1、 豬源TTV論文：豬源TTV轉(zhuǎn)錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測方法的建立【中文摘要】TTV(Torque teno virus)屬于環(huán)病毒科指環(huán)病毒屬成員,為單股、環(huán)狀、負(fù)鏈的DNA病毒,正20面體對稱結(jié)構(gòu),無囊膜。人源TTV基因組大小約為3900bp,豬源TTV約2700bp。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)豬源TTV與任何一種豬病有必然聯(lián)系,但是與一些豬病的發(fā)生有一定的相關(guān)性,如斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥、豬皮炎腎炎綜合癥等,因此,研究豬源TTV對于預(yù)防其潛在的致病性有重要意義。1、由于還沒有找到適合在體外培養(yǎng)TTV的細(xì)胞系,其基因組結(jié)構(gòu)及復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制尚不清楚。本研究利用本實(shí)驗室構(gòu)建的含有TTV2基因組三種

2、不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pSK+1TTV2(含有1個TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+1.3TTV2(含有1.3個TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+2TTV2(含有2個TTV2基因組拷貝的pSK載體),將其轉(zhuǎn)染至張氏肝細(xì)胞,48小時后,提取總的RNA,用DpnI消化其中可能存在的DNA,然后利用預(yù)測的閱讀框ORF1、ORF2、ORF3的擴(kuò)增引物,確證其中的DNA已經(jīng)消除干凈。RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,用這三對引物擴(kuò)增基因片段,經(jīng)克隆和測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn):ORF1確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄,但轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并非O.【英文摘要】TTV (Torque teno virus), a small, non-envelope

3、d virus, has a single-stranded circular DNA genome and is currently classified into the family Anelloviridae. Viral DNA of both porcine TTV species (TTV1 and TTV2) has a high prevalence in both healthy ans diseased pigs worldwide and multiple infection of porcine TTV species with distinct genotypes

4、or subtypes of the same species has been documented in China. Human TTV genome has 3900bp and porcine TTV 2700bp. So far, no porcine diseases have been found a reason.【關(guān)鍵詞】豬源TTV ORF 熒光定量PCR 多克隆抗體【英文關(guān)鍵詞】porcine TTV ORF fluorescence quantitative PCR polyclonal antibody【索購全文】聯(lián)系Q1：138113721 Q2：139938848

5、 同時提供論文寫作一對一輔導(dǎo)和論文發(fā)表服務(wù).保過包發(fā)【目錄】豬源TTV轉(zhuǎn)錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測方法的建立摘要6-8 Abstract8-9第一章 緒論17-291.1 TTV 的發(fā)現(xiàn)及概況17-191.2 人TTV 的研究進(jìn)展19-251.2.1 人TTV 流行情況的調(diào)查191.2.2 人TTV 的分子生物學(xué)特征19-241.2.3 人TTV 的致病性241.2.4 人TTV 感染的診斷24-251.3 豬源TTV 研究現(xiàn)狀25-271.3.1 豬源TTV 的流行病學(xué)調(diào)查251.3.2 豬源TTV 的基因型25-261.3.3 豬源TTV 的分子生物學(xué)特征261.3.4 豬源TTV 的

6、致病性26-271.3.5 豬源TTV 的檢測方法271.3.6 TTV 研究的前景展望271.4 目的和意義27-29第二章 豬源TTV 轉(zhuǎn)錄本的鑒定29-472.1 材料與方法29-372.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞292.1.2 試驗試劑和主要儀器設(shè)備29-302.1.3 CaCl_2 法制備大腸埃希氏菌DH5感受態(tài)細(xì)胞302.1.4 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5感受態(tài)細(xì)胞302.1.5 小量制備陽性質(zhì)粒30-312.1.6 陽性質(zhì)粒的酶切鑒定312.1.7 大量制備陽性質(zhì)粒31-332.1.8 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至張氏肝細(xì)胞系33-342.1.9 提取總RNA34-352.1.10 總RNA 中殘余D

7、NA 的檢測352.1.11 反轉(zhuǎn)錄35-362.1.12 PCR 擴(kuò)增目的基因片段362.1.13 PCR 產(chǎn)物的回收36-372.1.14 目的基因片段的克隆與測序372.2 結(jié)果37-452.2.1 含TTV2 FJ2 基因組不同拷貝數(shù)的三種質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果37-382.2.2 含TTV2 FJ2 基因組不同拷貝數(shù)的三種質(zhì)粒的大量抽提結(jié)果38-392.2.3 總RNA 反轉(zhuǎn)錄后目的基因的擴(kuò)增結(jié)果39-412.2.4 測序結(jié)果分析41-452.3 討論45-47第三章 豬源TTV2 ORF1 和ORF2 的多克隆抗體制備47-613.1 材料與方法47-543.1.1 質(zhì)粒、菌株與載體4

8、73.1.2 試劑與儀器473.1.3 實(shí)驗動物47-483.1.4 TSS 法制備BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞483.1.5 ORF1 全長的體外表達(dá)48-493.1.6 ORF1 的B 細(xì)胞表位富集區(qū)和ORF2 全長的體外表達(dá)49-533.1.7 ORF1a 和ORF2 的多克隆抗體的制備53-543.1.8 ORF1a 和ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價測定543.2 結(jié)果54-593.2.1 ORF1 的抗原性分析結(jié)果54-553.2.2 ORF1a 和ORF2 基因的PCR 擴(kuò)增553.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定55-563.2.4 ORF1a 和ORF2 重組蛋白的表達(dá)與純化56-593.2.5 ORF1a 和ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價測定593.3 討論59-61第四章 豬源TTV 熒光定量PCR 檢測方法的建立61-694.1 材料與方法61-644.1.1 病料與核酸樣品614.1.2 試劑和儀器61-624.1.3 引物和探針設(shè)計624.1.4 病毒基因組DNA 的提取624.1.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)模板的制備62-634.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制634.1.7 特異性試驗634.1.8 敏感性試驗634.1.9 重復(fù)性試驗63-644.1.10 病料的的檢測644.