1、動物血中超氧化物歧化酶的提取及活力測定目的學會從動物血中提取超氧化物歧化酶SOD。掌握用鄰苯三酚法測定超氧化物歧化酶SOD活性的原理及方法。原理 超氧化物歧化酶別名肝蛋白、奧谷蛋白，簡稱：SOD。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標；現(xiàn)已證實，由氧自由基引發(fā)的疾病多達60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成；因此，

2、生物抗氧化機制中SOD的地位越來越重要！目前，研究開發(fā)最多的資源還是從動物血液、動物組織中制備提純SOD。在一般情況下，SOD酶活性測定只能應用間接活性測定法。鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2 -，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應開始后反應液先變成黃棕色，幾分鐘后轉綠，幾小時后又轉變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時間成線性關系，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長出有強烈光吸收。當有SOD存在時，由于它能催化O2 -與H+結合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此

3、，通過計算即可求出SOD的酶活性。酶活力單位定義：在25恒溫條件下，每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。1、試劑（1）3.8%（質(zhì)量分數(shù)）檸檬酸三鈉 （2）0.9%（質(zhì)量分數(shù)）氯化鈉 （3）95%（體積分數(shù)）乙醇 （4）氯仿 （5）丙酮 （6）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 稱取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右，用HCl調(diào)節(jié)pH =8.20（用pH計校正），最后定容至100mL。 （7）10mmol/L HCl （8）50 mmol/L鄰苯三酚 稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L

4、HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 2、器材 （1）豬血 （2）恒溫水浴 、冰浴器（3）離心機 （4）燒杯、量筒、攪棒 （5）紫外分光光度計 （6）試管、刻度吸管、微量注射器 方法和步驟    1、從豬血中提取SOD （1）分離血球  取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1，輕輕攪拌均勻，4 000r/min離心20min，收集紅血球。原理：加入檸檬酸三鈉作為抗凝血劑使用，通過離心機離心，從豬血中分離出紅細胞。（2）除血紅蛋白 紅血球用3倍體積生理鹽水洗滌，4 000r/min離心20mi

5、n，重復三次，然后向洗凈的紅血球加入11.1倍體積去離子水，攪拌溶血30min，再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預冷95%乙醇和0.15倍體積的預冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h，然后 4 000r/min離心20min除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過濾，收集濾液原理：利用95%乙醇洗掉DNA，用氯仿抽提血紅蛋白等雜蛋白，再通過離心作用進行分離。（3）熱變性 上清液加熱到65，保溫10min，然后迅速冷卻到室溫，3 000r/min離心20min，棄去沉淀物，收集上清液原理：利用熱變性原理，在隨溫度的升高和實驗操作時間的延長，酶的活性和雜蛋白的含量均呈現(xiàn)下降

6、趨勢，從比活性上講豬血中的SOD在5565。變性時間為1526min最適宜，酶純度最高。（引自華東師范大學學報，2002年9月，第36卷第3期，溫度對豬血提取超氧化物歧化酶的影響）（4）沉淀 清液在鹽冰浴中冷卻，然后在-5以下的操作溫度下，加入1.5倍量預冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，即有白色沉淀產(chǎn)生，靜置23min，迅速抽濾，棄去濾液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸餾水溶解，4 000r/min離心20min，除去不溶物，即得粗SOD溶液。原理：利用丙酮作為有機溶劑除雜，離心去沉淀。2、鄰苯三酚自氧化速率的測定 取兩支試管按下表加入25預熱過的緩沖液,然后加入預熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。試劑空白管（ml）自氧化管（ml）Ph8.2、50mmol/LTris-HCL3310mmol/L HCl0.10.0550mmol/L鄰苯三酚-0.053、SOD樣液的活性測定樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。其