、如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應是1:64（256除以4）。4.2 在微量反應板的1孔11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔內，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。4.4 1孔11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20）靜置至少30min。4.5 每孔加入0.025mL體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20，若環(huán)境溫度太高可置4條件下進行），對照紅細胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。4.6

6、結果判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結果才有效。HI價小于或等于21og2判定HI試驗陰性；HI價等于31og2為可疑，需重復試驗；HI價大于或等于41og2為陽性。正向間接血凝試驗（IHA）1 原理用已知血凝抗原檢測未知血清抗體的試驗，稱為正向間接血凝試驗（IHA）?？乖c其對應的抗體相遇，在一定條件下會形成抗原復合物，但這種復合物的分子團很小，肉眼看不見。若將抗原吸附（致敏）在經(jīng)過特殊處理的紅細胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的反應靈敏性。這種經(jīng)過口蹄疫純化抗原致敏的紅細胞與

7、口蹄疫抗體相遇，紅細胞便出現(xiàn)清晰可見的凝集現(xiàn)象。主要用于檢測O型口蹄疫免疫動物血清抗體效價。2 試驗器材和試劑2.1 96孔110V型醫(yī)用血凝板，與血凝板大小相同的玻板2.2 微量移液器（50L 25L）取液塑咀2.3 微量振蕩器2.4 O型口蹄疫血凝抗原2.5 O型口蹄疫陰性對照血清2.6 O型口蹄疫陽性對照血清2.7 稀釋液2.8 待檢血清（每頭約0.5ml血清即可）56水浴滅活30分鐘3 試驗方法3.1 加稀釋液在血凝板上16排的19孔；第7排的14孔第67孔；第8排的112孔各加稀釋液50L。3.2 稀釋待檢血清取1號待檢血清50L加入第1排第1孔，并將塑咀插入孔底，右手拇指輕壓彈簧1

8、-2次混勻（避免產生過多的氣泡），從該孔取出50L移入第2孔，混勻后取出50L移入第3 孔直至第9孔混勻后取出50L丟棄。此時第1排19孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)）依次為：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。 取2號待檢血清加入第2排；取3號待檢血清加入第3排均按上法稀釋，注意！每取一份血清時，必須更換吸頭一個。3.3 稀釋陰性對照血清 在血凝板的第7排第1孔加陰性血清50L，對倍稀釋至第4孔，混勻后從該孔取出50L丟棄。此時陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為1:2、1:4、1:8、1:16。第6-7孔為稀釋液對照。3.4 稀釋陽性對照血清在血凝板

9、的第8排第1孔加陽性血清50L，對倍數(shù)稀釋至第12孔，混勻后從該孔取出50L丟棄。此時陽性血清的稀釋倍數(shù)依次為1：21：4096。3.5 加血凝抗原被檢血清各孔、陰性對照血清各孔、陽性對照血清各孔、稀釋液對照孔均各加O型血凝抗原（充分搖勻，瓶底應無血球沉淀）25L。3.6 振蕩混勻將血凝板置于微量振蕩器上12分鐘，如無振蕩器，用手輕拍混勻亦可，然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現(xiàn)血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或37下靜置1.52小時判定結果，也可延至翌日判定。4.7 判定標準移去玻板，將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1:16孔，稀釋液對照孔，均應無凝集（血球全部沉入孔底

10、形成邊緣整齊的小圓點），或僅出現(xiàn)“+”凝集（血球大部沉于孔底，邊緣稍有少量血球懸?。?。陽性血清對照1:2-1:256各孔應出現(xiàn)“+”“+”凝集為合格（少量血球沉入孔底，大部血球懸浮于孔內）。在對照孔合格的前提下，再觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“+”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價。例如1號待檢血清15孔呈現(xiàn)“+”“+”凝集，67孔呈現(xiàn)“+”凝集，第8孔呈現(xiàn)“+”凝集，第9孔無凝集，那么就可判定該份血清的口蹄疫抗體效價為1:128。接種口蹄疫疫苗的豬群免疫抗體效價達到1:128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗體效價達到1:256（第8孔）呈現(xiàn)“+”凝集為免疫合格。4 檢測試劑的性狀、規(guī)格4.1 性

11、狀4.1.1 液體血凝抗原：搖勻呈棕紅色（或咖啡色），靜置后，血球逐漸沉入瓶底。4.1.2 陰性對照血清：淡黃色清亮稍帶粘性的液體。4.1.3 陽性對照血清：微紅或淡色稍混濁帶粘性的液體。4.1.4 稀釋液：淡黃或無色透明液體，低溫下放置，瓶底易析出少量結晶，在水浴中加溫后即可全溶，不影響使用。4.2 包裝4.2.1 液體血凝抗原：搖勻后即可使用，5ml/瓶。4.2.2 陰性血清：1ml/瓶，直接稀釋使用。4.2.3 陽性血清：1ml/瓶，直接稀釋使用。4.2.4 稀釋液：100 ml/瓶，直接使用，48保存。4.2.5 保存條件及保存期4.2.5.1 液體血凝抗原：48保存（切勿凍結），保存

12、期3個月。4.2.5.2 陰性對照血清：-15-20保存，有效期1年。4.2.5.3 陽性對照血清：-15-20保存，有效期1年。5 注意事項5.1 為使檢測獲得正確結果，請在檢測前仔細閱讀說明書。5.2 嚴重溶血或嚴重污染的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應。5.3 勿用90和130血凝板，嚴禁使用一次性血凝板，以免誤判結果。5.4 用過的血凝板應及時在水龍頭沖凈血球。再用蒸餾水或去離子水沖洗2次，甩干水份放37恒溫箱內干燥備用。檢測用具應煮沸消毒，37干燥備用。血凝板應浸泡在洗液中（濃硫酸與重鉻酸鉀按1：1混合），48小時撈出后清水沖凈。5.5 每次檢測只做一份陰性、陽性和稀釋液對照。

13、“-”表示完全不凝集或010%血球凝集。“+”表示1025%血球凝集 “+”表示75%血球凝集?！?”表示50%血球凝集 “+”表示90100%血球凝集。5.6 用不同批次的血凝抗原檢測同一份血清時，應事先用陽性血清準確測定各批次血凝抗原的效價，取抗原效價相同或相近的血凝抗原檢測待檢血清抗體水平的結果是基本一致的，如果血凝抗原效價差別很大用來檢測同一血清樣品，肯定會出現(xiàn)檢測結果不一致。5.7 收到本試劑盒時，應立即打開包裝，取出血凝抗原瓶，用力搖動，使粘附在瓶蓋上的紅細胞搖下，否則易出現(xiàn)沉渣，影響使用效果。布病虎紅平板凝集檢測標準操作規(guī)程1 基本原理血清平板凝集試驗是細菌性抗原與相應的抗體結合

14、后，在適量的電解質參與下，經(jīng)過一段時間出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。常采用已知的標準細菌性抗原液檢測相應的凝集抗體。2 樣品2.1 免疫牛血清(每頭約0.5ml血清即可)2.2 泌乳乳牛血清(每頭約0.5ml血清即可)2.3 受檢血清應新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和腐敗氣味。3 試劑與材料3.1 試劑3.1.1 布病虎紅平板凝集試驗抗原搖勻后即可使用，15ml/瓶， 410保存，有效期3年。3.1.2 布病虎紅平板凝集試驗陽性血清直接使用，1ml/瓶，010保存，有效期2年。3.1.3 布病虎紅平板凝集試驗陰性血清直接使用，1ml/瓶，410保存，有效期2年。3.2 材料3.2.1 玻璃板3.2.2

15、 移液器（TD 10l100l）及吸頭3.2.3 牙簽（供攪拌用）4 程序步驟4.1 使用前10min20min自冰箱中取出抗原、陽性血清及陰性血清，使其達到室溫。4.2 取出玻璃板，并將其畫分成若干個4cm2小格。4.3 在玻璃板上各格標記受檢血清號及陰陽行血清對照。4.4 用移液器吸取陰陽性對照血清各0.03 ml，垂直滴于玻璃板上標記好的小格 中。4.5 用移液器吸取待檢血清1滴（相當于0.03 ml），垂直滴于玻璃板上。4.6 在待檢血清旁滴加搖勻后的抗原1滴（相當于0.03 ml）。4.7 用牙簽攪動抗原與待檢血清使其充分混合均勻。4.8 4min內觀察并記錄結果。5 參考區(qū)間（參考

16、值范圍）在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。6 結果判定被檢血清在4min內出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，均呈粉紅色者判為陰性（-）。7 安全防護措施試驗過程中檢驗人員應穿好防護服，帶好手套及口罩。8 注意事項8.1 被檢血清應新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。8.2 每批試驗應設陽性血清與陰性血清對照。雞白痢全血（血清）平板凝集檢測標準操作規(guī)程1 基本原理 血清平板凝集試驗是細菌性抗原與相應的抗體結合后，在適量的電解質參與下，經(jīng)過一段時間出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。常采用已知的標準細菌性抗原液檢測相應的凝集抗體。2 樣品2.1 成年活雞(現(xiàn)采全血)

17、2.2 成年雞血清3 試劑與材料3.1試劑3.1.1 雞白痢多價染色平板抗原、強陽性血清（500 IU/ml）、弱陽性血清(10 IU/ml)和陰性血清雞白痢多價染色平板抗原、陽性血清及陰性血清于28避光保存，有效期1年。3.2 材料3.2.1 玻璃板3.2.2 移液器（TD 10l100l）及吸頭3.2.3 金屬絲環(huán)(內徑7.5mm8.0mm)3.2.4 反應盒3.2.5 酒精燈3.2.6 針頭3.2.7 消毒盤3.2.8 酒精棉4 程序步驟4.1 使用前10min20min自冰箱中取出抗原、陽性血清及陰性血清，使其達到室溫。4.2 在2025環(huán)境條件下，用移液器吸取充分混合的抗原1滴（相當

18、于0.05 ml），垂直滴于玻璃板上。4.3 用針頭刺破雞的翅靜脈或冠尖取血0.05 ml(相當于內徑7.5mm8.0mm金屬絲環(huán)的兩滿環(huán)血液)。4.4 若樣品為血清，則用移液器吸取與抗原等量的血清（相當于0.05 ml）。4.5 將抗原與血液（血清）充分混合均勻，并使其散開至直徑為2cm。4.6 每次試驗設強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清對照。4.7 不斷搖動玻璃板，2min內觀察結果。4.8 記錄結果。5 參考區(qū)間（參考值范圍）在2min內，抗原與強陽性血清應呈100%凝集（+），弱陽性血清應呈50%凝集（+），陰性血清不凝集（-），判試驗有效。在2min內，被檢全血與抗原出現(xiàn)50%（+）

19、以上凝集者為陽性，不發(fā)生凝集則為陰性，介于兩者之間為可疑反應，將可疑雞隔離飼養(yǎng)1個月后，再作檢疫，若仍為可疑反應，按陽性反應判定。6 結果判定類別平板所見結果判定123出現(xiàn)大的凝集塊，底質清涼，即100%凝集出現(xiàn)明顯凝集塊，底質稍有混濁，即75%凝集出現(xiàn)可見的凝集顆粒，底質混濁，即50%凝集+陽性4底質極混濁，出現(xiàn)輕微可見的微細顆粒，即25%凝集+可疑5底質均勻一致極混濁，無凝集現(xiàn)象，即不凝集-陰性7 安全防護措施 試驗過程中檢驗人員應穿好防護服，帶好手套及口罩。8 注意事項8.1 試驗應在2025環(huán)境條件下進行。8.2 每批試驗應設陽性血清與陰性血清對照。 細菌培養(yǎng)技術1 無菌操作技術的基本

20、要求 1.1 臨床細菌檢驗的所有操作，均必須在無菌條件下進行，即在酒精燈火焰附近或在超凈工作臺內進行。 1.2 由臨床標本或培養(yǎng)物中取材作檢查時，必須使用接種環(huán)（針），使用前后均需火焰滅菌。 1.3 從培養(yǎng)瓶或試管培養(yǎng)物中取標本時，在打開瓶口、試管口或關閉前，均要在火焰上通過12次，瓶塞或試管塞用無名指及小指夾住，操作完畢后塞回。 1.4 不慎打破培養(yǎng)物瓶（管）時，應報告負責人后，用0.2%消毒靈處理污染的臺面或至少覆蓋30分鐘。打破的器皿集于容器內高壓滅菌，臺面及地面再進一步消毒清洗。 1.5 工作完畢后，實驗臺用0.2%消毒靈擦拭，雙手用0.2%消毒靈浸泡，再用肥皂和清水刷洗干凈。2 器材

21、酒精燈、95%酒精、接種環(huán)（針）、培養(yǎng)皿（瓶）、燭缸、火柴等。 3 接種方法 3.1 平板接種法：平板劃線接種是細菌分離培養(yǎng)的常用技術，主要使標本或培養(yǎng)物中的混合細菌能在培養(yǎng)基表面分散生長形成單個菌落。 3.2 曲線劃線分離法：接種環(huán)菌滅后挑取標本或菌液少許呈45度角，在平板1/5處輕輕涂布，然后左右來回以曲線形成劃線接種，倒置37溫箱內培養(yǎng)24h后觀察結果。 3.3 分區(qū)劃線分離法：接種環(huán)于平板內分劃五區(qū)，每劃完一個區(qū)域燒灼環(huán)一次后倒置3537培養(yǎng)。 3.4 穿刺接種法：多用于保存菌種觀察動力及做厭氧培養(yǎng)，亦可用于觀察細菌對糖類的分解反應，培養(yǎng)基為半固體。 方法： 左手持細菌培養(yǎng)物。 右手持接種針酒精燈上燒灼，冷卻后挑取細菌。 左手持半固定培養(yǎng)基，右手小指夾住棉塞并取下，管口火焰滅菌，將接種針插入培養(yǎng)基中央，穿刺近底部1/3處，再沿原穿刺線抽出在斜面上做連續(xù)曲線接種。 試管口在火焰上充分滅菌，塞棉塞，滅菌接種針。 接種后的半固體培養(yǎng)基，置試管架上，3537孵育箱培養(yǎng) 4 培養(yǎng)方法 4.1 一般培養(yǎng)法（又稱需氧培養(yǎng)法）：將已接種好的平板、斜面和液體培養(yǎng)基等，置3537孵育箱中1824h，難以生長者培養(yǎng)27天甚至半個月。4.2 二氧化碳培養(yǎng)法：將某些細菌如腦膜炎球菌，嗜血桿菌等置于CO2環(huán)境中進行培養(yǎng)。 我室采用燭缸法：將已接種過的平板，置于有蓋的干燥玻