1、黑龍江東方學(xué)院黑龍江東方學(xué)院本本 科科 生生 畢畢 業(yè)業(yè) 論論 文（設(shè)文（設(shè) 計(jì)）計(jì)）高去酰胺堿性蛋白酶產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究姓 名 王玉玲 學(xué) 號 054131134 專 業(yè) 食品科學(xué)與工程 班 級 2005-B 指導(dǎo)教師 那治國 學(xué) 部 食品與環(huán)境工程學(xué)部 答辯日期 2009 年 5 月 23 日 黑黑龍龍江江東東方方學(xué)學(xué)院院本本科科生生畢畢業(yè)業(yè)論論文文（設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)）評評語語（一一）姓名學(xué)號專業(yè)班級總成績畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目：答辯成績答辯委員會(huì)評語主任簽字： 年 月 日答辯委員會(huì)成員簽字學(xué)部畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）領(lǐng)導(dǎo)小組意見組長簽字： 年 月 日 學(xué)部公章黑黑龍龍江江東東方方學(xué)學(xué)院院本本科科生生

2、畢畢業(yè)業(yè)論論文文（設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)）評評語語（二二）姓名學(xué)號專業(yè)班級畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目：指導(dǎo)教師成績指導(dǎo)教師評語指導(dǎo)教師簽字： 年 月 日黑黑龍龍江江東東方方學(xué)學(xué)院院本本科科生生畢畢業(yè)業(yè)論論文文（設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)）評評語語（三三）姓名學(xué)號專業(yè)班級畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目：評閱教師成績評閱教師評語評閱教師簽字： 年 月 日黑黑龍龍江江東東方方學(xué)學(xué)院院本本科科生生畢畢業(yè)業(yè)論論文文（設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)）任任務(wù)務(wù)書書姓名學(xué)號專業(yè)班級畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目：畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的立題依據(jù)主要內(nèi)容及要求進(jìn)度安排學(xué)生簽字：指導(dǎo)教師簽字：年 月 日本表一式三份，學(xué)生本人、指導(dǎo)教師、學(xué)部各一份。黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）I高去酰胺堿性

3、蛋白酶產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究摘 要微生物堿性蛋白酶具有多樣性的特點(diǎn)，即使是同一類型的酶，由于來源不同，性質(zhì)也各不相同。本文以去酰胺度和肽鍵水解度為指標(biāo)，對地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）2709 的突變株 SDL-9 的產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。首先對B.licheniformis SDL-9 的最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明：接種量 2%，最佳碳源為2%玉米粉、最佳氮源為 2%大豆蛋白，在培養(yǎng)基中添加 0.9%的谷氨酰胺對產(chǎn)高去酰胺堿性蛋白酶具有明顯的誘導(dǎo)作用，起始 pH7.0，發(fā)酵溫度 35，裝液量35mL/100mL，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min。最后以去酰胺度為指標(biāo)，

4、對菌株 SDL-9 所產(chǎn)的高去酰胺活性堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明：40為最適作用溫度，最適作用 pH 為 9，該酶熱穩(wěn)定性一般， 60保溫 2h 后僅存 5.4%的去酰胺能力；pH穩(wěn)定性較好，在 pH710 之間均保持 90%以上的去酰胺能力；金屬離子對該酶的去酰胺能力影響較大，Tween-80 對該酶的去酰胺能力具有明顯的促進(jìn)作用。關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶；地衣芽孢桿菌；去酰胺黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）IIStudy on the Enzyme Production ConditionsAlkaline Protease with High Deamidation an

5、d the Enzymatic PropertiesAbstractMicrobial alkaline protease has the multiple characteristics，Even if is the identical type enzyme，Come from different sources，The nature is also various. In this paper, Peptide bond hydrolysis degree (DH%) and the degree to amide (DAD%) for the judgement based on tw

6、o indicators, by enzyme production conditions and enzymatic properties for target, Of Bacillus licheniformis (B.licheniformis) 2709 mutant of the SDL-9 enzyme production conditions and properties were studied. First best produces the enzyme condition to B.licheniformis to conduct the research, the r

7、esults showed that: the best carbon source for was 2% of the corn meal, The best nitrogen source was 2% of soy protein, and Add in the medium of glutamine 0.9% to produce high to amide alkali protease has obvious entrainment，starting pH 7.0，fermentation temperature 35, liquid volume 35mL/100mL, rota

8、tion speed 200r/min. Finally, enzymatic properties of the alkaline protease with high deamidation from SDL-9 strains were preliminarily studied, by using deamidation capacity as the indicators. the results showed that: 40 was the optimal temperature, and the enzyme to have a higher deamidation capac

9、ity between 35 to 45; the optimal pH 9, the enzyme had a higher deamidation capacity under alkaline conditions (pH8 11); thermal stability of the enzyme was in general, its activity fell to 52.3% under the condition of 50 for 2h, and it activity only had 5.4 percent under the condition of 60 for 2h;

10、 PH stability was better, it activity could keep up 90%, in the pH710; Metal ions had a larger influence on the enzymes ability to deamidation, Tween-80 had a clear-promoting effect on the enzymes deamidation ability. Keywords：Alkalinity protease; modification; soybean peptide目 錄摘 要.I IAbstract.IIII

11、第 1 章 緒 論.1 11.1 大豆蛋白概述 .11.2 大豆蛋白的功能性質(zhì)和去酰胺改性研究 .11.2.1 大豆蛋白的功能性質(zhì) .21.2.2 大豆蛋白的改性研究 .21.2.3 大豆蛋白的去酰胺改性 .31.3 堿性蛋白酶的研究現(xiàn)狀 .41.3.1 堿性蛋白酶的性質(zhì) .41.3.2 堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì) .51.3.3 堿性蛋白酶國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用 .51.4 本文的目的意義及主要研究內(nèi)容 .61.4.1 本文的目的意義 .61.4.2 主要研究內(nèi)容 .6第 2 章 材料與方法.8 82.1 試驗(yàn)材料與儀器 .82.1.1 菌株 .82.1.2 培養(yǎng)基 .82.1.3 主要試劑 .8

12、2.1.4 主要儀器設(shè)備 .82.2 試驗(yàn)方法 .82.2.1 粗酶液的制備 .92.2.2 測定方法 .92.2.3 高去酰胺堿性蛋白酶產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 .112.2.4 高去酰胺堿性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 .12第 3 章 結(jié)果與分析.14143.1 高去酰胺堿性蛋白酶產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 .143.1.1 SDL-9 種子生長曲線.143.1.2 接種量對產(chǎn)酶的影響 .143.1.3 碳源對產(chǎn)酶的影響 .153.1.4 氮源對產(chǎn)酶的影響 .153.1.5 誘導(dǎo)物谷氨酰胺對產(chǎn)酶的影響 .163.1.6 起始 pH 值對產(chǎn)酶的影響 .163.1.7 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響 .173.1.8 不同裝液量對

13、產(chǎn)酶的影響 .173.1.9 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響 .183.2 高去酰胺堿性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 .183.2.1 酶的最適作用溫度 .183.2.2 酶的最適作用 pH 值 .183.2.3 酶的熱穩(wěn)定性 .193.2.4 酶的 pH 穩(wěn)定性 .193.2.5 金屬離子對該酶去酰胺能力的影響 .203.2.6 表面活性劑濃度對該酶去酰胺能力的影響 .20結(jié) 論.2222參考文獻(xiàn).2323致 謝.2424黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）1第 1 章 緒 論1.1 大豆蛋白概述我國是大豆的故鄉(xiāng)，品種資源極為豐富，產(chǎn)量極大，尤其北方種植甚為廣泛，大豆的加工歷史十分悠久，早在 2000 多年前

14、，在中華民族的繁衍與發(fā)展過程中，大豆制品具有不可磨滅的貢獻(xiàn)。大豆的蛋白質(zhì)含量非常豐富（一般在 35%45%） ，且具有及高的營養(yǎng)性，不但含有 8 種人體必需的氨基酸，而且氨基酸比例比較合理，它與牛奶蛋白、雞蛋蛋白和牛肉蛋白有同等營養(yǎng)價(jià)值，是一種全價(jià)蛋白。大豆蛋白不僅營養(yǎng)價(jià)值高，而且還有多種保健作用，可以防治多種疾病，并可預(yù)防肥胖。在食品加工業(yè)中大豆蛋白所具有的更為重要的特征是它具有與食品的嗜好性、加工性等相關(guān)的各種功能特性。然而，大豆蛋白在現(xiàn)代食品加工中的應(yīng)用受到了一定的限制。這是因?yàn)椋菏紫龋蠖沟鞍椎墓δ苄再|(zhì)還不能滿足現(xiàn)代食品加工的需求，不同的食品對功能性質(zhì)的要求不同，某些功能性需要加強(qiáng)或減

15、弱；其次，大豆蛋白的功能特性是與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的，要獲得具有良好功能的大豆蛋白制品，就必須要求原料大豆蛋白有高的溶解性、分散性1，而大豆蛋白中的 11S 球蛋白（占大豆蛋白總含量的 31%以上）的溶解性較差。為此，加強(qiáng)或改善大豆蛋白的功能特性，特別是提高大豆蛋白的溶解性已成為食品加工業(yè)亟待解決的問題。目前，常用提高大豆蛋白溶解性的方法主要是蛋白酶酶解，這種方法雖然能在很大程度上提高溶解性及改善某些功能性，但大豆蛋白原有的保健功能受到了不同程度破壞。而利用去酰胺方法對大豆蛋白進(jìn)行改性，不僅可以提高蛋白質(zhì)的溶解性、凝膠性等功能性，而且能很好的保留其保健功能2。因此，通過去酰胺改性方法制備高活性大豆

16、蛋白是非常必要的。去酰胺改性方法包括物理方法、化學(xué)方法和生物酶法。物理改性雖然具有安全性好、作用時(shí)間短及對營養(yǎng)性質(zhì)影響較小等優(yōu)點(diǎn)，但改性效果并不十分明顯，而化學(xué)改性出于安全性的考慮，多用作基礎(chǔ)理論研究的分析手段3。而酶法去酰胺改性屬酶工程在食品加工業(yè)中應(yīng)用的新技術(shù)，具有高效、安全的特點(diǎn)。盡管動(dòng)物酶、植物酶提取生產(chǎn)復(fù)雜，價(jià)格昂貴，而目前看好的微生物酶以其原料來源廣泛、價(jià)格低廉、效果顯著、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在未來取得主導(dǎo)地位。因此，應(yīng)用微生物蛋白酶對大豆蛋黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）2白進(jìn)行去酰胺改性，將成為蛋白改性領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，擁有廣闊的應(yīng)用前景。1.2 大豆蛋白的功能性質(zhì)和去酰胺改

17、性研究1.2.1 大豆蛋白的功能性質(zhì)大豆蛋白不僅具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，而且具有與食品的嗜好性、加工性等相關(guān)的各種功能特性，所以廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)及其他行業(yè)中。大豆蛋白質(zhì)的功能特性是指對人們所期望食品特征產(chǎn)生影響的一些物理和化學(xué)性質(zhì)，它對于食品或食品成分在貯藏、加工或銷售中的物理性質(zhì)起著重要作用。蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)主要分三類：(1)水合性，包括水吸收及保留、溶脹、分散性、溶解度和粘度。由蛋白質(zhì)肽鏈骨架上的極性基團(tuán)與水分子發(fā)生水化作用；(2)與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)的性質(zhì)，包括沉淀作用、凝膠作用、蛋白質(zhì)面團(tuán)及纖維結(jié)構(gòu)的形成。蛋白質(zhì)分子受熱舒展，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，通過疏水作用、靜電作

18、用、氫鍵或二硫鍵交聯(lián)形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；(3)表面活性，包括表面張力、乳化作用和起泡沫作用4。食品體系的大豆蛋白所具有的典型功能特性，如表 1-1 所示。表 1-1 食品中大豆蛋白功能特性功能性質(zhì)作用方式應(yīng)用的食品體系溶解性依賴于 pH 的蛋白溶解性飲料、蛋黃醬吸水性親水性肉類、腸、面包、蛋糕凝膠性蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)形成基質(zhì)肉、乳酪、豆腐彈 性形成凝膠時(shí)的二硫鍵連接肉、烤制品乳化性脂肪乳化體系的形成和穩(wěn)定肉、蛋糕、臘腸、湯吸脂肪游離脂肪酸的束縛肉、臘腸、油炸食品起泡性形成泡膜攪打食品、薄餅干、蛋糕黏著性蛋白質(zhì)作為粘性物質(zhì)肉、湯、烤制品粘 性增稠、束水湯、肉汁1.2.2 大豆蛋白的改性研究大豆蛋白改性就

19、是通過改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其一個(gè)或幾個(gè)理化性質(zhì)，達(dá)到加強(qiáng)或改善蛋白質(zhì)功能性的目的。常用的改性方法有物理改性、化學(xué)改性、酶改性和生物工程改性。物理改性是指通過加熱、冷凍、加壓、磁場、電場等物理手段來改善蛋白質(zhì)的功能特性的方法。物理改性具有安全性好、作用時(shí)間短以及對產(chǎn)品營養(yǎng)性能影響小等優(yōu)黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）3點(diǎn)，但也同時(shí)存在設(shè)備投入大，改性范圍窄等缺點(diǎn)5。化學(xué)改性方法主要是指采用化學(xué)方法針對蛋白中的氨基、羥基、羧基和巰基進(jìn)行改性，具有反應(yīng)簡單、效果顯著的特點(diǎn)，但同時(shí)也存在反應(yīng)條件苛刻，易有化學(xué)物質(zhì)殘留和副產(chǎn)物混雜等缺點(diǎn)，蛋白質(zhì)的化學(xué)改性方法主要有酸堿處理、磷酸化、糖基化、

20、酰化、去酰胺、共價(jià)交聯(lián)以及氧化方法，其中去酰胺改性是近年來倍受關(guān)注的蛋白改性方法。生物工程改性是指應(yīng)用植物育種和分子技術(shù)，改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)的方法。大豆蛋白的酶法改性就是通過酶部分降解蛋白質(zhì)，并對蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，從而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。酶法改性具有專一性強(qiáng)、條件溫和，無毒副作用的特點(diǎn)，受到人們的廣泛關(guān)注。隨著一些新用途的酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，極大的拓寬了酶法改性的應(yīng)用范圍，目前，許多化學(xué)改性方法都可用酶法代替，如去酸胺、磷酸化、交聯(lián)聚合、氧化等。所涉及的酶包括有各種類的蛋白酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)、磷酸酶以及過氧化氫酶等6。1.2.3 大豆蛋白的

21、去酰胺改性去酰胺改性是近年來在蛋白改性研究中備受關(guān)注的研究課題之一。由于油料蛋白中含有豐富的天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)殘基，所以蛋白肽鏈上的酰胺殘基對蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)形成的貢獻(xiàn)率較高，對蛋白質(zhì)的溶解性等功能性質(zhì)有重要影響。所以去酰胺改性可以使蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)尤其是溶解性得到很大提高7，而溶解性往往影響蛋白質(zhì)其它功能性質(zhì)如增稠、起泡、乳化和凝膠作用等。 去酰胺改性方法包括物理方法、化學(xué)方法和生物酶法8。物理方法包括高溫?zé)崛ヵ０泛涂刂茰囟取穸群?pH 值的雙螺桿擠壓法去酰胺，這兩種物理去酰胺方法采用110以上的高溫處理，去酰胺度最高達(dá) 29.65% ?；瘜W(xué)方法去酰胺有酸法、堿法和磷酸

22、鹽等其它陰離子法對蛋白質(zhì)去酰胺改性。用堿催化去酰胺改性僅臺灣有報(bào)道，這種方法雖然速度快，但使得蛋白質(zhì)中的氨基酸發(fā)生了消旋作用，使必需氨基酸的 L-對映體減少和消化率降低，并產(chǎn)生賴氨酸、丙氨酸，毒理研究表明它對小鼠腎有毒害作用，因此研究甚少。酸法去酰胺是一種常用而且有效的去酰胺方法，很多學(xué)者用稀鹽酸或稀醋酸對谷朊粉、麥膠蛋白和花生蛋白進(jìn)行處理，得到很好的去酰胺效果9。生物酶法去酰胺是用特定的酶在一定條件下對蛋白質(zhì)進(jìn)行去酰胺改性。酶法去酰胺中，轉(zhuǎn)谷黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）4氨酰胺酶(TGase)在無伯胺存在的情況下，可催化蛋白質(zhì)的谷氨酸殘基釋放出側(cè)鏈基團(tuán)中的氨。肽谷酰胺酶(PGase)

23、用于熱變性大豆蛋白的去酰胺需先用蛋白酶水解蛋白質(zhì)至一定程度或濕熱法(100，15min)進(jìn)行預(yù)處理，再用 PGase 作用，脫氨速率可增加 27倍10。蛋白酶中的木瓜蛋白酶(Papain)、鏈霉蛋白酶(Pronase)、胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、微生物堿性蛋白酶對大豆蛋白和谷朊粉都具有一定的去酰胺能力，且水解度在 0%10%之間。1.3 堿性蛋白酶的研究現(xiàn)狀1.3.1 堿性蛋白酶的性質(zhì)堿性蛋白酶是指在 PH 值為堿性的條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類。堿性蛋白酶除可催化蛋白質(zhì)水解為氨基酸外，在有機(jī)溶劑中還可催化多肽的合成。1.3.1.1 堿性蛋白酶的一般性質(zhì)微生物堿性蛋白酶的作用 p

24、H 值一般在 711 范圍內(nèi)有活性。在以酪蛋白為底物時(shí)的最適 pH 多在 9.510.5 范圍內(nèi)，這些酶除可以水解肽鍵外，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的能力。多數(shù)微生物堿性蛋白酶不耐熱，在 5060加熱 1015min,幾乎一半酶的活性下降 50%，只有費(fèi)氏鏈霉菌（S.fradiae）與立德鏈霉菌(S.rectus)等所產(chǎn)堿性蛋白酶經(jīng)70處理 30min，酶活性僅損失 10-15%。我國生產(chǎn)的幾種堿性蛋白酶的耐熱性也在60以下。堿土金屬，特別是鈣對堿性蛋白酶有明顯的熱穩(wěn)定作用。1.3.1.2 酶的結(jié)構(gòu)和活性中心堿性蛋白酶的分子量在 20,00034,000 之間，等電點(diǎn)多為 89。大多數(shù)

25、微生物堿性蛋白酶作用于肽鏈，生成二個(gè)肽。除酶本身的氨基酸殘基外，不具有特定的活性基團(tuán)，酶發(fā)揮作用時(shí)不需要特定的激活劑，而需要金屬離子激活，如除去金屬離子就不能作用，必需的金屬離子有 Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等。堿性蛋白酶屬絲氨酸蛋白酶，除二異丙基氟磷酸(DFP)外，苯甲磺酰氟（PMSF）和其它磺酰鹵化物，以及來自馬鈴薯、大麥、大豆的蛋白酶抑制劑可引起堿性蛋白酶的失活。1.3.1.3 堿性蛋白酶的專一性堿性蛋白酶的專一性決定于其自身結(jié)構(gòu)，當(dāng)它與不同底物結(jié)合時(shí)，首先形成一個(gè)非共價(jià)的酶底物復(fù)合物，它們靠物理引力維持在一起，接著絲氨酸的氫基對底物發(fā)黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（

26、設(shè)計(jì)）5起攻擊，產(chǎn)生四面體中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物破裂，形成酶產(chǎn)物復(fù)合物。微生物堿性蛋白酶具有強(qiáng)烈的酯酶活性，可水解甲苯磺酸基精氨酸甲酯（TAME）和各種對硝基苯基酯?？莶輻U菌（B.subtlis）蛋白酶最佳的合成底物是乙酞基酪氨酸乙酯。堿性蛋白酶的專一性強(qiáng)烈地受到切開點(diǎn)兩側(cè)氨基酸殘基，尤其是 P1-P4-氨基酸的影響，因此對天然底物的專一性甚廣，它對酪蛋白的作用比對血紅蛋白或牛血清蛋白更容易。根據(jù)微生物堿性蛋白酶對切開點(diǎn)羧基側(cè)的專一性可將其分為四類：類似于胰蛋白酶的堿性蛋白酶，對堿性氨基酸如精氨酸、賴氨酸有專一性。對芳香族或疏水性氨基酸殘基有專一性，如枯草桿菌堿性蛋白酶。對小分子脂肪族氨基酸殘

27、基有專一性，如粘細(xì)菌一裂解型蛋白酶，這是一種溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白酶。對酸性殘基有專一性，如葡萄球菌堿性蛋白酶。1.3.2 堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)1.3.2.1 PH 對堿性蛋白酶的影響目前分離到的大多數(shù)堿性蛋白酶最適作用的 pH 范圍為 9.0-10.0，僅少數(shù)超過11.0，甚至達(dá)到 pH12.0，且酶活力一般在堿性范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。Kanekar 等報(bào)道，從一堿性湖泊中分離得到兩株產(chǎn)堿性蛋白酶菌株A.ramosus 及 B.alcalophilus，65下，前者分泌的蛋白酶最適 pH 為 11.0，后者分泌的蛋白酶酶為 10.0。兩種酶在 pH7.0-12.0 范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)的活力都十分穩(wěn)定1

28、1。1.3.2.2 溫度對堿性蛋白酶的影響堿性蛋白酶的溫度適應(yīng)范圍較廣，最適作用溫度一般在 3075之間。有的低溫酶在 20以下的低溫仍能保持較高的活性，孫謐等報(bào)道的低溫堿性蛋白酶在 20時(shí)的酶活性保持在 50%以上12。目前國內(nèi)已報(bào)道的高溫堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株中，黃紅英等報(bào)道的堿性蛋白酶最適溫度為 60，60保溫 30min 剩余 40%左右的酶活；劉成圣等報(bào)道的堿性蛋白酶最適溫度 5060，60保溫 30min 酶活剩余 50%；Kunamneni Adinarayana 等人研究了枯草芽孢桿菌 PE-11 的熱穩(wěn)定性，研究表明，該酶在 60處理了 350 min 酶仍保持 100%活力13

29、。1.3.2.3 有機(jī)試劑及金屬離子對堿性蛋白酶的影響黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）6大多數(shù)微生物堿性蛋白酶的活性中心含有絲氨酸，屬于絲氨酸蛋白酶。當(dāng)遇到作用于絲氨酸的試劑二異丙基氟磷酸(DFP)便失活，這是堿性蛋白酶的一個(gè)重要特征。堿性蛋白酶對金屬螯合劑 EDTA、重金屬和巰基試劑卻不敏感，但也有例外，王宇婧等研究 Pb2+、Ag+、Cu2+對 YS-80-122 海洋低溫堿性蛋白酶有抑制作用，EDTA 對其有強(qiáng)烈抑制作用14。大多數(shù)堿性蛋白酶發(fā)揮作用時(shí)不需要特定的激活劑，但是需要金屬離子激活，必須的金屬離子有 Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等，Ca2+對堿性蛋白酶有

30、穩(wěn)定作用。同一金屬離子對不同堿性蛋白酶的影響是不同的，或是激活、或是抑制、或是影響。1.3.3 堿性蛋白酶國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用堿性蛋白酶(Alkaline protease)廣泛存在于微生物中，最早發(fā)現(xiàn)在豬的胰臟中，1913 年 Rhom 首先將胰蛋白酶作為洗滌浸泡劑使用。1945 年瑞士的 Dr.Jagg 等發(fā)現(xiàn)了微生物堿性蛋白酶，使其成為洗滌劑的主要添加劑之一。堿性蛋白酶在絲綢、制革工業(yè)、飼料工業(yè)、動(dòng)物食品加工中也有廣泛用途，如添加到動(dòng)物飼料中以提高飼料利用率；用于制作海鮮調(diào)味品；用于 CGM(玉米渣)的水解，以制取玉米飲料；水解大豆蛋白生產(chǎn)大豆多肽等。由于市場的需求，高產(chǎn)、高效、耐高溫

31、、耐高堿的四高型堿性蛋白酶成為國內(nèi)外當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，地衣芽孢桿菌所產(chǎn)的胞外酶也日益被廣泛研究應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，此酶可降解某些復(fù)雜的植物性碳水化合物如果膠,羧甲基纖維素，多聚半乳糖醛酸等。因此如果將地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶廣泛應(yīng)用并用于工業(yè)化生產(chǎn)，將會(huì)對人類有重大的意義。1.4 本文的目的意義及主要研究內(nèi)容1.4.1 本文的目的意義本研究針對國內(nèi)外應(yīng)用微生物蛋白酶對大豆蛋白進(jìn)行去酰胺改性的研究較少，現(xiàn)有微生物蛋白酶的去酰能力較低，對功能性的影響不大等現(xiàn)狀，對地衣芽孢桿菌 2709的突變菌株 B. licheniformis SDL-9 的產(chǎn)酶條件以及該蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研

32、究，以期為高去酰胺活性堿性蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為大豆蛋白的改性提供一條新途徑，對食品加工業(yè)的發(fā)展具有積極的作用。1.4.2 主要研究內(nèi)容1.4.2.1 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化黑龍江東方學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）7主要從接種量、碳源、氮源、誘導(dǎo)物、起始 pH 值、溫度、以及通氣量等方面入手，以酶液對大豆蛋白的去酰胺度和肽鍵水解度為指標(biāo)，對 B. licheniformis SDL-9 發(fā)酵產(chǎn)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。1.4.2.2 高去酰胺堿性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究通過實(shí)驗(yàn)確定該高去酰胺活性堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度、最適 pH，并對該酶的熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性以及表面活性劑、金屬離子對酶活性的

33、影響等基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）8第 2 章 材料與方法2.1 試驗(yàn)材料與儀器2.1.1 菌株地衣芽孢桿菌(B. licheniformis )SDL-9，B. licheniformis2709 的突變株，本實(shí)驗(yàn)保藏。2.1.2 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（%）：牛肉膏 1.0，蛋白胨 1.0，NaCl 0.5，瓊脂 2.0，pH 7.2。平板培養(yǎng)基（%）：牛肉膏 0.5，蛋白胨 1.0，NaCl 0.5，瓊脂 1.5，pH 7.2。種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖 1.0，蛋白胨 0.5，酵母膏 0.5，NaCl 0.5，pH 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基 （%）： 可溶性淀粉 1.

34、0，麩皮 1.0，黃豆餅粉 2.0，酵母膏2.0，Na2HPO40.2，KH2PO4 0.1，CaCO3 1.0 ，pH 7.2。2.1.3 主要試劑大豆分離蛋白（A 型） 哈高科大豆食品公司 茚三酮 分析純 北京亞太龍興化工有限公司甘氨酸 分析純 天津市大陸化學(xué)試劑廠果 糖 生化試劑 北京市旭東化工廠硼 酸 分析純 天津市大陸化學(xué)試劑廠谷氨酰胺 生化試劑 中國惠世生化試劑有限公司黃豆餅粉、玉米粉、麩皮均為市售；2.1.4 主要儀器設(shè)備KYC-100 型恒溫?fù)u床 北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司LRH-250 生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司DHG-9140A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有

35、限公司CL-32L 自動(dòng)高壓滅菌器 日本 ALPSW-LJ-2FD 型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司TGL-16 型臺式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司BS223S-Max 型電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司LD5-2A 型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠S-54 型紫外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司制造黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）92.2 試驗(yàn)方法2.2.1 粗酶液的制備將地衣芽孢桿菌 B. licheniformis SDL-9 斜面菌種從冰箱中取出，轉(zhuǎn)接活化，然后接種到裝有 30mL 種子培養(yǎng)基的 100mL 三角瓶中，30、140r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 12h作

36、為種子液，再按 2%的接種量接種于裝有 35mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的 100mL 三角瓶中，35、200r/min 搖床發(fā)酵 48h 后，10,000r/min 離心 10min，取上清液，即得粗酶液。2.2.2 測定方法2.2.2.1 去酰胺度測定方法用 Conway 和 OMalley(1942)的微量彌散皿法15?？傰０返康臏y定：取1mL1%的蛋白溶液，與0.25mL 12mol/L HCl 混合，再加入 0.25mL 水封于硬質(zhì)玻璃管中，在125下水解3h，水解完畢后取出，待冷后打開玻璃管。在微量彌散皿中央加入3mL 吸收劑，外圍加入1.2mL 樣品，用薄膜覆蓋，留一定空隙，在外圍再加入

37、40%NaOH 溶液3mL。立即封上薄膜避免漏氣；輕輕擺動(dòng)，使外圍的樣品與NaOH 溶液充分混合，平放桌上反應(yīng)2.5h；揭開薄膜后用0.01mol 的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定至略帶微紅，記錄消耗鹽酸的體積，按下式計(jì)算酰胺氮含量。計(jì)算：WN=NHCLVHCL/WT式中： WN總酰胺氮含量，mmol/g 蛋白質(zhì)；NHCL標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度，取0.01063mol/L；VHCL消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL；WT樣品中蛋白質(zhì)的含量，g酶解酰胺氮含量的測定：在微量彌散皿中央加入2ml 含甲基紅-溴甲酚綠指示劑的2%的硼酸作為吸收劑，外圍加入20ml 0.5%的大豆分離蛋白的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10.0） ，再在

38、外圍加入 0.5mL 0.2%的酶液，迅速用水溶性膠封住彌散皿， 27放置36h 以釋放氨氣。吸收劑用0.0106mol 的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定至略帶微紅，記錄消耗鹽酸的體積。計(jì)算：CN=NHCLVHCL/WT式中， CN酶解酰胺氮含量，mmol/g 蛋白質(zhì)； NHCL標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度，取0.0106mol/L； VHCL消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積， mL；黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）10 WT樣品中蛋白質(zhì)的含量，g去酰胺度計(jì)算：去酰胺度（%）= （WNCN）/ WN1002.2.2.2 肽鍵水解度(DH)的測定測定采用茚三酮比色法16。水解度的定義：蛋白質(zhì)的水解度 DH（Degree of

39、hydrolysis）代表蛋白質(zhì)在水解過程中，肽鍵被裂解的程度或百分比，數(shù)學(xué)表達(dá)式為：%100DHtothh式中：h 是被裂解的肽鍵數(shù)，htot是原蛋白質(zhì)中的總肽鍵數(shù)，這里的 h 和 htot單位經(jīng)常用 mmol/g 表示。對于一個(gè)特定的蛋白質(zhì)，htot是一個(gè)常數(shù)，一般采用文獻(xiàn)中的經(jīng)驗(yàn)值，比如：大豆蛋白質(zhì)的 htot值為 7.8 mmol/g，酪蛋白的 htot值為 8.2 mmol/g，也可以根據(jù)蛋白質(zhì)中氨基酸的組成成分計(jì)算得到。(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取 0.1000g 干燥過的甘氨酸溶于蒸餾水后定容至 100mL，取溶液 5.0mL 定容至 100mL，得 50g/mL 的溶液，再取此溶液

40、稀釋成含量為2.527.5g/mL 的溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。各取 2.0mL 稀釋液于具塞刻度試管中，分別加入 1.0mL 茚三酮顯色劑，混勻后置于沸水浴中加熱 15min，在冷水中冷卻，加入 5mL 50%乙醇溶液混勻，放置 15min，同時(shí)作空白試驗(yàn)，用 1cm 比色杯以空白管調(diào)零于 570nm 處測定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，甘氨酸濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品的測定 將水解蛋白液適當(dāng)稀釋后，取 2mL 稀釋液于試管中并加入 1.0mL茚三酮顯色劑，混勻后置于沸水浴中加熱 15min，同時(shí)作空白試驗(yàn)；以后操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水解蛋白液中-NH2基的含量(mmol/m

41、L)。水解度的計(jì)算公式如下：%100DHtothh %100)g/mmol(L/gL/molmNH-L/molmNH-tot22h）度（水解前蛋白質(zhì)溶液的濃）含量（原料蛋白中游離）含量（水解液式中：DH肽鍵水解度；黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）11h水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol）-NH2；htot每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol） ，大豆蛋白取 7.8；2.2.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用半微量凱氏定氮法17。2.2.3 高去酰胺堿性蛋白酶產(chǎn)酶條件的優(yōu)化2.2.3.1 生長曲線的測定將供試菌株單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，30、140r/min 搖床振蕩培養(yǎng)過夜后

42、，按 2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到 16 個(gè)裝有 15mL 種子培養(yǎng)基的 50mL 三角瓶中，30、140r/min 條件下，搖床振蕩培養(yǎng) 30h，每隔 2h 取出一瓶，適當(dāng)稀釋后測定其在 600nm下的吸光值，繪制種子生長曲線，得出對數(shù)生長期。2.2.3.2 接種量對產(chǎn)酶的影響將培養(yǎng) 12h 的種子液分別以 1%、2%、3%、4%、5%的接種量轉(zhuǎn)接于 30mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵產(chǎn)酶，以去酰胺度和肽鍵水解度為指標(biāo)，觀察不同接種量對產(chǎn)酶的影響。2.2.3.3 碳源對產(chǎn)酶的影響分別以 1%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糊精和玉米粉代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，以 2%接種量接種 SDL-9 種子液，30、14

43、0r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 48h，10,000r/min離心 10min 取上清液，測定其去酰胺度和肽鍵水解度，比較不同碳源對產(chǎn)酶的影響。2.2.3.4 氮源對產(chǎn)酶的影響采用 2%的玉米粉為碳源，分別以 2%蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、氯化銨、硫酸銨、尿素、大豆蛋白和酪素代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，以 2%接種量接種 SDL-9種子液，30、140r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 48h，10,000r/min 離心 10min 取上清液，測定其去酰胺度和肽鍵水解度，比較不同氮源對產(chǎn)酶的影響。2.2.3.5 誘導(dǎo)物谷氨酰胺對產(chǎn)酶的影響分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.

44、5%谷氨酰胺做為誘導(dǎo)物，以 2%接種量接種 SDL-9 種子液，30、140r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 48h，10,000r/min 離心 10min 取上清液，測定其去酰胺度和肽鍵水解度，以未加谷氨酰胺的為對照，研究誘導(dǎo)物谷氨酰胺對產(chǎn)酶的影響。2.2.3.6 起始 PH 值對產(chǎn)酶的影響黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）12將發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 值分別調(diào)節(jié)為 4.010.0，以 2%接種量接種 SDL-9 種子液，30、140r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 48h，10,000r/min 離心 10min 取上清液，測定其去酰胺度和肽鍵水解度，考察起始 pH 值對產(chǎn)酶的影響。2.2.3.7 溫度

45、對產(chǎn)酶的影響在不同溫度下(25、30、35、40、45、50、55)140r/min 搖床振蕩培養(yǎng)，48h 取上清測定其去酰胺度和肽鍵水解度，考察不同溫度對產(chǎn)酶的影響。2.2.3.8 裝液量對產(chǎn)酶的影響在 100mL 三角瓶中分別裝入15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，30、140r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 48h，10,000r/min 離心 10min 取上清液，測定其去酰胺度和肽鍵水解度，考察不同通氣量對產(chǎn)酶的影響。2.2.3.9 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響以 2%接種量接種 SDL-9 種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速在100r/mi

46、n240r/min 范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，考察搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響。2.2.4 高去酰胺堿性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究2.2.4.1 酶的最適作用溫度用 pH 10.0 的碳酸鈉碳酸氫鈉緩沖液適當(dāng)稀釋粗酶液，并配制 pH 10.0 的 1%大豆分離蛋白溶液，分別在 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60的溫度下測定去酰胺度。以去酰胺度為縱坐標(biāo)，反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，繪制酶反應(yīng)溫度曲線，確定酶的最適作用溫度。2.2.4.2 酶的最適作用 PH 值在 pH 值為 412 范圍內(nèi)，向酶反應(yīng)體系中分別添加相差 1 個(gè) pH 單位的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖溶液(pH

47、46)、磷酸鹽緩沖溶液 (pH 78)、碳酸鈉碳酸氫鈉緩沖溶液(pH 911)和磷酸氫二鈉氫氧化鈉緩沖溶液(pH 12.0)，在最適反應(yīng)溫度下，測定去酰胺度。以去酰胺度為縱坐標(biāo)，反應(yīng) pH 值為橫坐標(biāo)，繪制酶反應(yīng) pH 值曲線，確定酶的最適作用 pH 值。2.2.4.3 酶的熱穩(wěn)定性將酶液分別于 40、50、60、70、80的水浴中保溫，每隔 20 min 取樣在黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）13最適反應(yīng)溫度、反應(yīng) pH 值的條件下，測定去酰胺度，以未保溫的去酰胺度為 100%，其余折合成剩余的百分?jǐn)?shù)，繪制相對去酰胺度-保溫時(shí)間曲線。2.2.4.4 酶的 PH 穩(wěn)定性將粗酶液與不同 p

48、H 值(311)的緩沖液按 11 的體積比混合，于 30保溫 2h 后，測定去酰胺度，以在最適反應(yīng) pH 下保溫所測定的酶活力為 100%，其余折合成剩余的百分?jǐn)?shù)，以此對保溫 pH 作圖，便可得到該酶在上述條件下的 pH 穩(wěn)定曲線。2.2.4.5 金屬離子對該酶去酰胺能力的影響在酶反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+)，使其終濃度達(dá)到 5mmol/L，并保溫 20min，測定去酰胺度，以未加金屬離子的去酰胺度為 100%，計(jì)算加入不同金屬離子的殘余酶活力，研究金屬離子對該酶去酰胺能力的影響情況。2.2.4.6 表面活性劑濃度對該

49、酶去酰胺能力的影響在酶反應(yīng)體系中添加不同濃度(1%5%)的 Tween-80，測定去酰胺度。用不加Tween-80 的為對照，以濃度為橫坐標(biāo)，以去酰胺度為縱坐標(biāo)作圖，研究表面活性劑對該酶去酰胺能力的影響情況。黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）14第 3 章 結(jié)果與分析3.1 高去酰胺堿性蛋白酶產(chǎn)酶條件的優(yōu)化3.1.1 SDL-9 種子生長曲線將 SDL-9 培養(yǎng)液于在 30、140r/min 條件下，搖床振蕩培養(yǎng) 32h，定時(shí)取樣測定發(fā)酵液在 600nm 下的吸光值，繪制種子的生長曲線，見圖 3-1。由圖 3-1 可見，SDL-9的對數(shù)生長期為 616 小時(shí)。圖 3-1 突變株 SDL-9

50、 種子生長曲線3.1.2 接種量對產(chǎn)酶的影響將培養(yǎng) 12h 的種子液分別以 1%5%的接種量轉(zhuǎn)接于 30mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵產(chǎn)酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖 3-2。圖 3-2 接種量對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響由圖 3-2 可以看出，接種量對菌種發(fā)酵產(chǎn)酶肽鍵水解度的影響不大，而對去酰胺度的影響相對較大，接種量為 2%時(shí)去酰胺度最高，而接種量過低或過高對產(chǎn)酶的去酰胺能力均不利，可能原因是接種量過低時(shí)，由于菌種生長不好而影響酶的生物合成，接種量過大由于菌種生長過于旺盛，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗太快，有些初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生對酶合成有抑制作用。00.10.20.30.40.

51、50.60246810121416182022時(shí)間/hOD值424344454647480123456接種量/%去酰胺度/%12131415161718肽鍵水解度/%去酰胺度肽鍵水解度黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）153.1.3 碳源對產(chǎn)酶的影響分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉和玉米粉作為碳源，發(fā)酵產(chǎn)酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖 3-3。圖 3-3 不同碳源對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)基碳源主要為微生物生長提供能量和細(xì)胞骨架，不同碳源對產(chǎn)酶貢獻(xiàn)是不一樣的。通常情況下，易利用碳源有利于微生物生長，而緩慢分解的碳源有利于產(chǎn)酶。從圖 3-3 可以看出，以玉米粉

52、作為碳源時(shí)產(chǎn)酶的去酰胺度最高，其次為可溶性淀粉，且前者的肽鍵水解度略低于后者。同時(shí)還可以看出，易利用碳源如葡萄糖、麥芽糖等作為碳源時(shí)對產(chǎn)酶有一定的抑制作用，產(chǎn)酶的去酰胺度和肽鍵水解度都較低，這可能是由于代謝產(chǎn)物的阻遏作用?？紤]到我們要選擇的是去酰胺能力強(qiáng)，而肽鍵水解能力弱的產(chǎn)酶條件，所以我們選擇玉米粉為最佳碳源。3.1.4 氮源對產(chǎn)酶的影響分別以氯化銨、硫酸銨、尿素、牛肉膏、大豆蛋白、酪素、黃豆餅粉及蛋白胨為氮源，發(fā)酵產(chǎn)酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖 3-4。圖 3-4 不同氮源對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響從圖 3-4 可以看出，不同氮源對堿性蛋白酶的去酰胺能力和肽鍵水解能力的貢

53、獻(xiàn)01020304050葡萄糖麥芽糖蔗糖糊精可溶性淀粉玉米粉%去酰胺度肽鍵水解度0102030405060氯化銨硫酸銨尿素牛肉膏大豆蛋白酪素黃豆餅粉蛋白胨%去酰胺度肽鍵水解度黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）16不同。以牛肉膏作為氮源的去酰胺度最高為 50.58%，其次是大豆蛋白為 50.24%，而以大豆蛋白為氮源的肽鍵水解度要低于以牛肉膏為氮源的，而又考慮到大豆分離蛋白的生產(chǎn)規(guī)模大、價(jià)格低等因素，所以選擇大豆蛋白作為最佳氮源。3.1.5 誘導(dǎo)物谷氨酰胺對產(chǎn)酶的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 0.3%1.5%的谷氨酰胺做為誘導(dǎo)物，發(fā)酵產(chǎn)酶，以未加誘導(dǎo)物的為對照，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)

54、果見圖 3-5。圖 3-5 谷氨酰胺對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響由圖 3-5 可見，谷氨酰胺對菌株產(chǎn)酶的去酰胺能力有明顯的促進(jìn)作用，并隨著含量的增加而增大，到 0.9%時(shí)去酰胺度達(dá)到最高為 56.61%，以后變化不明顯；但谷氨酰胺誘導(dǎo)物對其肽鍵水解度的影響不顯著。故選擇誘導(dǎo)物谷氨酰胺的添加量為 0.9%。3.1.6 起始 pH 值對產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 值分別調(diào)節(jié)為 410，發(fā)酵產(chǎn)酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖 3-6。圖 3-6 起始 pH 對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響由圖 3-6 可以看出，培養(yǎng)基起始 pH 值對發(fā)酵產(chǎn)酶的去酰胺度和肽鍵水解度影響較大，pH 值為 7

55、時(shí)去酰胺度最高，pH 值為 68 時(shí)肽鍵水解度較高，且相差不大?？紤]到我們要選擇的是去酰胺能力強(qiáng)而肽鍵水40455055600.00.30.60.91.21.5濃度/%去酰胺度/%510152025肽鍵水解度/%去酰胺度肽鍵水解度5152535455534567891011起始pH值去酰胺度/%510152025肽鍵水解度/%去酰胺度肽鍵水解度黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）17解能力弱的發(fā)酵條件，所以培養(yǎng)基起始 pH 值為 7.0 時(shí)產(chǎn)酶效果最好，為最適 pH 值。3.1.7 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響按照以上得到的結(jié)果，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于 2555下，發(fā)酵產(chǎn)酶，測定其去酰胺度和肽鍵水解

56、度，結(jié)果見圖 3-7。圖 3-7 發(fā)酵溫度對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)溫度能夠顯著影響微生物的生長速率和代謝途徑，過高或過低的培養(yǎng)溫度都會(huì)影響生物體內(nèi)的活性，從而影響產(chǎn)物的合成。由圖 3-7 可見，發(fā)酵溫度為 35時(shí)去酰胺度最高，而肽鍵水解度相對較低，故為最適發(fā)酵溫度。3.1.8 不同裝液量對產(chǎn)酶的影響在 100mL 三角瓶中分別裝入不同體積的培養(yǎng)基，發(fā)酵產(chǎn)酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖 3-8。 圖 3-8 裝液量對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響由圖 3-8 可以看出，裝液量對菌株 SDL-9 發(fā)酵產(chǎn)酶的去酰胺度和肽鍵水解度的影響較大。30mL/100mL 裝液量時(shí)菌種產(chǎn)酶的去酰

57、胺度最高，但肽鍵水解度也較高；而35mL/100mL 裝液量時(shí)菌種產(chǎn)酶的去酰胺度也較高，且肽鍵水解度相對較低，故最佳裝液量為 35mL/100mL。3035404550556010152025303540455055裝液量/mL去酰胺度/%51015202530肽鍵水解度/%去酰胺度肽鍵水解度303540455055202530354045505560溫度/去酰胺度/%51015202530肽鍵水解度/%去酰胺度肽鍵水解度黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）183.1.9 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速在 100r/min240r/min 范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，測定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解

58、度，結(jié)果見圖 3-9。圖 3-9 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對 SDL-9 產(chǎn)酶的影響由圖 3-9 可見，搖床轉(zhuǎn)速對菌株 SDL-9 發(fā)酵產(chǎn)酶的去酰胺度和肽鍵水解度的影響較大。轉(zhuǎn)速為 220r/min 時(shí)去酰胺度最高(61.51%)，其次是 200r/min(61.16%)，且二者相差不大，考慮到搖床本身的情況，故選擇 200r/min 為最佳搖床轉(zhuǎn)速為。3.2 高去酰胺堿性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究3.2.1 酶的最適作用溫度分別在不同溫度(1560)下測定酶液去酰胺度，結(jié)果見圖 3-10。由圖 3-10 可知， 40時(shí)該酶的去酰胺度最高，為最適作用溫度，在 3545之間該酶均具有較高去酰胺能力，60時(shí)該酶的去酰胺

59、能力較低。25303540455055606515202530354045505560溫度/去酰胺度/%圖 3-10 溫度對酶促反應(yīng)的影響3.2.2 酶的最適作用 pH 值在不同 pH 值(412)的緩沖體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定去酰胺度，結(jié)果見圖 3-11。由圖 3-11 可以看出，pH 對該酶的去酰胺度影響較大，酸性條件(pH46)下該酶3540455055606580100120140160180200220240260轉(zhuǎn)數(shù)/rpm去酰胺度/%5101520253035肽鍵水解度/%去酰胺度肽鍵水解度黑龍江東方學(xué)院學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）19的去酰胺能力較弱，堿性條件(pH811)下該酶的

60、去酰胺能力較強(qiáng)，說明該酶具有較強(qiáng)的耐堿性，其中 pH 值為 9 時(shí)該酶的去酰胺能力最強(qiáng)，為最適作用 pH。253035404550556045678910111213pH去酰胺度/%圖 3-11 pH 對酶促反應(yīng)的影響3.2.3 酶的熱穩(wěn)定性將適當(dāng)稀釋的酶液分別在不同溫度(4080)下保溫 2h，每隔 20min 取樣，測定酶促反應(yīng)的去酰胺度，結(jié)果見圖 3-12。由圖 3-12 可以看出，該酶在 40保溫 2h，去酰胺能力下降不明顯，保留了 80%以上；在 50下保溫 2h 后相對去酰胺度降至52.3%；60保溫 2h 后去酰胺能力僅存 5.4%；而在 70下保溫 60min 和 80下保溫4