1、1韓韓 北北 忠忠 中國農(nóng)業(yè)大學中國農(nóng)業(yè)大學 食品學院食品學院Han Bei-zhong, Prof. PhDCollege of Food Science & Nutritional EngineeringChina Agricultural University抗抗 生生 素素 發(fā)發(fā) 酵酵 生生 產(chǎn)產(chǎn) 技技 術術Antibiotics Fermentation Production2概述概述生產(chǎn)前期研究生產(chǎn)前期研究生產(chǎn)菌改進生產(chǎn)菌改進生產(chǎn)工藝過程生產(chǎn)工藝過程發(fā)酵條件的控制發(fā)酵條件的控制提取和精制提取和精制IntroductionResearch in LabStrain impro

2、vementProduction processingFermentation controlIsolation & purification 抗抗 生生 素素 發(fā)發(fā) 酵酵 生生 產(chǎn)產(chǎn) 技技 術術Antibiotics Fermentation Production3抗生素抗生素是生物在其生產(chǎn)活動過是生物在其生產(chǎn)活動過程中所產(chǎn)生，并能程中所產(chǎn)生，并能在卑微濃度下有選在卑微濃度下有選擇性地抑制或殺滅擇性地抑制或殺滅其他微生物或腫瘤其他微生物或腫瘤細胞的有機物。細胞的有機物。 Antibiotics Any organic substances produced by various or

3、ganisms that have the power of arresting the growth of other microorganisms or of destroying them.1. 概述概述 Introduction4歷史歷史1929年，英國弗萊年，英國弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素明發(fā)現(xiàn)青霉素二戰(zhàn)期間，大規(guī)模二戰(zhàn)期間，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn)世界上最早用于臨世界上最早用于臨床的抗菌素床的抗菌素 History Penicillin was discovered by Fleming in 1929. World War II, fermented in large-scale The f

4、irst major antibiotic to be commercialized1. 概述概述 Introduction5根據(jù)抗生素的作用機制分類根據(jù)抗生素的作用機制分類 (Modes of Action of Antibiotics) 抑制細胞壁合成抑制細胞壁合成 (Cell Wall Synthesis) ： 青霉素青霉素抑制細胞膜功能抑制細胞膜功能 (Cell Membrane Damage) ： 多烯類抗生素多烯類抗生素抑制蛋白質(zhì)合成抑制蛋白質(zhì)合成 (Protein Synthesis) ： 四環(huán)素四環(huán)素抑制核酸合成抑制核酸合成 (Nucleic Acid Synthesis) ：

5、 絲裂霉素絲裂霉素 分類分類 Classification1. 概述概述 Introduction6復制復制翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄7根據(jù)抗生素的化學結(jié)構(gòu)分類根據(jù)抗生素的化學結(jié)構(gòu)分類-內(nèi)酰胺類內(nèi)酰胺類 (-lactam)： 青霉素類青霉素類 (penicillins) 頭孢菌素類頭孢菌素類 (cephalosporins)氨基糖苷類氨基糖苷類 (aminoglycosides) ： 鏈霉素、慶大霉素鏈霉素、慶大霉素大環(huán)內(nèi)酯類大環(huán)內(nèi)酯類 (macrolides) ： 紅霉素、麥迪加霉素紅霉素、麥迪加霉素四四 環(huán)環(huán) 類類 (tetracyclines) ： 四環(huán)素、土霉素四環(huán)素、土霉素多多 肽肽 類類 (

6、polymyxin) ： 多粘菌素多粘菌素 分類分類 Classification1. 概述概述Introduction8 HNONSCH3CH3HCOO-H-lactam ring -內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺 環(huán)環(huán)Rnatural penicillin R =CH2-CO-9-內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺 環(huán)環(huán)10兩性霉素兩性霉素Antibiotics are so complex they can only be synthesized in a living system11產(chǎn)生菌的篩選產(chǎn)生菌的篩選抗菌性試驗抗菌性試驗提取、精制、鑒定提取、精制、鑒定毒性試驗毒性試驗藥理和臨床試驗藥理和臨床試驗 Screening

7、of a strain Antimicrobial trial Isolation, purification and identification Toxicological trial Medicinal & clinical trial 2生產(chǎn)前期研究生產(chǎn)前期研究 Research in Lab12 Agar diffusion assayagar plate瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基lawn of test bacteria測測 試試 菌菌 苔苔filter papers soakedwith test compounds含含 藥藥 物物 濾濾 紙紙zones of inhibiti

8、on(no growth)抑菌圈抑菌圈13分分 析析 儀儀 器器Analytical instruments現(xiàn)代分析儀器：現(xiàn)代分析儀器：核磁共振核磁共振毛細管電泳毛細管電泳氣相色譜氣相色譜高效液相色譜高效液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜Modern analytical instruments:Nuclear magnetic resonance (NMR)Capillary electrophoresis(CE)Gas chromatography (GC)High performance liquid chromatography (HPLC)Mass spectroscopy (MS) Automati

9、onSensitivityAccuracy自動靈敏準確自動靈敏準確14人工誘變法：人工誘變法：紫外線紫外線、X-線、線、r-線線照射照射亞硝基胍亞硝基胍、亞硝酸、亞硝酸、秋水仙素、氮芥等秋水仙素、氮芥等誘變劑處理誘變劑處理Conventional strain selectionPhysical mutagen eg. Ultraviolet RadiationChemical mutagen eg. Nitrosoguanidine (NTG)Improved strain can be selected empirically 3. 抗生素生產(chǎn)菌改進抗生素生產(chǎn)菌改進 Strain Impr

10、ovement15基因工程Genetic Engineering 3. 抗生素生產(chǎn)菌改進抗生素生產(chǎn)菌改進 Strain ImprovementRecombinant DNA Technology DNA重組技術重組技術克隆克隆16Strain Improvement Scale-upStrain出發(fā)菌株出發(fā)菌株Agar plate平板技術平板技術Primaryshake flaskEvaluation搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)Secondary shake flask evaluationdifferent media二級搖瓶培養(yǎng)二級搖瓶培養(yǎng)各種培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基Lab fermentor evaluat

11、ionProductionCondition小型發(fā)酵罐小型發(fā)酵罐模擬生產(chǎn)條件模擬生產(chǎn)條件Mastercell bankWorkingcell bankInoculumDevelopment菌種擴大培養(yǎng)菌種擴大培養(yǎng)Pilot plantEvaluation中試生產(chǎn)中試生產(chǎn)ProductionEvaluation生產(chǎn)生產(chǎn)60003003031Possiblerecycle1718Scale-up比較放大比較放大models models EL Gadden Jr 200 m3 Same productivity ? Limitations ?模模 擬擬19搖瓶發(fā)酵搖瓶發(fā)酵 Shake-flask

12、fermentation10-50 ml in 125-500 ml flaskBatch onlyLimited control: temperatureSlow metabolizing carbohydrateAmbient pressureBuffers needed to control pHIn-process sampling difficultVolume decrease by evaporationSolid growth on side wallsAntifoam not neededAgitation limited: shaker speedNo control of

13、 dissolved oxygen裝液量：10% (250ml)間歇培養(yǎng)溫控受限制代謝碳水化合物慢常壓緩沖液控制pH在線取樣難容量減少瓶壁上結(jié)垢無需消泡攪拌受限制無法控制溶解氧20攪攪 拌拌 罐罐 發(fā)發(fā) 酵酵 Stirred tank fermentation10-100,000升容量間歇和補料培養(yǎng)連續(xù)控制：pH，溫度需要銨鹽或氨氣2 大氣壓無需緩沖液在線取樣易補料,容量增加 生長均勻一致需消泡多種攪拌 控制溶解氧:通氣,加壓10-100,000 liter vesselsBatch and feed possibleContinuous control: pH, temperatureAmm

14、onium salts or ammonia neededPressure at two atmospheres possibleNo buffers necessary In-process sampling easyVolume increase by sugar feedVery uniform growthAntifoam often requiredWide variety of impellers and bafflesDissolved oxygen controlled by aeration, pressure21搖搖 瓶瓶 發(fā)發(fā) 酵酵 Shake-flask 裝液量：10%

15、 (250ml)間歇培養(yǎng)溫控受限制代謝碳水化合物慢常壓緩沖液控制pH在線取樣難容量減少瓶壁上結(jié)垢無需消泡攪拌受限制無法控制溶解氧10-100,000升容量間歇和補料培養(yǎng)連續(xù)控制：pH，溫度需要銨鹽或氨氣2 大氣壓無需緩沖液在線取樣易補料,容量增加 生長均勻一致需消泡多種攪拌 控制溶解氧:通氣,加壓攪攪 拌拌 罐罐 發(fā)發(fā) 酵酵 Stirred tank 22菌種 種子制備 發(fā)酵 發(fā)酵液預處理 提取及精制 成品包裝Strain Preparation of seed Fermentation Treatment of broth Isolation & purification Packa

16、ge of product4. 抗生素生產(chǎn)工藝過程抗生素生產(chǎn)工藝過程Antibiotics Production Processing23A scheme of the material flow in an antibiotic production 24A scheme of the material flow in an antibiotic production 連消連消發(fā)酵罐發(fā)酵罐緩沖罐緩沖罐種子罐種子罐25發(fā)酵生產(chǎn)原料發(fā)酵生產(chǎn)原料 Materials for FermentationCarbon source:Beet & cane molassesGlucose, lac

17、tose, starchEthanol, methanol GlycerolMaltose syrup, corn syrupCottonseed oil, peanut oil, soy oilLard oil Methyl oleate Tallow碳源碳源:甜菜和甘蔗糖蜜甜菜和甘蔗糖蜜葡萄糖，乳糖，淀粉葡萄糖，乳糖，淀粉乙醇，甲醇乙醇，甲醇甘油甘油麥芽糖漿，玉米糖漿麥芽糖漿，玉米糖漿綿綿籽籽油，花生油，豆油油，花生油，豆油豬油豬油油酸甲酯油酸甲酯油脂油脂26氮源氮源:綿綿籽籽粉粉玉米粉和玉米浸出液玉米粉和玉米浸出液大豆粉和大豆面大豆粉和大豆面花生粉花生粉菜籽粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液牛血

18、，酪蛋白水解液乳清乳清魚粉魚粉酵母酵母酵母膏酵母膏肉粉和骨粉肉粉和骨粉 Nitrogen source:Cotton seed meal Corn meal & steep liquorSoybean meal & flour Peanut meal Rapeseed mealBeef blood, Casein hydrolysate Whey Fish mealWhole yeastYeast extractMeat & bone meal 發(fā)酵生產(chǎn)原料發(fā)酵生產(chǎn)原料 Materials for Fermentation27 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基Media for Cel

19、l Growth & Final productionComponents Range % 組組 成成 葡萄糖/ 蔗糖Starch 淀粉 碳酸鈣Phosphate 磷酸鹽 Ammonium sulphate 硫酸胺Urea 尿素 Oil 油 Fermentation 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基 Components Range % 組組 成成Starch 玉米浸提液Ammonium sulphate and fed periodicallyOil 1.0 and fed continuouslyCorn syrup fed continuously 玉米糖漿 連續(xù)加料 Tank seed 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基28Stirred tank Fermentation 攪拌發(fā)酵攪拌發(fā)酵tpogoCgFogiColollk A C VorolsClcV toloC295. 發(fā)發(fā) 酵酵 控控 制制Fermentation Control Sample AnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressure probeLevel probepH probeTemp. probeDO probeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationS