1、蚤休皂苷對(duì)氧化損傷臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化的影響         09-08-30 16:39:00     編輯：studa20                    作者：高琳琳，李福榮，康莉，司艷紅，王浩 【摘要】  目的利用激光共聚焦顯微鏡研究蚤休皂

2、苷（Pa）對(duì)H2O2誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304細(xì)胞）損傷的鈣離子（Ca2+）的變化及其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，建立氧化損傷的細(xì)胞模型，然后分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組：正常對(duì)照組；氧化損傷組；高濃度蚤休皂苷（1 g/ml）組 ；中濃度蚤休皂苷（100 pg/ml）組；低濃度蚤休皂苷（10 pg/ml）組；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察其細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)差異。并利用激光共聚焦顯微鏡觀察、圖像分析儀分析各實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞中游離Ca2+的表達(dá)、激光共聚焦顯微鏡描記預(yù)處理前后Ca2+的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果損傷組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常組(P<0.01)，而各蚤休皂苷預(yù)處理組均使Ca2+熒光強(qiáng)

3、度下降，顯著低于損傷組(P<0.01)，并呈劑量依賴性效應(yīng)。H2O2損傷劑量的刺激下，ECV304胞漿內(nèi)的游離Ca2+呈現(xiàn)雙相變化：由靜息狀態(tài)持續(xù)增加到峰值，F(xiàn)為37.22±3.72，平臺(tái)期與靜息狀態(tài)熒光值的變化P為7.65±0.69，加入蚤休皂苷預(yù)處理10 min后，再加入100 mol/L的H2O2 ，F(xiàn)和P均明顯下降(P<0.01)。結(jié)論蚤休皂苷可以保護(hù)H2O2造成的ECV304細(xì)胞的氧化損傷，與抑制了鈣離子介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)，達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抗動(dòng)脈粥樣硬化的目的。 【關(guān)鍵詞】  蚤休皂苷 內(nèi)皮細(xì)胞 凋亡 鈣離子 動(dòng)脈粥樣硬化Abstract：

4、ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of Pariphyllin （Pa）on calcium ion density in injury ecv304 induced by hydrogen peroxide.MethodsECV304 cells were cultured in vitro, the oxidative injury was built by hydrogen peroxide (H2O2）,cells were divided into five experimental groups:1.normal,

5、2.oxidative damage group,3.high density Pariphyllin（1 g/ml）,4.medium density Pariphyllin （100 pg/ml）and 5.low density Pariphyllin（10pg/ml）.Laser confocal microscopy(LCM) was used to observe quiet state and dynamic change of the density of calcium ion (Ca2+).Results The LCM showed that in damaged gro

6、up, the external Ca2+ concentation was the highest,but in pretreated groups,it was decreased in dose dependent manner（P<0.01）.H2O2 elicited an transient peak of Ca2+i and then fell to a subsequent sustained higher plateau.Pretreatment with pariphyllin（1 g/ml）for 10 minute significantly prevented

7、the transient  increase and sustained the increase of Ca2+i.ConclusionPariphyllin has protective action against oxidative damage of ECV304 induced by H2O2, its mechanism may be related to decreasing the cell apoptosis and inhibiting calcium ion-decreased mediated signal transduction .Key words：

8、 Pariphyllin;   HUVEC;   Apoptosis;    Ca2+;  Atherosclerosis    內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前占主導(dǎo)地位的“損傷-反應(yīng)假說(shuō)”和近來(lái)許多研究 1證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。H2O2可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡在AS發(fā)生發(fā)展中起著重要作用2。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)含蚤休的方劑能夠減輕高脂血癥大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放內(nèi)皮素3。具有保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和抑

9、制主動(dòng)脈中膜平滑肌增殖的功效，從而具有防治動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓病的作用。但對(duì)于蚤休皂苷保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷防治動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步探討中藥蚤休對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察其凋亡的形態(tài)學(xué)差異。并利用激光共聚焦顯微鏡觀察分析各實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞中游離Ca2+的表達(dá)；預(yù)處理前后細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討蚤休皂苷對(duì)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制及其之間的相互關(guān)系。1  材料與儀器1.1  材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304購(gòu)于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心；蚤休干片（購(gòu)于濟(jì)南建聯(lián)藥店），蚤休皂苷（Pariphyllin，Pa）

10、為暗紅色粉狀結(jié)晶，由泰山醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)教研室提取鑒定，每0.5 kg蚤休干片得到皂苷結(jié)晶27 g，純度為98.79%。用RPMI1640（Gibico公司，美國(guó)）培養(yǎng)液稀釋至1 000，100，10 pg/ml，微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20保存?zhèn)溆茫?熒光探針Fluo-3/ AM (Molecular Probes Inc產(chǎn)品，美國(guó))溶于DMSO中，配成貯存液，放于-20冰箱保存；HEPES緩沖液(mmol/L )等試劑購(gòu)于濟(jì)南聯(lián)星生物試劑公司。1.2 儀器激光共聚焦顯微鏡：美國(guó)Bio-Rad  Radiance  2100。2 方法2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)將ECV304細(xì)胞在3

11、7，5%CO2條件下培養(yǎng)，以含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，按每瓶2 ml接種于25 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每48 h更換培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞融合率為70%80%時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)12 h后使細(xì)胞同步化于G0期，然后按分組分別加藥進(jìn)行預(yù)處理24 h，再加入氧化損傷藥物H2O2，終濃度為100 mol/L，作用12 h。細(xì)胞分組如下：正常對(duì)照組:不加任何藥物的培養(yǎng)基；氧化損傷組: H2O2終濃度為100 mol/L；蚤休皂苷高、中、低劑量預(yù)處理組: （1 g/ml，100 pg/ml，10 pg/ml），調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×105×1

12、06個(gè)/ ml。2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的含量 將ECV304制成105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種于35 mm Petri細(xì)胞培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分組加藥同上， 孵育24 h后用HEPES緩沖液洗滌兩遍，加入終濃度為10 mol/L的Fluo-3/AM 37負(fù)載。40 min后再用HEPES緩沖液洗滌2次，立即置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。實(shí)驗(yàn)中選用512線光束掃描成像，圖像分辨率為512×512像素，采集頻率0.20.5 Hz。使用Simple PCI軟件收集Ca2+圖像、分析Ca2+的改變。每個(gè)處理組選取大約30個(gè)細(xì)胞，記錄平均熒光強(qiáng)度，以此來(lái)衡量ECV304內(nèi)游離Ca2+的水平。2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的動(dòng)態(tài)變化 按以上所述負(fù)載ECV304，設(shè)定激光共聚焦顯微鏡激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，掃描方式為時(shí)間掃描，時(shí)間間隔為每5 s一個(gè)循環(huán)，連續(xù)掃描600個(gè)循環(huán)。首先觀測(cè)靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，然后預(yù)先加入終濃度為1 g/ml的蚤休皂苷，10 min 后加入H2O2 ，終濃度為100 mol/L；動(dòng)態(tài)觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+