1、植物細胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng) 園藝植物細胞工程是應(yīng)用細胞生物學和分子生物學方法，園藝植物細胞工程是應(yīng)用細胞生物學和分子生物學方法，借助工程學的試驗方法和技術(shù)，在細胞水平上研究改造園藝借助工程學的試驗方法和技術(shù)，在細胞水平上研究改造園藝植物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產(chǎn)品植物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產(chǎn)品或園藝植物新品種的技術(shù)。分為廣義上的細胞工程和狹義上或園藝植物新品種的技術(shù)。分為廣義上的細胞工程和狹義上的細胞工程。的細胞工程。 廣義上的細胞工程包括：植物組織和器官培養(yǎng)、細胞培廣義上的細胞工程包括：植物組織和器官培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合、亞細胞水平的操

2、作等。狹義上的養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合、亞細胞水平的操作等。狹義上的細胞工程是指細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合（體細胞雜細胞工程是指細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合（體細胞雜交）、染色體操作及制作遺傳轉(zhuǎn)化受體等內(nèi)容。交）、染色體操作及制作遺傳轉(zhuǎn)化受體等內(nèi)容。 第一節(jié)第一節(jié) 園藝植物細胞培養(yǎng)園藝植物細胞培養(yǎng) 在一定條件下，通過人工供給營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，在一定條件下，通過人工供給營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，使離體植物細胞生長繁殖的方法。使離體植物細胞生長繁殖的方法。 細胞培養(yǎng)技術(shù)主要用于研究細胞生長、發(fā)育與分化等細胞培養(yǎng)技術(shù)主要用于研究細胞生長、發(fā)育與分化等理論以及用于植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)。理論以及用于植物次生

3、代謝物質(zhì)生產(chǎn)。一、植物細胞培養(yǎng)一、植物細胞培養(yǎng)(cell culture)的特性：的特性： 1. 植物細胞較微生物細胞大，具有纖維素細胞壁，抗剪切植物細胞較微生物細胞大，具有纖維素細胞壁，抗剪切力差；力差； 2. 細胞生長速度慢，易受微生物污染，有時需用抗生素；細胞生長速度慢，易受微生物污染，有時需用抗生素； 3. 細胞生長的中期及對數(shù)期，易凝聚為直徑達細胞生長的中期及對數(shù)期，易凝聚為直徑達350 um一一400 um 的團塊，懸浮培養(yǎng)較困難；的團塊，懸浮培養(yǎng)較困難； 4. 培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強力通風攪拌；培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強力通風攪拌；并具有群體效應(yīng)并具有

4、群體效應(yīng) 5. 培養(yǎng)細胞產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過程具培養(yǎng)細胞產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。有結(jié)構(gòu)與功能全能性。1 1 二、植物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)基二、植物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)基. 營養(yǎng)需求：營養(yǎng)需求： 植物細胞生長所需營養(yǎng)較微生物細胞復雜，植物細胞生長所需營養(yǎng)較微生物細胞復雜，除水分外，其它營養(yǎng)成分可分為如下幾類除水分外，其它營養(yǎng)成分可分為如下幾類： (1) 無機營養(yǎng)無機營養(yǎng): 如如N、 P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；等； (2) 維生素：如維生素維生素：如維生素B1、B6、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等；、

5、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等； (3) 碳源碳源: 如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等； (4) 天然物天然物: 如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸薺汁、生梨汁及蘋果汁等；荸薺汁、生梨汁及蘋果汁等； (5) 植物激素植物激素: 如生長素如生長素 、赤霉素、細胞分裂素、赤霉素、細胞分裂素 、脫落酸；其它有油菜、脫落酸；其它有油菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸類氨基酸類:

6、如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮氨如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7) 核酸及其水解物核酸及其水解物: 如如DNA、RNA、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶等；呤及胸腺嘧啶等；(8) 其它成分其它成分: 如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋果酸及反丁烯二酸等如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋果酸及反丁烯二酸等. 2. 培養(yǎng)基：培養(yǎng)

7、基： (1)固體培養(yǎng)基：添加瓊脂等固體培養(yǎng)基：添加瓊脂等 (2) 液體培養(yǎng)基：不加瓊脂等液體培養(yǎng)基：不加瓊脂等三、三、 植物細胞培養(yǎng)技術(shù)植物細胞培養(yǎng)技術(shù) 細胞培養(yǎng)技術(shù)主要包括單細胞培養(yǎng)（微室培養(yǎng)、平板細胞培養(yǎng)技術(shù)主要包括單細胞培養(yǎng)（微室培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)）、懸浮培養(yǎng)、培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)）、懸浮培養(yǎng)、固相化培養(yǎng)等多種培養(yǎng)方式。固相化培養(yǎng)等多種培養(yǎng)方式。單細胞培養(yǎng)：單細胞培養(yǎng)：對分離的單細胞進行培養(yǎng)的方法。對分離的單細胞進行培養(yǎng)的方法。（1）單細胞的分離：）單細胞的分離：從葉片直接分離：從葉片直接分離： 采用機械法（將葉片輕輕研碎、然后過濾和離心純化）采用

8、機械法（將葉片輕輕研碎、然后過濾和離心純化）或酶解法（采用果膠酶處理葉片）由葉肉細胞分離。或酶解法（采用果膠酶處理葉片）由葉肉細胞分離。B. 從愈傷組織分離：從愈傷組織分離： 由離體組織獲得愈傷組織，再由愈傷組織分離單細胞由離體組織獲得愈傷組織，再由愈傷組織分離單細胞通過愈傷組織振蕩培養(yǎng)、過濾和離心等步驟分離單細胞。通過愈傷組織振蕩培養(yǎng)、過濾和離心等步驟分離單細胞。單細胞培養(yǎng)方法：單細胞培養(yǎng)方法：（1）平板培養(yǎng)法：分散的植物細胞接種于含薄層固體培）平板培養(yǎng)法：分散的植物細胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過程稱為平板培養(yǎng)法。養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過程稱為平板培養(yǎng)法。 方法是將經(jīng)機械破碎過篩

9、或酶方法是將經(jīng)機械破碎過篩或酶(纖維素酶及果膠酶等纖維素酶及果膠酶等)消消化分散的細胞，洗滌離心除酶，細胞濃縮物經(jīng)計數(shù)及稀化分散的細胞，洗滌離心除酶，細胞濃縮物經(jīng)計數(shù)及稀釋，接種到加熱熔化而剛冷卻至釋，接種到加熱熔化而剛冷卻至35左有的固體培養(yǎng)基左有的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于25含含5CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞即可生長成團?？諝獾呐囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞即可生長成團。（2）看護培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上）看護培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上用針或玻璃毛細管分離單細胞，每個細胞放在一個用針或玻璃毛細管分離單細胞，每個細胞放

10、在一個方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長的愈方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長的愈傷組織上進行培養(yǎng)的方法。傷組織上進行培養(yǎng)的方法。（3）微室培養(yǎng)法：懸）微室培養(yǎng)法：懸浮單細胞接種于凹玻浮單細胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。（4）條件培養(yǎng)：）條件培養(yǎng)： 是指采用條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)單細胞的方法，條件培是指采用條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)單細胞的方法，條件培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入高密度的細胞進行培養(yǎng)，一定時間養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入高密度的細胞進行培養(yǎng)，一定時間后這些細胞就會向培養(yǎng)基中分泌一些物質(zhì)，使培養(yǎng)基條件后

11、這些細胞就會向培養(yǎng)基中分泌一些物質(zhì)，使培養(yǎng)基條件化，簡單的方法是采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)化，簡單的方法是采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6周高密度細胞過周高密度細胞過濾掉，制成液體或固體培養(yǎng)基接種單細胞。濾掉，制成液體或固體培養(yǎng)基接種單細胞。（5）紙橋培養(yǎng)：）紙橋培養(yǎng)： 是用于植物莖尖分生組織細胞培養(yǎng)的方法，也可用于單細是用于植物莖尖分生組織細胞培養(yǎng)的方法，也可用于單細胞。是使濾紙的兩端進入培養(yǎng)基，中央部分露出培養(yǎng)基表胞。是使濾紙的兩端進入培養(yǎng)基，中央部分露出培養(yǎng)基表面，將所要培養(yǎng)的細胞置于濾紙上培養(yǎng)。（面，將所要培養(yǎng)的細胞置于濾紙上培養(yǎng)。（P80，圖，圖5-4）2. 懸浮培養(yǎng)法：懸浮培養(yǎng)法： 植物細胞懸浮培

12、養(yǎng)植物細胞懸浮培養(yǎng)(cell suspension culture) 即植物即植物細胞或小的細胞聚集體在液體培養(yǎng)基中于搖床細胞或小的細胞聚集體在液體培養(yǎng)基中于搖床 上進行懸上進行懸浮培養(yǎng)，使之在體外生長和發(fā)育，并保持良好的分散性。浮培養(yǎng)，使之在體外生長和發(fā)育，并保持良好的分散性。 特點：可以工廠化生產(chǎn)，提供大量一致的細胞特點：可以工廠化生產(chǎn)，提供大量一致的細胞 懸浮細胞的來源：愈傷組織，某個器官或組織，甚懸浮細胞的來源：愈傷組織，某個器官或組織，甚至幼嫩的植株，通過物理或化學的方法進行分離而獲得。至幼嫩的植株，通過物理或化學的方法進行分離而獲得。 (1) 優(yōu)良的懸浮細胞培養(yǎng)體系必需滿足：優(yōu)良的

13、懸浮細胞培養(yǎng)體系必需滿足： A. 懸浮培養(yǎng)物分散性好，細胞團較小，一般由幾十懸浮培養(yǎng)物分散性好，細胞團較小，一般由幾十個以下的細胞組成。個以下的細胞組成。 B. 均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。 C. 生長迅速，懸浮細胞的量一般生長迅速，懸浮細胞的量一般23天甚至更短時天甚至更短時間便可增加一間便可增加一。(2) 培養(yǎng)過程：培養(yǎng)過程：將愈傷組織、無菌苗、吸漲胚胎或外植體芽尖、根尖將愈傷組織、無菌苗、吸漲胚胎或外植體芽尖、根尖及葉肉組織，經(jīng)勻漿器破碎、不銹鋼網(wǎng)過濾，單細胞濾液及葉肉組織，經(jīng)勻漿器破碎、不銹鋼網(wǎng)過濾，單細胞濾液作為按種材料，接種于液體

14、培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。作為按種材料，接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。(3) 懸浮培養(yǎng)特點：懸浮培養(yǎng)特點：培養(yǎng)過程中細胞總數(shù)不斷增加，一定時間后產(chǎn)量達最培養(yǎng)過程中細胞總數(shù)不斷增加，一定時間后產(chǎn)量達最高點，生長趨于停止。然后進行移植繼代培養(yǎng)，其過程表高點，生長趨于停止。然后進行移植繼代培養(yǎng)，其過程表現(xiàn)出嚴格可重復周期性變化，細胞增長規(guī)律與微生物相同，現(xiàn)出嚴格可重復周期性變化，細胞增長規(guī)律與微生物相同，有延滯期、對數(shù)生長期、直線生長期、減慢期及靜止期等有延滯期、對數(shù)生長期、直線生長期、減慢期及靜止期等階段。植物細胞接種時要達到一定細胞濃度，通常為階段。植物細胞接種時要達到一定細胞濃度，通常為0. 25 x

15、l0細胞細胞ml 一一0. 5 x 10細胞細胞m1。細胞生長曲線細胞生長曲線 (4)懸浮培養(yǎng)類型：懸浮培養(yǎng)類型： A. 分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)(Batch culture)： 分批培養(yǎng)是在一個封閉的系統(tǒng)中進行細胞培養(yǎng)。細胞分批培養(yǎng)是在一個封閉的系統(tǒng)中進行細胞培養(yǎng)。細胞材料生長在已固定體積的培養(yǎng)基中。隨著細胞數(shù)量的增材料生長在已固定體積的培養(yǎng)基中。隨著細胞數(shù)量的增加，培養(yǎng)基營養(yǎng)的消耗及某些其他因子的積累會使細胞加，培養(yǎng)基營養(yǎng)的消耗及某些其他因子的積累會使細胞停止生長。停止生長。 繼代培養(yǎng)需取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。生繼代培養(yǎng)需取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。生長過程包括延遲期、指數(shù)期、靜止

16、期等。長過程包括延遲期、指數(shù)期、靜止期等。 分緩慢轉(zhuǎn)動培養(yǎng)（分緩慢轉(zhuǎn)動培養(yǎng)（1-2rpm）、震蕩培養(yǎng)（）、震蕩培養(yǎng)（100rpm）、）、快速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)（快速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)（80-120rpm）和攪拌培養(yǎng)。）和攪拌培養(yǎng)。B. 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)(Continuous culture): 是用一定容積的特定容器中進行是用一定容積的特定容器中進行 細胞培養(yǎng)的方法，在細胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使營養(yǎng)物連續(xù)得到補培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使營養(yǎng)物連續(xù)得到補充，細胞生長和增殖連續(xù)進行，同時有等體積的培養(yǎng)物排充，細胞生長和增殖連續(xù)進行，同時有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。分為封閉式連續(xù)培養(yǎng)和開

17、放式連續(xù)培養(yǎng)。除系統(tǒng)。分為封閉式連續(xù)培養(yǎng)和開放式連續(xù)培養(yǎng)。 最大特點是細胞生長速率標準一致，新形成的細胞補償最大特點是細胞生長速率標準一致，新形成的細胞補償了被排出的細胞，系統(tǒng)內(nèi)細胞密度、生長速度、化學成分、了被排出的細胞，系統(tǒng)內(nèi)細胞密度、生長速度、化學成分、細胞代謝活性都維持恒定?？赏ㄟ^改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件細胞代謝活性都維持恒定?？赏ㄟ^改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件建立恒定系統(tǒng)。建立恒定系統(tǒng)。 化學恒化法：通過營養(yǎng)液或某一成分的含量進行控制?；瘜W恒化法：通過營養(yǎng)液或某一成分的含量進行控制。 濁度恒定法：比濁計或分光光度計測定渾濁度而進行流濁度恒定法：比濁計或分光光度計測定渾濁度而進行流量控制。量控制。

18、C.半連續(xù)培養(yǎng)：半連續(xù)培養(yǎng)： 利用培養(yǎng)罐進行細胞大量培養(yǎng)的一種方式，當培養(yǎng)罐利用培養(yǎng)罐進行細胞大量培養(yǎng)的一種方式，當培養(yǎng)罐內(nèi)細胞數(shù)量增殖到一定量后，倒出一半細胞懸浮液于另內(nèi)細胞數(shù)量增殖到一定量后，倒出一半細胞懸浮液于另一培養(yǎng)罐內(nèi)，再分別加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)，如一培養(yǎng)罐內(nèi)，再分別加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)，如此反復進行再培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)能夠獲得大量均勻一致此反復進行再培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)能夠獲得大量均勻一致的培養(yǎng)細胞。的培養(yǎng)細胞。（5）懸浮培養(yǎng)細胞的同步化：）懸浮培養(yǎng)細胞的同步化：同步化培養(yǎng)室之培養(yǎng)基中同步化培養(yǎng)室之培養(yǎng)基中的大部分細胞都能同時通過細胞周期（的大部分細胞都能同時通過細胞周期（G

19、1、S、G2 和和M）的）的各個階段。實現(xiàn)懸浮細胞同步化的方法有：各個階段。實現(xiàn)懸浮細胞同步化的方法有： A 饑餓法：先對細胞斷絕供應(yīng)一種進行細胞分裂所必需的營饑餓法：先對細胞斷絕供應(yīng)一種進行細胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1或或G2期，經(jīng)過一段時間的饑期，經(jīng)過一段時間的饑餓后，當重新加入該限制因子時，靜止細胞就會同時進行分裂。餓后，當重新加入該限制因子時，靜止細胞就會同時進行分裂。 B 抑制法：使用抑制法：使用DNA合成抑制劑，如合成抑制劑，如5-氨基嘧啶等也可以使氨基嘧啶等也可以使細胞同步化。由于核酸類似物的存在阻止了細胞同步化。由于核酸類似物的存在

20、阻止了DNA的合成，細胞的合成，細胞周期只能進行到周期只能進行到G1期，細胞都滯留在期，細胞都滯留在G1或或S期的邊界，當去除期的邊界，當去除抑制劑后，細胞就進入同步分裂。抑制劑后，細胞就進入同步分裂。 C. 采用發(fā)酵器系統(tǒng)進行同步化：通過充入氮氣的方法控制細采用發(fā)酵器系統(tǒng)進行同步化：通過充入氮氣的方法控制細胞分裂活力，然后恢復普通空氣狀態(tài)時再度分裂。胞分裂活力，然后恢復普通空氣狀態(tài)時再度分裂。 （6）懸浮培養(yǎng)細胞的植株再生：）懸浮培養(yǎng)細胞的植株再生： 懸浮培養(yǎng)細胞形成體細胞胚或誘導形成愈傷組織，然后再懸浮培養(yǎng)細胞形成體細胞胚或誘導形成愈傷組織，然后再由愈傷組織再生植株。由愈傷組織再生植株。（

21、7）影響懸浮培養(yǎng)的因素：）影響懸浮培養(yǎng)的因素：A 培養(yǎng)基：通常需要高硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，以及含磷量高的培養(yǎng)培養(yǎng)基：通常需要高硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，以及含磷量高的培養(yǎng)基?；?。B. 細胞密度：最低密度為細胞密度：最低密度為0.5105 1.0105 。C. 植物激素和其他附加成分植物激素和其他附加成分: 添加適當濃度的激素和氨基酸。添加適當濃度的激素和氨基酸。D. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基pH值：通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)比例或加入化學成分穩(wěn)定值：通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)比例或加入化學成分穩(wěn)定pH值。值。E . CO2濃度：低密度培養(yǎng)中，濃度：低密度培養(yǎng)中，CO2對于誘導細胞分裂有較大的對于誘導細胞分裂有較大的影響，需控制適當濃度。影響，需控制

22、適當濃度。3. 固相化培養(yǎng)技術(shù)：固相化培養(yǎng)技術(shù)： 細胞固定在一定的惰性基質(zhì)中，如瓊脂、海藻酸鹽、細胞固定在一定的惰性基質(zhì)中，如瓊脂、海藻酸鹽、聚丙烯酰氨纖維膜上，細胞不能運動，但營養(yǎng)液可以在聚丙烯酰氨纖維膜上，細胞不能運動，但營養(yǎng)液可以在基質(zhì)中流動。基質(zhì)中流動。（1）固相化培養(yǎng)的特點：）固相化培養(yǎng)的特點： A. 消除剪切力；消除剪切力； B. 細胞生長緩慢，促進次生代謝過程；細胞生長緩慢，促進次生代謝過程； C. 細胞之間緊密接觸，形成梯度，利于產(chǎn)物積細胞之間緊密接觸，形成梯度，利于產(chǎn)物積累；累； D. 便于操作，不易污染。便于操作，不易污染。 E. 便于產(chǎn)物收集。便于產(chǎn)物收集。 第二節(jié)第二節(jié)

23、 園藝植物原生質(zhì)體培養(yǎng)園藝植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 通過一定方法除去細胞壁，而得到一個裸露的植物細胞，通過一定方法除去細胞壁，而得到一個裸露的植物細胞，即為原生質(zhì)體即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體在一定條件下培。游離的原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)可以重新形成細胞壁，并像正常的植物細胞那樣具有全能養(yǎng)可以重新形成細胞壁，并像正常的植物細胞那樣具有全能性，經(jīng)過適當?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。性，經(jīng)過適當?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。蝴蝶蘭原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生蝴蝶蘭原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生 （圖片引自（圖片引自Plant Cell Reports，2007，26：719-725）非洲百合原生質(zhì)體培養(yǎng)

24、和植株再生非洲百合原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生（Agapanthus praecox）（圖片引）（圖片引自自Plant Cell, Tissue and Organ Culture ，2003，72（1）：）：63-69）球根鳶尾原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生（圖片引自球根鳶尾原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生（圖片引自Euphytica，1999，105: 99102）針葉石竹葉片原生質(zhì)體培針葉石竹葉片原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生（圖片引自養(yǎng)及植株再生（圖片引自In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant 2005, 41:794800）仙客來原生質(zhì)體培養(yǎng)及體胚途仙客來原生質(zhì)體培養(yǎng)及體胚途徑再生（圖標引自徑

25、再生（圖標引自Plant Cell Tiss Organ Cult, 2010, 101:171182） 一、原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義一、原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義 （1）原生質(zhì)體可以作為體細胞無性系變異和突變體篩選）原生質(zhì)體可以作為體細胞無性系變異和突變體篩選的材料；的材料； （2）利用原生質(zhì)體不具細胞壁的特性可以進行細胞器移）利用原生質(zhì)體不具細胞壁的特性可以進行細胞器移植和外源物的攝取植和外源物的攝取(病毒、微生物、外源遺傳物質(zhì)病毒、微生物、外源遺傳物質(zhì))；（3）原生質(zhì)體之間可以進行融合而產(chǎn)生雜種細胞）原生質(zhì)體之間可以進行融合而產(chǎn)生雜種細胞(即體細即體細胞雜交）。胞雜交）。（4）是植物基因工程的理想受體

26、，用外源遺傳物質(zhì)對植）是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對植物原生質(zhì)體進行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導分裂、分化再生物原生質(zhì)體進行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。出能育的完整基因工程植株。（5）也是研究細胞生物學、分子生物學、體細胞無性系）也是研究細胞生物學、分子生物學、體細胞無性系變異和植物病理學研究的有用工具。變異和植物病理學研究的有用工具。 自自1970年首次獲得原生質(zhì)體再生植株成功以來，通過年首次獲得原生質(zhì)體再生植株成功以來，通過原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有余種，其中有20種種為我國首先報道。為我國首先報道。

27、原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過程。過程。(一一) 原生質(zhì)體的制備：原生質(zhì)體的制備：1、材料來源與預處理：、材料來源與預處理：（1）材料來源：）材料來源： 可以采用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組可以采用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織?？椉皯腋∨囵B(yǎng)細胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。 （2）預處理：預處理： A.預質(zhì)壁分離預質(zhì)壁分離：17-20 酶液中靜置半小時，再于酶液中靜置半小時，再于2834保保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預培養(yǎng)溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液

28、中糖濃度相同的溶液中預培養(yǎng)1h左右，再浸左右，再浸于酶液中消化即可達到質(zhì)壁分離目的；于酶液中消化即可達到質(zhì)壁分離目的； B. 預培養(yǎng)預培養(yǎng): 將除去下表皮的葉片于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)將除去下表皮的葉片于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高；天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高； C. 暗處理暗處理: 將室溫下生長將室溫下生長57個星期的植物材料在黑暗中放置個星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力；以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力； D.D.光處理光處理: 將葉片于日光或燈光下照射將葉片于日光或燈光下照射26h令其萎蔫，

29、利于撕令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離；除下表皮及原生質(zhì)體分離； E.E.低溫處理低溫處理: 夏季應(yīng)用的實驗材料其萌動種子應(yīng)于夏季應(yīng)用的實驗材料其萌動種子應(yīng)于4過夜后再播過夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。2. 制備原生質(zhì)體的酶類：制備原生質(zhì)體的酶類： 高等植物細胞壁主要成分為高等植物細胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維纖維素，其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細胞生長的不同階段及不同物種素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細胞生長的不同階段及不同物種的細胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細胞壁的細胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加

30、厚的細胞壁不被酶消化，故選擇消化細胞壁的酶類是制備原生質(zhì)體不被酶消化，故選擇消化細胞壁的酶類是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。關(guān)鍵。（引自（引自K.-H. Neumann et al., Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2009）常用的酶類有：常用的酶類有：A. 纖維素酶（纖維素酶（Cellulase ），如），如Onozuka R10及及RS，國內(nèi)常，國內(nèi)常用的為用的為EA3867，其中含少量果膠酶；，其中含

31、少量果膠酶；B. 果膠酶（果膠酶（Pectinase ），如），如Macerozyme R-10 又叫離析酶，又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過2，作用時間長有毒害作用；此外亦用作用時間長有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y23，也叫離，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為01，懸浮細胞為，懸浮細胞為005；C. 崩潰酶（崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；膠酶活性；D. 半纖維素酶（半纖維素酶（Hemic

32、ellulase），如），如Rhozyme HP150，用于，用于懸浮細胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細胞原生質(zhì)體的分離懸浮細胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細胞原生質(zhì)體的分離;E 蝸牛酶（蝸牛酶（Snailase），是一種混合酶，它含有纖維素酶，果），是一種混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶主要用于體細胞原生質(zhì)體多種酶主要用于體細胞原生質(zhì)體分離。分離。 酶液配制：酶液配制： 需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl22H20(0. 1mmol/l一一10mo1l)及及KH2PO4 (0.

33、75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。 酶液酶液pH值相當重要，纖維素酶及果膠酶單獨使用時，其值相當重要，纖維素酶及果膠酶單獨使用時，其pH分別以及為宜；混合使用時為宜，降至分別以及為宜；混合使用時為宜，降至48以下則原生以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔膜過濾除菌，而不微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法?？刹捎眉訜釡缇?。 3原生質(zhì)體分離及純化原生質(zhì)體分離及純化（1）分離：）分離： 原生質(zhì)體分離有機械法及酶消化法，前原生質(zhì)體分離有機械法及酶消化法，前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分者產(chǎn)量極低而不多用、

34、后者又分步法及二步法。步法及二步法。 一步法是將材料在一步法是將材料在2l一一28用纖維素酶及果膠酶混合用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理液一次性處理224h。 二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細胞，二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。（引自（引自K.-H. Neumann et al., Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag Berlin Heidel

35、berg 2009）（3）純化）純化 需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)(100目一目一400目目)濾除較大雜物后濾除較大雜物后再洗滌純化。再洗滌純化。 A. 離心法離心法: 原生質(zhì)體混合物于原生質(zhì)體混合物于500l000 rpm離心離心5min,吸去上層液，吸去上層液，沉淀再用與酶液具有相同糖濃度溶液反復洗滌沉淀再用與酶液具有相同糖濃度溶液反復洗滌3一一4次，最后用原生質(zhì)體次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌備用；培養(yǎng)液洗滌備用； B. 飄浮法飄浮法: 離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細胞離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細胞時可用時可用20蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面碎片及老細胞

36、沉降而得以蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面碎片及老細胞沉降而得以純化，但產(chǎn)量低，有時對原生質(zhì)體造成損傷；純化，但產(chǎn)量低，有時對原生質(zhì)體造成損傷； C. 界面法界面法: 利用高分子聚合物混合液產(chǎn)生兩相水溶液的原理，將原生利用高分子聚合物混合液產(chǎn)生兩相水溶液的原理，將原生質(zhì)體混合物置于葡聚糖及質(zhì)體混合物置于葡聚糖及PEG混合液中離心，即可從兩相界面獲得高純混合液中離心，即可從兩相界面獲得高純度原生質(zhì)體；度原生質(zhì)體； D. 滴洗法滴洗法: 原生質(zhì)體混合物置于孔徑原生質(zhì)體混合物置于孔徑8um濾器中，用洗液以濾器中，用洗液以l-2滴滴秒速度自然過濾洗滌，其過程勿使濾干，洗至一定程度后，用原生質(zhì)體秒速度自然過濾

37、洗滌，其過程勿使濾干，洗至一定程度后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)液混合備用。此法原生質(zhì)體破碎少。培養(yǎng)液混合備用。此法原生質(zhì)體破碎少。Leaves slit into thinstrips and placed inenzyme solution Well digested leavesP ellet contains debrisTube after centrifugationof protoplasts with sucroseBand of protoplastsClose-up of band of protoplasts floated up on sucrose 4原生質(zhì)體活力測定原生質(zhì)體活力

38、測定 純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測定后方可用于培養(yǎng)測定方法有；純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測定后方可用于培養(yǎng)測定方法有；（1）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力：來源于葉片的原生質(zhì)體，：來源于葉片的原生質(zhì)體，呈綠色及圓而鼓者為活原生質(zhì)體；來源于愈傷組織及懸浮細胞者，呈綠色及圓而鼓者為活原生質(zhì)體；來源于愈傷組織及懸浮細胞者，胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流及布朗運動活躍者活力較高；胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流及布朗運動活躍者活力較高；（2）活體染色法）活體染色法：用：用0. 1酚番紅或伊文思藍染色、不著色酚番紅或伊文思藍染色、不著色者為活原生質(zhì)體，染色者為無活力原生質(zhì)體；者為活原生質(zhì)體，染色者為無活力原生質(zhì)體；（3）熒光

39、染料活休染色法）熒光染料活休染色法：用雙醋酸熒光素染色，染料可：用雙醋酸熒光素染色，染料可自由透過細胞膜，在細胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自由自由透過細胞膜，在細胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過細胞膜而滯留于細胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強度即可透過細胞膜而滯留于細胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強度即可判斷原生質(zhì)體死活。判斷原生質(zhì)體死活。5. 影響原生質(zhì)體體產(chǎn)量和活力的因素：影響原生質(zhì)體體產(chǎn)量和活力的因素：（1）材料來源：選擇幼嫩組織分離原生質(zhì)體，或）材料來源：選擇幼嫩組織分離原生質(zhì)體，或快速生長愈傷組織或?qū)?shù)期懸浮細胞?？焖偕L愈傷組織或?qū)?shù)期懸浮細胞。（2）酶處理：酶的種類和濃度

40、，處理時間，）酶處理：酶的種類和濃度，處理時間，pH等等條件。條件。（3）滲透穩(wěn)定劑：酶液、原生質(zhì)體清洗液和原生）滲透穩(wěn)定劑：酶液、原生質(zhì)體清洗液和原生質(zhì)體培養(yǎng)液均需保持適當?shù)臐B透壓。質(zhì)體培養(yǎng)液均需保持適當?shù)臐B透壓。（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)：（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)： 1. 培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：（1）固體培養(yǎng)）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，：平板培養(yǎng)法，1. 2%瓊脂瓊脂, 45 oC.（2）液體培養(yǎng)：）液體培養(yǎng)： A. 淺層培養(yǎng)法淺層培養(yǎng)法: 其過程是將其過程是將1m1原生質(zhì)體懸液置于直徑原生質(zhì)體懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或培養(yǎng)皿或25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)初期振搖三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)初

41、期振搖12次，防止粘壁；次，防止粘壁； B. 懸滴培養(yǎng)法懸滴培養(yǎng)法:其過程系將原生質(zhì)體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其量分別為其過程系將原生質(zhì)體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其量分別為5一一10、50100及及100一一200 ul等，保持一定滴距每皿由幾滴至十幾滴不等，等，保持一定滴距每皿由幾滴至十幾滴不等，培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； C. 雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法: 先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻成層，再將原生質(zhì)體懸先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻成層，再將原生質(zhì)體懸浮液置于已固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；浮液置于已固

42、化培養(yǎng)基上培養(yǎng)； D. 看護培養(yǎng)法看護培養(yǎng)法: 在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理已失去分裂能在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理已失去分裂能力而有代謝活力的原生質(zhì)體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，再于其上接種一層低密度力而有代謝活力的原生質(zhì)體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，再于其上接種一層低密度(5一一lo個細胞個細胞m1)懸浮原生質(zhì)體培養(yǎng)。懸浮原生質(zhì)體培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)常規(guī)方法與包埋球培養(yǎng)（圖片引自原生質(zhì)體培養(yǎng)常規(guī)方法與包埋球培養(yǎng)（圖片引自Plant Cell Reports，2007，26：719-725） 榆樹原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)（圖片引自榆樹原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)（圖片引自Plant Cell Tiss O

43、rgan Cult，2006, 86: 359366）2. 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件： 密度：密度： 平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)103104個個/ml, 液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)104105個個/ml溫度：溫度： 多數(shù)為多數(shù)為25-28 oC, 少數(shù)少數(shù)1637 oC光照：光照：500 lx,18h 或或2800 lx 連續(xù)光照連續(xù)光照 多數(shù)要求多數(shù)要求 黑暗或弱光黑暗或弱光3. 細胞壁再生及細胞分裂：細胞壁再生及細胞分裂： l一一3天即再生新細胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢天即再生新細胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓?？捎觅|(zhì)壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實。也可用圓?？捎觅|(zhì)壁分離法或在稍微低滲

44、溶液中出芽現(xiàn)象證實。也可用0. 1% ST型或型或WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細胞壁者在型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍色熒光。經(jīng)后者染色，有細胞壁者發(fā)射綠色熒光。熒光顯微鏡下呈藍色熒光。經(jīng)后者染色，有細胞壁者發(fā)射綠色熒光。 在原生質(zhì)培養(yǎng)過程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)在原生質(zhì)培養(yǎng)過程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細胞核周圍常在含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細胞核周圍常在1一一2周內(nèi)發(fā)生第一次周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細胞分裂頻率不同，常在分裂。不同細胞分裂頻率不同，常在190之間。之間。（引自（引自K.-H. Neuman

45、n et al., Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2009）4. 愈傷組織形成及胚狀體形成愈傷組織形成及胚狀體形成 原生質(zhì)體再生的細胞一旦開始分裂，就可能繼續(xù)生長：原生質(zhì)體再生的細胞一旦開始分裂，就可能繼續(xù)生長： A .形成細胞團，發(fā)育成愈傷組織；愈傷組織通過器官形成細胞團，發(fā)育成愈傷組織；愈傷組織通過器官發(fā)生或體細胞配途徑形成再生植株。發(fā)生或體細胞配途徑形成再生植株。 B. 形成胚狀體，再產(chǎn)生

46、植株；形成胚狀體，再產(chǎn)生植株； 隨著細胞分裂及細胞團形成，已與常規(guī)細胞和組織培養(yǎng)相同，隨著細胞分裂及細胞團形成，已與常規(guī)細胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)故培養(yǎng)34周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細胞周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細胞的營養(yǎng)，亦利于細胞團及小愈傷組織的生長。的營養(yǎng)，亦利于細胞團及小愈傷組織的生長。 5. 植株再生植株再生 除少數(shù)植物通過胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)除少數(shù)植物通過胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)愈傷組織誘導分化形成芽及根再生為完整植株。當愈傷組織愈傷組織誘導分化形成芽及根再生為完整植株。當愈傷組織達到達到12mm時，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導

47、器官分化。分化培時，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于：養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于： (1) 只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑；只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑； (2) 與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細胞分裂素濃度高于生長素與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細胞分裂素濃度高于生長素; (3) 在誘導器官分化過程中，一般采用在誘導器官分化過程中，一般采用15001x左右的高光強。左右的高光強。誘導器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。誘導器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。 無根苗轉(zhuǎn)移至誘導生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃無根苗轉(zhuǎn)移至誘導生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃度生長素

48、，而不含細胞分裂素，無根苗一旦生根即可發(fā)育成度生長素，而不含細胞分裂素，無根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。完整植株。 在外界因素作用下，兩個或兩個以上植物細胞合并成一個多核細胞的過程稱為植物細胞融合，或植物體細胞雜交。但由于植物細胞具有堅硬的細胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細胞壁釋放出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學特性與完整細胞基本相同。在適當條件下來源不同的植物原生質(zhì)體可產(chǎn)生融合作用，并可再生細胞壁，形成完整植株。植物體細胞雜交的過程植物體細胞雜交的過程植物植物細胞細胞A A植物植物細胞細胞B B原生原生質(zhì)體質(zhì)體A A原生原生質(zhì)體質(zhì)體B B原生質(zhì)原生質(zhì)體融合體融合正在融合的正在融合的原

49、生質(zhì)體原生質(zhì)體再生出再生出細胞壁細胞壁雜種雜種細胞細胞愈傷愈傷組織組織雜種雜種植株植株去掉細胞壁去掉細胞壁植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)植物細胞融合植物細胞融合特點：特點：(1) 可實現(xiàn)遠緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配可實現(xiàn)遠緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性；子不親合性；(2) 可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質(zhì)雜種，且獲可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質(zhì)雜種，且獲得的遺傳變異范圍極廣；得的遺傳變異范圍極廣；(3)一次操作可實現(xiàn)兩個以上親本的融合作用一次操作可實現(xiàn)兩個以上親本的融合作用(4) 可獲得呈現(xiàn)雙親個體基因型總和的雜種；可獲得呈現(xiàn)雙親個體基因型總和的雜種；(5) 可形成有

50、性生殖障礙植物的種間雜種；可形成有性生殖障礙植物的種間雜種；一、細胞融合技術(shù) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)過程，有時無需任何處理亦產(chǎn)生融合現(xiàn)象，為自發(fā)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)過程，有時無需任何處理亦產(chǎn)生融合現(xiàn)象，為自發(fā)融合，但融合率極低。異源原生質(zhì)體融合需某種外力作用才能實現(xiàn)。融合，但融合率極低。異源原生質(zhì)體融合需某種外力作用才能實現(xiàn)。1. 化學融合化學融合（1）鹽類融合法：硝酸鹽（如）鹽類融合法：硝酸鹽（如NaNO3）、氯化物（如氯化物（如NaCl等）等） 可中和原可中和原生質(zhì)體表面負電荷，促進原生質(zhì)體聚集，對原生質(zhì)體無損害，可以用于生質(zhì)體表面負電荷，促進原生質(zhì)體聚集，對原生質(zhì)體無損害，可以用于融合，但融合率低；融合，但融合率低；（2）高）高Ca2和高和高pH值誘導，如煙草葉肉原生質(zhì)體于，值誘導，如煙草葉肉原生質(zhì)體于，0.05 mol/LCaCl2 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，37 保溫，融合率可達保溫，融合率可達25，并可獲得雜種，并可獲得雜種植株；植株； (3) PEG誘導，在高濃度誘導，在高濃度