1、mTOR信號通路與腫瘤的研究進(jìn)展         11-01-07 09:27:00     作者：鄭鵬生, 冀靜    編輯：studa20【摘要】  哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長、增殖、分化、細(xì)胞周期調(diào)控等多個方面起到重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)mTOR相關(guān)的信號通路復(fù)雜且涉及面廣泛，其中多個元素的調(diào)控異常都與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)

2、。mTOR抑制劑能夠抑制由于該信號通路異常引起的癌基因的轉(zhuǎn)化、腫瘤的生長和腫瘤血管生成。到目前為止，4種mTOR抑制劑被有效地應(yīng)用于臨床，有的已進(jìn)入、期臨床試驗。因此，對mTOR信號通路的深入研究對腫瘤的靶向性治療具有重要意義。 【關(guān)鍵詞】  mTOR信號通路；雷帕霉素；mTOR抑制劑；腫瘤治療        ChinaABSTRACT: Mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine protein kinase that is ce

3、ntrally involved in the control of cell growth, proliferation, differentiation and cell cycle regulation. Recent studies have found that the mTOR pathway is complicated and the dysregulation of mTOR pathway is recognized to be associated with lots of tumors. Several inhibitors of mTOR could inhibit

4、oncogene transformation, growth and angiogenesis of tumors. So far, four inhibitors of mTOR have been tested in clinical trials, and some have been accessed to phase or trial. Therefore, in this review, we discuss the regulators that govern mTOR pathway activity, and highlight clinical results obtai

5、ned with the first generation of mTOR inhibitors to reach the oncology clinics.KEY WORDS: mTOR signaling pathway; rapamycin; mTOR inhibitor; tumor therapy哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，從酵母到哺乳動物其廣泛存在，且進(jìn)化十分保守。mTOR是1991年HEITMAN等在分析不同啤酒酵母突變體對雷帕霉素抵抗作用的差別時發(fā)現(xiàn)的1。mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶

6、相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase, PIKK)蛋白家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、調(diào)控細(xì)胞周期等多個方面起到重要作用。目前發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路的過度活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤治療的一個重要靶點。因此本文就mTOR信號通路與腫瘤的關(guān)系及治療作一綜述。1  mTOR的結(jié)構(gòu)1.1  mTOR的分子結(jié)構(gòu) 人的mTOR基因位于1p36.2上，其mRNA翻譯后的蛋白質(zhì)有2549個氨基酸殘基，其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子質(zhì)量為289ku。mTOR的結(jié)構(gòu)域從氨基端到羧基端依次為HEAT重復(fù)序列(即Huntignto

7、n、EF3、PP2A一個亞基、TOR1)、FAT結(jié)構(gòu)域、FRB激酶結(jié)構(gòu)域、NRD及FATC結(jié)構(gòu)域(圖1)。mTOR的N端有20個重復(fù)的HEAT序列，每個HEAT大約由40個氨基酸殘基組成2個螺旋，每個螺旋都有一個親水基團(tuán)和一個疏水基團(tuán)。這些重復(fù)的HEAT模體介導(dǎo)了蛋白質(zhì)間的相互作用2?？拷黰TOR的C端有一個激酶結(jié)構(gòu)域，約234個氨基酸殘基，其結(jié)構(gòu)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的催化域相似，是mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族的重要原因之一。緊挨著激酶結(jié)構(gòu)域上游的是FRB(FKBP12-rapamycin binding)結(jié)構(gòu)域，它是FKBP12-rapamycin復(fù)合物的結(jié)合位點，在雷帕霉

8、素特異性抑制mTOR中起著連接作用：雷帕霉素可與細(xì)胞內(nèi)的受體FKBP12結(jié)合形成FKBP-rapamycin復(fù)合物，再與mTOR的FRB區(qū)相結(jié)合，從而抑制mTOR的激酶活性3。FRB激酶結(jié)構(gòu)域的上游是一個相對較大的FAT(focal adhesion targeting domain)結(jié)構(gòu)域，約568個氨基酸殘基，同樣在mTOR的C端最后也有一個FAT結(jié)構(gòu)域，即FATC(focal adhesion targeting domain of C-ternimal)結(jié)構(gòu)域。它們在空間上形成特殊的構(gòu)象以暴露出mTOR的激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)。FATC結(jié)構(gòu)域在mTOR活性穩(wěn)定上起著關(guān)鍵的作用，研究表明該結(jié)構(gòu)域內(nèi)

9、一個氨基酸的缺失都能使mTOR活性喪失4。NRD(negative regulatory domain)結(jié)構(gòu)域位于激酶催化域和FATC結(jié)構(gòu)域中間，是mTOR負(fù)性調(diào)節(jié)域。1.2  mTOR的存在形式 mTOR在生物體以兩種復(fù)合物的形式存在，即mTORC1及mTORC2。mTORC1包括mTOR、mLST8(mammalian ortholog of LST8，又名GL)和raptor (regulatory-associated protein of mTOR)；mTORC2包括mTOR、mLST8、mSIN1 (mitogen-activated protein kinas

10、e-associated protein 1)及rictor (rapamycin insensitive companion of mTOR)。研究表明，雷帕霉素主要通過與細(xì)胞內(nèi)受體FKBP12結(jié)合而抑制mTORC1，但是對mTORC2無作用。目前研究較多的是mTORC1復(fù)合物。raptor分子結(jié)構(gòu)相對保守，分子質(zhì)量為150ku，所有raptor家族成員都在N-端有一段保守區(qū)及3個HEAT重復(fù)序列，mTOR分子N-端的重復(fù)序列使得它與raptor結(jié)合緊密，而C-端與raptor結(jié)合較疏松5。如圖2所示，raptor是一種橋梁分子，它可以將mTOR與下游的靶分子如P70S6K、4EBP1連接起

11、來。但是，在營養(yǎng)素等上游因子不存在時，mLST8將mTOR、raptor緊密地鎖在一起，使得mTOR不能與其下游的靶基因結(jié)合；當(dāng)營養(yǎng)素存在情況下，這一復(fù)合物發(fā)生空間構(gòu)象改變，使得mLST8和raptor之間的結(jié)合斷裂，暴露出mTOR，從而使其下游靶基因結(jié)合于raptor上6。對mTORC2復(fù)合物研究不多，目前認(rèn)為它可以通過磷酸化蛋白激酶C-(PKC-)通路來調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架7。2  mTOR信號傳導(dǎo)途徑2.1  mTOR的上游信號傳導(dǎo)途徑 mTOR可對細(xì)胞外包括生長因子、胰島素、營養(yǎng)素、氨基酸、葡萄糖等多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答。它主要通過PI3K/Akt/mTOR途徑

12、來實現(xiàn)對細(xì)胞生長、細(xì)胞周期等多種生理功能的調(diào)控作用。2.1.1  經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑PI3K/Akt/mTOR信號通路 PI3K可被激活的Ras通路以及一些生長因子及細(xì)胞因子激活，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、血小板源性生長因子、集落刺激因子等8。如圖3所示，這些細(xì)胞外生長因子配體與跨膜的酪氨酸激酶受體如胰島素受體(IR)結(jié)合后，IR的多個酪氨酸殘基被磷酸化而激活；活化的IR通過磷酸化其底物蛋白來招募PI3K的p85亞基，并把信號傳遞給p110亞基，導(dǎo)致PI3K的激活；活化的PI3K催化PI-4-P與PI-4，5-P2的3

13、位磷酸化而生成PI-3，4-P2與PI-3，4，5-P3后，后兩者仍然在細(xì)胞膜上，召集下游分子Akt到細(xì)胞膜上。PI-3，4，5-P3可以激活磷脂酰肌醇依賴性激酶-1(PDK-1)，從而使Akt的308位的Thr磷酸化，在PDK-2的存在下，其473位的Ser再被磷酸化從而使Akt完全被激活。    正常情況下，結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚體復(fù)合物，是小GTP酶Rheb(Ras-homolog enriched in brain)的抑制劑，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情況下抑制mTOR的功能

14、。當(dāng)Akt活化后，它可磷酸化TSC-2的Ser939和Thr1462，抑制了TSC-1/TSC-2復(fù)合物的形成，從而解除了對Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活9。    在整個PI3K/Akt/mTOR信號通路中，有一條十分重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑就是10號染色體上缺失與張力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)。PTEN是一個腫瘤抑制基因，位于人染色體10q23。它有一個蛋白酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域，在這條通路中可以將PI-3，4-P2與PI-3，4，5-P3去

15、磷酸化，從而負(fù)調(diào)節(jié)PI3K下游AKt/mTOR信號通路的活性10。2.1.2  非依賴PI3K/Akt途徑 越來越多的研究發(fā)現(xiàn)AMPK(AMP-activated protein kinase A)與mTOR的活性調(diào)節(jié)有關(guān)。有研究表明在哺乳動物細(xì)胞系中，氨基酸的代謝調(diào)節(jié)不是通過PI3K/Akt/mTOR通路來實現(xiàn)的，而是直接通過LKB1/AMPK/mTOR通路來調(diào)節(jié)。在細(xì)胞中，當(dāng)ATP/ADP比率下降時，AMP的水平變化比ATP的變化更為敏感。AMPK的活性則對于細(xì)胞內(nèi)AMP水平非常細(xì)微的變化都能很快察覺到11。在缺乏能量的細(xì)胞內(nèi)，AMPK可以直接磷酸化并提高TSC-2的活

16、性，促進(jìn)TSC-1/TSC-2復(fù)合物形成，抑制Rheb酶活性，從而間接抑制mTORC1通路的活性12。AMPK在能量壓力下還可以直接磷酸化mTORC113。2.2  mTOR的下游信號傳導(dǎo)途徑 活化的mTOR通過磷酸化蛋白翻譯過程中的某些因子來參與多項細(xì)胞功能，其中最主要的是4EBP1和P70S6K。    4EBP1：4EBP1(eIF4E-binding protein1)的mRNA中含有從DNA中轉(zhuǎn)錄得到的遺傳信息，是蛋白質(zhì)生物合成的模板。在真核生物蛋白質(zhì)合成的起始階段，由于5端mRNA的特殊帽狀結(jié)構(gòu)，核糖體不能直接與mRNA相結(jié)合，而是

17、需要翻譯起始因子的幫助。eIF-4E又稱為帽結(jié)合蛋白(cap-binding protein, CBP)，它與mRNA的5帽結(jié)構(gòu)結(jié)合后再與eIF-4G結(jié)合，eIF-4G作為一種支架蛋白募集eIF-4A形成三聚體復(fù)合物eIF-4F，而此復(fù)合物可以使核糖體結(jié)合到mRNA上從而起始蛋白質(zhì)的翻譯。4EBP1有同eIF-4G相似的eIF-4E識別序列，故4EBP1、eIF-4G與eIF-4E的結(jié)合存在部分重疊，4EBP1可以通過競爭性抑制eIF-4G與eIF-4E的結(jié)合來達(dá)到抑制翻譯起始的作用。mTOR信號通路通過磷酸化4EBP1，使eIF-4E與其解離并活化，促使翻譯起始復(fù)合物的形成，從而加速蛋白質(zhì)的

18、合成(圖4)。4EBP1與eIF-4E的解離，在活化一些位于5-UTR(5-untranslated terminal region)區(qū)特殊的調(diào)控元件起著重要的作用，如c-myc, cyclin D1以及鳥氨酸脫羧酶。相反，當(dāng)生長因子或營養(yǎng)素缺乏，或者有mTOR抑制物存在時，4EBP1去磷酸化，并與eIF-4E結(jié)合從而抑制翻譯起始14。3  mTOR信號通路與腫瘤的關(guān)系    近年來，很多關(guān)于雷帕霉素及其衍生物如CCI-779、RAD-001的作用研究，向我們展示了mTOR信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。與腫瘤密切相關(guān)的多項細(xì)胞功能如細(xì)胞增殖、細(xì)

19、胞周期、蛋白合成、細(xì)胞遷移等均受控于mTOR的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌中都有mTOR信號通路的調(diào)節(jié)異常。3.1  PI3K/Akt/mTOR通路的過度激活PI3K/Akt/mTOR信號通路活化與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，它能夠加速細(xì)胞周期、減少細(xì)胞凋亡、并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，這在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有報道16-18?；罨腜I3K可激活下游的Akt，激活的Akt使腫瘤細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)耐受、細(xì)胞生長代謝異常增加。過度活化的Akt激活其下游的底物，包括糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)、6-磷酸果糖激酶-2、BA

20、D蛋白、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、mTOR、遺傳性乳腺癌與卵巢癌易感基因(hereditary breast and ovarian cancer susceptibility gene, BRCA1)，其中激活的靶蛋白mTOR可以引起腫瘤細(xì)胞的快速增殖、癌蛋白分泌增加、細(xì)胞周期加快、G1期時程縮短，利于腫瘤的迅速發(fā)生發(fā)展19。在這條信號通路中，如前所述，PI3K可以被Ras信號、或者直接被一些生長因子所激活；PI3K的催化亞基p110的異常擴增及突變亦出現(xiàn)在多種人類腫瘤中。Akt可被多條途徑激活，尤其是PTEN基因的突變或缺失，這在前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、膠質(zhì)瘤和黑色素瘤中發(fā)生率最高20。在1/3的

21、上皮性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了原癌基因Ras可激活A(yù)kt通路21；在很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)了活化的受體酪氨酸激酶可以激活A(yù)kt，可能是通過異二聚體ErbB-2/ErbB-3激活PI3K途徑來完成22。見表1。表1  腫瘤組織中PI3K/Akt/mTOR通路的過度激活（略）3.2  PTEN功能的缺失 自從PTEN發(fā)現(xiàn)以來，至今已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)存在著PTEN的改變。腫瘤細(xì)胞中PTEN改變的主要形式之一是突變，包括插入、丟失、替換、移碼突變、RNA異常拼接和蛋白截短等，其最常見的突變發(fā)生于外顯子3、5、8。PTEN的另一種改變形式是5啟動子區(qū)的CpG島甲基化。在PI3K/Akt/mTO

22、R信號通路中，PTEN的功能缺失使其對PI3K的抑制作用解除，從而激活了Akt/mTOR等下游信號通路。3.2.1  PTEN的先天性遺傳突變 PTEN在36%66%的子宮內(nèi)膜癌中有突變，這在腫瘤中是突變率最高的，同時伴隨Akt的高磷酸化33。SOLIMAN等34人在99例進(jìn)展期子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本中分析PTEN、磷酸化的Akt(p-Akt)、Ki-67(細(xì)胞增殖的一種標(biāo)記)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)66%的標(biāo)本不表達(dá)或低表達(dá)PTEN，同時有40%的腫瘤高表達(dá)p-Akt。PTEN的低表達(dá)與p-Akt的高表達(dá)顯著相關(guān)。另外，該研究發(fā)現(xiàn)PTEN(+)和p-Akt(-)的患者擁有更高的生存率。p-A

23、KT(-)使得Ki-67的表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)低水平Ki-67的患者預(yù)后相對較好，也許能部分解釋該現(xiàn)象。有趣的是，在子宮內(nèi)膜非典型增生里PTEN的突變率亦高達(dá)20%30%。臨床上使用口服黃體酮治療子宮內(nèi)膜非典型增生，但是只有30%50%病例有效。在對黃體酮治療無反應(yīng)的患者中發(fā)現(xiàn)有升高的或持續(xù)的p-mTOR表達(dá)存在。另外，MUTTER等35研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜腺癌中PTEN突變率為83%，癌前病變中達(dá)55%，而正常子宮內(nèi)膜中沒有PTEN突變；同時在富含雌激素的子宮內(nèi)膜的上皮組織中的PTEN蛋白的表達(dá)缺失。這種激素和特殊的基因間的相互作用可能是導(dǎo)致癌前病變和癌發(fā)展的一個重要因素。以上所述均表明PTEN突

24、變是子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生的早發(fā)事件，且PTEN失活可能加速復(fù)雜性增生過長內(nèi)膜發(fā)展為癌。    30%40%的膠質(zhì)瘤中存在PTEN的突變、純合子缺失及不表達(dá)。PTEN的失活與p-Akt、p-mTOR、p-S6K1的增加有關(guān)。CHAKRAVARTI等36在92例膠質(zhì)瘤患者中研究發(fā)現(xiàn)，p-PI3K、p-Akt、p-S6K1同caspase3的水平相反，表明活化的PI3K通路抑制凋亡。更重要的是，PI3K/Akt/mTOR通路的激活與膠質(zhì)瘤的惡性程度增高和患者的生存率下降有關(guān)。    Cowden病又稱多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征，是一種常染色體顯性遺傳病

25、，以累及所有三胚層分化組織的多器官、多發(fā)性錯構(gòu)瘤，同時存在乳腺癌及甲狀腺癌高發(fā)病風(fēng)險，及伴有PTEN的體細(xì)胞突變?yōu)樘卣?。Cowden的先癥者中有80%有PTEN基因種系突變，大約2/3發(fā)生在外顯子5、7、8。盡管散發(fā)的甲狀腺癌中少有PTEN的體細(xì)胞突變，在20%60%的甲狀腺惡性腫瘤中存在10q23雜合子丟失，并且發(fā)生惡性侵襲性組織類別腫瘤的風(fēng)險更高。例如，在87例散發(fā)甲狀腺腫瘤(14例未分化癌、37例濾泡性癌、21例非典型性腺瘤、15例普通腺癌)中有6例標(biāo)本存在PTEN的mRNA完全缺失，其中4例都是未分化癌37。3.2.2  PTEN的后天修飾作用  除了先天因素如激酶

26、區(qū)遺傳性突變等引起PTEN的功能改變以外，后天修飾如甲基化、與DNA病毒癌基因產(chǎn)物結(jié)合而失活等，也會導(dǎo)致PTEN功能的下降甚至喪失。PTEN啟動子的活性在過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子早期生長應(yīng)答蛋白(transcription factor early growth response protein 1, EGR1)時增加37。同樣，使用甲狀腺細(xì)胞系及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系進(jìn)行亞臨床研究表明，PTEN基因表達(dá)沉默與EGR1的mRNA缺失相關(guān)38。在人類各種腫瘤中，24%74%腫瘤缺失PTEN蛋白的表達(dá)，這可能與EGR1沉默了PTEN的啟動子有關(guān)。    在宮頸癌中，PTEN突變在早

27、期腫瘤中發(fā)生較少，但是在進(jìn)展期腫瘤中發(fā)生率明顯增加，尤其是放療后的腫瘤。相反，PTEN基因的后天修飾作用，不論是因為雜合性丟失還是啟動子區(qū)的甲基化，在早期宮頸癌包括宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)到進(jìn)展期腫瘤中都有很多報道38。CHENG等23對62例宮頸鱗癌研究，使用單核苷酸多態(tài)性分析表明沒有PTEN的突變，僅有8例存在雜合性丟失；但是4/10例CIN病例及36/62例宮頸癌病例存在PTEN啟動子區(qū)甲基化。PTEN的功能喪失與其啟動子區(qū)的甲基化有關(guān)。該研究表明PTEN啟動子區(qū)甲基化與患者的年齡、腫瘤分期及分級無關(guān)，但與預(yù)后有關(guān)，

28、存在PTEN啟動子區(qū)甲基化患者預(yù)后明顯較差。多變量回歸分析模型證實，在控制患者的年齡、病理分級及臨床分期后，PTEN是無瘤生存率的一個重要指標(biāo)。    在胃癌中，KANG等39對310例病例研究發(fā)現(xiàn)，有62(20%)例胃癌低表達(dá)PTEN。PTEN的低表達(dá)與腫瘤生長大小及深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分級、臨床分期、患者的生存時間顯著相關(guān)。另外，他們在66例病例中發(fā)現(xiàn)有26例存在PTEN啟動子區(qū)的甲基化，其中的19/26例存在PTEN的低表達(dá)。該研究表明PTEN的低表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并且這一低表達(dá)與其啟動子區(qū)甲基化有關(guān)。4  mTOR與腫瘤治療4.1  mTOR抑制劑 到現(xiàn)在為止，已有4種mTOR抑制劑被有效地應(yīng)用于臨床，它們是標(biāo)準(zhǔn)的mTOR抑制劑雷帕霉素和3種雷帕霉素的衍生物：CCI-779、RAD001和AP23573。這3種衍生物都在細(xì)胞內(nèi)與FKBP12形成復(fù)合物而發(fā)揮作用。到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)其他的蛋白