1、報(bào)告成績(jī) 實(shí)時(shí)記錄成績(jī)實(shí)驗(yàn)二Feulgen反應(yīng)顯示DNA學(xué)生姓名 學(xué)號(hào)班級(jí)座位號(hào)： 同組同學(xué)日期：2014年10月14日備注：Introduction 常用DNA定性和定量分析的方法及原理：(1) Feulgen反應(yīng)：DNAg酸水解后，分子中的喋吟和脫氧核糖連接的配糖鍵被打開，脫氧核糖的一端釋放出游離的醛基，并在原位與Schiff試劑反應(yīng)形成特異性的紫紅色產(chǎn)物。(2) 甲基綠-派洛寧法：甲基綠-派洛寧為堿性染料， 分別與細(xì)胞內(nèi)的 DNA RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。 甲基綠與染色質(zhì)中 DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；派洛寧與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅 色。(3) HE染色：即蘇木精-伊

2、紅染色法。蘇木精染液為堿性，使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖 體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。(4) Giemsa染色：含天青、伊紅等，可與 DNA±的磷酸基團(tuán)結(jié)合，使染色體呈藍(lán)紫色，而細(xì)胞質(zhì) 呈淡藍(lán)色。(5) 免疫熒光技術(shù)：將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒 光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的黃綠色或桔紅色熒光，從而確定抗原或抗體的定位，測(cè)定含量。(6) 顯微光度術(shù)：利用顯微分光光度計(jì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)原有能發(fā)光的物質(zhì)或?qū)?xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分用不 同的熒光經(jīng)熒光探針標(biāo)記后進(jìn)行定位、定性和定量地測(cè)定。(7) 流式細(xì)胞術(shù)：在細(xì)胞分子水

3、平上對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多快速的定量分析，可以高 速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)。Materials & methods 實(shí)驗(yàn)材料：四膜蟲培養(yǎng)液（2006）； Carnoy固定液；Schiff試齊J; 1mol/L HCl ;自來(lái)水；亮綠溶液；擦鏡 紙/蓋玻片；載玻片/鐐子；記號(hào)筆；小片濾紙；移液器/吸頭；香柏油/二甲苯；恒溫水浴鍋兩臺(tái)（60C）, 恒溫培養(yǎng)箱一臺(tái)（30C）。實(shí)驗(yàn)操作：吸取少量四膜蟲培養(yǎng)液于載玻片一干燥一用卡諾固定液固定10到20分鐘一在鹽酸內(nèi)水浴 15分鐘左右一用Schiff試劑染色40分鐘（要避光、30度恒溫）一自來(lái)水清洗 2次一亮綠溶液

4、復(fù)染 1到2秒 鐘一再次水洗一干燥一放在顯微鏡下觀察。Real-time Record 實(shí)時(shí)記錄草稿請(qǐng)見附錄。流程具體步驟備注1制片移液器吸取10 pl四膜蟲培養(yǎng)液，反復(fù)混勻幾次，滴于干凈的載玻片的一側(cè)，涂成直徑約1cm的圓。標(biāo)記載玻片。制作4個(gè)對(duì)照。置于30c恒溫箱中干燥 10-15分鐘。在玻片一角做不對(duì)稱圖案記號(hào)2固定將標(biāo)本片置于 Carnoy固定液中固定1020分鐘，吸去玻片背面的液體如果記號(hào)被抹去了要補(bǔ)上3酸解實(shí)驗(yàn)組：放入1mol/L鹽酸中，60c水浴15分鐘對(duì)口1:置于空氣中，不經(jīng)鹽酸處理。對(duì)口2. 2：置于1mol/L鹽酸中，室溫15分鐘。兩組合做，每組兩個(gè)對(duì)照片對(duì)口3:放入1mo

5、l/L鹽酸中，60c水浴10分鐘。對(duì)口4:放入1mol/L鹽酸中，60c水浴20分鐘。4染色將所有標(biāo)本片同時(shí)放入 Schiff氏液中作用40分鐘（30C恒溫箱；避光）可背貼背放置5清洗將所有標(biāo)本片迅速?gòu)腟chiff 試劑中提出放入自來(lái)水中浸泡1分鐘，重復(fù)2次動(dòng)作要快防止殘留的無(wú)色品紅被氧化成有色品紅，引起假陽(yáng)性6復(fù)染將標(biāo)本片放入亮綠水溶液復(fù)染12秒鐘；將標(biāo)本片在干凈的自來(lái)水浸泡，濾紙吸去玻片背面和兩側(cè)的水分并在空氣中干燥將載玻片浸入亮綠溶液后隨即提出，一張張依次復(fù)染7鏡檢選才i 40X鏡繪制12個(gè)細(xì)胞并上傳12張圖片標(biāo)本徹底干燥后方可觀察Results 40倍物鏡下可觀察到實(shí)驗(yàn)組的四膜蟲細(xì)胞核

6、染上了紅紫色，而細(xì)胞質(zhì)為綠色。生物繪圖請(qǐng)見附錄。Discussion 1 .討論實(shí)驗(yàn)為何出現(xiàn)所得結(jié)果。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，請(qǐng)分析是何原因如何改進(jìn)答：由于時(shí)間比較緊，我們簡(jiǎn)單設(shè)置了 60c下三個(gè)不同時(shí)間的組別， 但是這樣的話差別比較小。 應(yīng)該設(shè)置不同溫度的對(duì)照，因?yàn)樗崴馐潜緦?shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，溫度必須保持在60±5C之間，改動(dòng)溫度的話就能得到比較鮮明的對(duì)比了。實(shí)驗(yàn)組別細(xì)胞核顏色細(xì)胞質(zhì)顏色原因分析紅色實(shí)驗(yàn)組0 （鹽酸綠色細(xì)胞核染成粉紅色至紫紅色，經(jīng)亮綠處理的細(xì)胞的細(xì)60 c 15min)胞質(zhì)顯綠色。對(duì)照組1（空氣綠色綠色DN股有被酸水解，細(xì)胞核顯示出被鳧綠染上的綠色， 二|室溫15min

7、)無(wú)紅色出現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)顯綠色。對(duì)照組2 （鹽酸淺紅綠色溫度過(guò)低，DN冰解不夠徹底，醛基暴露不充分，染色室溫15min)過(guò)淺。細(xì)胞質(zhì)顯綠色。對(duì)照組3 （鹽酸淺紅綠色時(shí)間過(guò)短，DN冰解不夠徹底，醛基暴露不充分，細(xì)胞60C10min)核染色過(guò)淺。對(duì)照組4 （鹽酸淺紅綠色時(shí)間過(guò)久，造成DN冰解過(guò)度，游離的核甘酸漂移到細(xì)60 c 20min)胞質(zhì)中，造成染色淺或小均一。2 .分析Feulgen染色實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照的必要性。請(qǐng)發(fā)揮所學(xué)知識(shí)設(shè)計(jì)對(duì)照方案！答：Feulgen染色實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照，一方面是為了排除干擾例如人為誤差、系統(tǒng)誤差等等，另一方面 是為了體現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)具有專一性，說(shuō)明該反應(yīng)是很有效的。因此除了原本的實(shí)驗(yàn)

8、組以外，我們還需要設(shè)計(jì)三種對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。其中陽(yáng)性對(duì)照與要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容很相似但不相同，能夠 得出陽(yáng)性的結(jié)果，體現(xiàn)了 Feulgen染色的有效性。陰性對(duì)照加了某種處理因素，其他條件全部都相同， 應(yīng)該得到陰性結(jié)果，例如改變鹽酸水浴的溫度等等，用來(lái)排除其他因素干擾。 空白對(duì)照則是不加處理因素，例如用蒸儲(chǔ)水代替，可以檢測(cè)周圍環(huán)境是否穩(wěn)定。Questions 1 .如果用Feulgen反應(yīng)對(duì)小鼠精子細(xì)胞和肝細(xì)胞進(jìn)行DN給量的檢測(cè)，能確定其中的倍數(shù)關(guān)系嗎（精子細(xì)胞為一倍體；幼鼠肝細(xì)胞二倍體；成年鼠肝細(xì)胞包括二倍體、四倍體和八倍體等多倍體）答：能。小鼠細(xì)胞 DN點(diǎn)過(guò)Feulgen反應(yīng)形成的紫紅色產(chǎn)物能特異地吸收550570nm勺光波，并且在一定的濃度范圍內(nèi)， 該產(chǎn)物對(duì)550570nn波的吸收值與DN給量成正比關(guān)系。因此可以通過(guò)測(cè)定相同條 件下小鼠精子細(xì)胞和肝細(xì)胞 Feulgen反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度，來(lái)確定它們DNA勺倍數(shù)關(guān)系，可以應(yīng)用 Feulgen顯微分光光度法來(lái)檢測(cè) DN席量。2 .四膜蟲有兩個(gè)細(xì)胞核，大核位于細(xì)胞中部，直徑約10微米，小核位于大核附近，直徑為微米,它們?cè)谶z傳上發(fā)揮不同的作用。你能在實(shí)驗(yàn)中觀察到這兩個(gè)細(xì)胞核嗎它們各自具有什么作用呢答：理論上在本實(shí)驗(yàn)中可以觀察到小核，但是我這次只看清楚了大核。大核負(fù)責(zé)基因的轉(zhuǎn)錄，決定了細(xì)胞的表型。小核負(fù)責(zé)遺傳物質(zhì)