1、三氧化二砷對人宮頸癌Hela細(xì)胞的放射增敏作用作者：湯繼英1,2， 潘東風(fēng)1， 石小燕1， 王賢和1， 陳 萍1* 作者單位：(1鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 十堰 442000;2湖北中醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430061)【摘要】 目的：探討三氧化二砷(As2O3)對人宮頸癌Hela細(xì)胞的放射增敏作用及其機制。方法：MTT法確定As2O3對Hela細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(ID50);克隆形成法觀察20%ID50的As2O3對Hela細(xì)胞的放射增敏作用;流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。結(jié)果：細(xì)胞生長抑制率隨As2O3濃度增加而增高; As2O3+照射組的細(xì)胞存活率、D0值和Dq值均小于單純照射組(P&

2、lt;0.05);存活曲線肩區(qū)(Dq)變小，放射增敏比(SER)為1.39;As2O3和-射線均能使細(xì)胞阻滯在G2/M期，聯(lián)合應(yīng)用比單獨應(yīng)用抑制作用顯著(P<0.01)。結(jié)論：As2O3對宮頸癌Hela細(xì)胞株有明顯的放射增敏作用;可能與As2O3改變細(xì)胞周期有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】 三氧化二砷;宮頸癌;Hela細(xì)胞;放射增敏劑Irradiation Enhancement of Arsenic Trioxide on Human Cell Line of Cervical Cancer TANG Ji-ying1,2,PAN Dong-feng1,SHI Xiao-yan1,WANG Xian-

3、he1,CHEN Ping1* (1Department of Oncology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan,Hubei 430061,China)Abstract: Objective To investigate the irradiation enhancement effect of arsenic trioxide on human cervical carcinoma Hela cell

4、s and its possible mechanism.Methods MTT assay was used to measure the survival rate of the cervical carcinoma Hela cells.Then the half inhibitory dosage (ID50)was calculated.Colony forming assay was carried out to take count of survival fraction.Cell survival curve was analyzed with Multi-target si

5、ngle-hit model and then sensitive enhancement ratio(SER) was calculated.Flow cytometry was performed to assess the influence of arsenic trioxide on cell cycle distribution. Results (1)Inhibitory effect of arsenic trioxide on cell proliferation was in a dose-dependent manner.(2)Cell survival rate was

6、 lower after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone,Dq and D0 value were decreased after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone(Dq :1.03 Gy vs 1.89 Gy, D0 :2.49 Gy vs 3.45 Gy),with SER being

7、 1.39.(3)Both Gy 60Co - and 2mol/L arsenic trioxide could arrest Hela cell to G2/M as assayed by flow cytometry.The inhibitory effect was much more obvious when arsenic trioxide and irradiation were combined than either of them was used alone. Conclusion Arsenic trioxide is able to enhance radiation

8、 effect obviously on human cervical squamous carcinoma Hela cells,which may be due to its regulation on cell cycle.Key words:Arsenic trioxide;Cervical carcinoma;Hela cell;Radiosensitizer宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，治療以手術(shù)及放療為主，lIa期以上多采用放療。目前臨床上提高腫瘤的放射敏感性主要利用化療藥物如順鉑、泰素等，但是由于化療藥物對正常細(xì)胞的毒性作用較大，且與放療的副反應(yīng)有協(xié)同作用，病人一般難以耐受。

9、近年來研究發(fā)現(xiàn)許多中草藥具有抗腫瘤、放療增效等作用, 三氧化二砷(As2O3)就是其中的一種。As2O3是中藥砒霜的主要成分，對卵巢癌、惡性膠質(zhì)瘤、淋巴瘤等1-3腫瘤的放療具有增敏效應(yīng)，但其在宮頸癌方面的研究則較少。本研究擬觀察As2O3對Hela細(xì)胞的放射增敏作用,并探討其可能的作用機制。1 材料與方法1.1 材料人宮頸癌Hela細(xì)胞(武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤研究所);亞砷酸氯化鈉注射液(哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司，用生理鹽水配制成1 mmol/L的儲存液，4 冰箱備用，使用前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度);GWXJ80型60Co遠(yuǎn)距離治療機;流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coluter公司)。1.2

10、細(xì)胞培養(yǎng)及照射條件宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于含5%CO2的37 溫箱中培養(yǎng)。60Co遠(yuǎn)距離治療機室溫下照射，-射線的劑量率40 cGy/min。1.3 Hela細(xì)胞對As2O3藥物敏感性測定亞砷酸氯化鈉注射液稀釋至0.5、1、5、10、25、50 、75 、100 mol/L 8個濃度，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜(每孔1×l04個細(xì)胞，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液200 L)，次日換液,加As2O3使其終濃度如上。培養(yǎng)48小時后每孔加入MTT

11、(5 g/L) 20 l，繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 200 L，振動10 min后酶標(biāo)儀檢測波長為572 nm的吸光度值，計算細(xì)胞抑制率。抑制率=1-(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%，繪圖后求半數(shù)致死劑量(ID50)值。1.4 克隆形成法觀察放射增敏作用按放療劑量0、1、2、4、6、8 Gy分為6個組，于25 cm2培養(yǎng)瓶中分別接種不同數(shù)量的細(xì)胞，每組設(shè)3個平行樣本，每個劑量組分別設(shè)單純照射(單放組)和照射+2 mol/L As2O3(藥放組)，待細(xì)胞貼壁后藥放組加入As2O3，使其終濃度為20%ID50，24 h后接受照射，照射后24

12、h棄掉含藥物的培養(yǎng)液，換含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1113 d后固定、染色，計數(shù)含50個細(xì)胞以上的克隆數(shù)。存活分?jǐn)?shù)的計算方法為：處理組克隆形成率/對照組克隆形成率，采用“多靶單擊模型4”擬合細(xì)胞存活曲線，計算放射增敏比(SER)。“多靶單擊模型”方程：SF=1-(1-e-D/D0)N, Dq=D0N，其中SF為細(xì)胞存活率，D為放射劑量(Gy)，D0代表平均致死量，Dq代表準(zhǔn)域劑量，N為外推數(shù)。1.5 細(xì)胞周期分析將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，分為空白組、As2O3組(單藥組)、單純照射(單放組)、照射+2 mol/L As2O3(藥放組)，每個組設(shè)3個平行樣本，待細(xì)胞貼壁后藥

13、物干預(yù)組加藥， 終濃度為2 mol/L As2O3，24 h后單放及藥放組接受2 Gy放療，收集處理后的1.0×106個細(xì)胞用PBS清洗2次(1 500 r/min，5 min)，加入70%冷乙醇4 固定過夜，清洗去除固定液，加入PBS 100 L混勻細(xì)胞，再加入10 g/L RNAase 2 L，充分混勻，置37 水浴鍋中加溫30 min，加碘化丙啶(PI)染色液 (20 g/mL)，常溫避光30 min后，流式細(xì)胞儀檢測，Multicycle軟件分析，結(jié)果以細(xì)胞周期各時相細(xì)胞百分率表示。1.6 統(tǒng)計學(xué)方法所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式表示，Execl軟

14、件模擬細(xì)胞生長抑制曲線，SPSS 13.0軟件模擬生存曲線并進行方差分析，以P<0.05為差別有顯著性，以P<0.01為差別有極顯著性差異。2 結(jié)果2.1 Hela細(xì)胞對As2O3藥物敏感性細(xì)胞生長抑制率隨As2O3濃度的增加而增大，繪圖后求半數(shù)致死劑量(ID50)值10.86 mol/L(見圖1)。圖1 三氧化二砷對Hela細(xì)胞的生長抑制2.2 As2O3對Hela細(xì)胞的放射增敏作用放射劑量-細(xì)胞存活曲線見圖2，多靶單擊模型主要參數(shù)見表1。結(jié)果顯示As2O3對宮頸癌Hela細(xì)胞有放射增敏作用，經(jīng)藥物處理后平均致死劑量(D0)降低，存活曲線肩區(qū)(Dq)變小。表1 照射后Hela細(xì)胞

15、存活曲線主要參數(shù)2.3 細(xì)胞周期分析流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明，放射及藥物均能提高G2/M期的細(xì)胞比例，二者聯(lián)合能顯著提高效果(P<0.01)(見表2)。表2 As2O3與放療對Hela細(xì)胞周期的影響(%)3 討論As2O3是中藥砒霜的主要成分，其臨床適應(yīng)癥不僅僅局限于白血病的治療，對實體瘤的臨床應(yīng)用研究也日趨增多。有關(guān)As2O3對細(xì)胞殺傷機制的研究大多與As2O3具有放射增敏效應(yīng)有關(guān)1-3，但As2O3對宮頸癌放射增敏的研究報道甚少5。本研究利用 MTT法確定As2O3對宮頸癌細(xì)胞系Hela的細(xì)胞毒作用,證實細(xì)胞生長抑制隨As2O3濃度的增加而增強，48 h半數(shù)致死劑量(ID50)

16、值10.86 umol/L,說明As2O3與放射治療聯(lián)合對宮頸癌具有增敏作用?！岸喟袉螕裟Ｐ汀睌M合經(jīng)典的細(xì)胞存活曲線,其參數(shù)D0值為平均致死劑量,是一次照射能殺滅63%的細(xì)胞或37%細(xì)胞存活的劑量;Dq值是肩寬參數(shù),它表明細(xì)胞亞致死損傷修復(fù)能力的大小,Dq值小表明細(xì)胞對亞致死損傷的修復(fù)能力較弱，本實驗存活曲線參數(shù)亦證實了As2O3對離體宮頸癌細(xì)胞的放射增敏作用。提示As2O3通過抑制Hela細(xì)胞的修復(fù)而起到放射增敏作用。有研究認(rèn)為As2O3可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白B的表達(dá)，該蛋白是調(diào)節(jié)G2/M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一，可以促進Bcl-2磷酸化，從而導(dǎo)致G2/M期阻滯6-7。沈志忠等8認(rèn)為As2O3

17、作為一種巰基抑制劑，可能通過原漿毒作用與細(xì)胞內(nèi)的巰基成分微管相交聯(lián)，阻滯微管的形成與聚合，改變細(xì)胞內(nèi)微絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)進而影響細(xì)胞周期，導(dǎo)致G2/M期阻滯，產(chǎn)生抗癌或抑癌作用。Liu Q等9認(rèn)為As2O3可以導(dǎo)致胃癌CGL-2細(xì)胞DNA雙鏈損傷，并且抑制DNA損傷的G2稽查點活化，使CGL-2細(xì)胞系阻滯于G2/M，可能進一步促進CGL-2系的凋亡。As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并促細(xì)胞阻滯于G2/M期在對多發(fā)骨髓瘤細(xì)胞及胃癌MKN45細(xì)胞系的研究中也得到證實10-11， 并且這種效應(yīng)呈時間-劑量依賴性。本研究流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示放療及As2O3均能致Hela細(xì)胞G2/M期阻滯，而G2/M的細(xì)胞對射線最敏感

18、，因此As2O3誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞周期阻滯可能是其放射增敏的機理之一，但長期應(yīng)用As2O3是否會引起致癌、致畸等毒副作用則有待更深入研究。(感謝鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所全體工作人員對本實驗給予的指導(dǎo)與幫助!)【參考文獻(xiàn)】1張大昕,王 兵,胡雷光.三氧化二砷對卵巢癌細(xì)胞的放射增強作用J.中華放射腫瘤雜志，2003,12(1):16-18.2Ning S,Knox SJ.Optimization of combination therapy of arsenic trioxide and fractionated radiotherapy for malignant gliomaJ.Int

19、 J Radiat Oncol Biol Phys,2006,65(2):493-498.3聶 林,張 洹,李 萍,等.三氧化二砷提高惡性淋巴瘤細(xì)胞放射敏感性的觀察J.中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志，2005,25(1):43-45.5郭 紅，吳 榮，遲 峰，等.三氧化二砷對人宮頸頸Hela細(xì)胞系的放射增敏作用J.實用腫瘤學(xué)雜志，2007,21(1):21-22,87.6汪選斌, 柯 靜,王家寧,等.三氧化二砷聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人大腸癌SW480細(xì)胞的抑制作用J.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007,26(5):278-280.7Ling YH,Jiang JD,Holland JF,et al.Arsenic trioxide produces polymerization of microtubules and mitotic arrest before apoptosis in human tumor cell linesJ.Mol Pharmacol,2002,62(3):52