1、犬瘟熱病毒DNA疫苗接種犬的免疫保護(hù)徐向明'，殷俊'，楊玲'，李娜'，薛整風(fēng)'，崔治中2(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018)摘要:用犬瘟熱病毒(CDV)囊膜糖蛋白基因(H、F)和核蛋白基因(N)重組質(zhì)粒DNA和聚乙烯胺(PEI)混合后肌注10只3月齡CDV抗體陰性畢格犬.間隔30d，共免疫3次，另選擇5只犬作為陰性對照。免疫3次后.采用CDV攻毒。對照組呈現(xiàn)出犬瘟熱的典型癥狀和組織病理損害，攻毒3周內(nèi)，有2只犬衰竭死亡.1只犬癥狀明顯.攻毒第18天外周血淋巳細(xì)胞中病毒RNA檢測為陽性。DNA疫

2、苗免疫組除出現(xiàn)一過性的體溫升高外，未出現(xiàn)明顯癥狀，攻毒后第18天外周血淋巴細(xì)胞CDV檢測仍為陰性。DNA疫苗免疫后血清ELISA抗體和病毒中和抗體測定顯示，首免后機(jī)體激發(fā)的ELISA抗體滴度很低(IO】25=。郎)，二免后開始緩慢升高(10商R2甜),再次免疫后達(dá)到10頃=。.川；中和抗體也呈現(xiàn)以上規(guī)律，三免后血清中和抗體為IO,75±ftl9°,攻毒后血清ELISA抗體和中和抗體滴度迅速升高(IO，"士。*和I""±o.g)。試淌表明CDV基因免疫對CDV的感染具有較好的保護(hù)作用，并能清除進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的病毒。CDV基因免疫只激發(fā)較低水

3、平的體液免疫.中和抗體在攻毒前達(dá)不到臨界保護(hù)線(10,),但對CDV攻擊能產(chǎn)生較好的保護(hù)，推測其免疫效力可能源于細(xì)胞免疫和記憶性B淋巴細(xì)胞。關(guān)鍵詞:犬瘟熱病毒;DNA疫苗;抗體;免疫保護(hù)中圖分類號:S852.65文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:100524545(2008)0921011204ImmuneprotectionindogsinoculatedbyCDVDNAvaccineXUXiang2ming*,YINJun*,YANGLing*,LINa*,XUEZheng2feng*,CUIZhi2zhong2(1.CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUnive

4、rsity,Yaugzhou,Jiangsu225009,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgriculturalUniversity,Taian,Shandong271018,China)Abstract:Thethreeplasmid(pCDNA2H,pCDNA2FandpCDNA2N)mixedwithPElwereinjectedintothemus2cleofCDVantibodynegativeBeagledogsthatare3monthsold,other5dogsweretreatedasnegative

5、control.Afterthreetimesofimmunization,dogswerechallengedwithtissuehomogenateofCDV.Thecontroldogsappearedtypi2calsymptomsandpathologiclesions.After3weeksofchallenge,2dogsdiedofprostration,oneoccurredevidentsymptom,andvirusRNAinitsperipherallymphocyteispresent.Theimmunizedgroupofdogsdidnotappearevi2de

6、ntsymptomexceptthutbodytemperatureeievatedtransiently,andCDVofperipherallymphocyteisahsentafter18daysofchallenge.ELISAtiterwasverylow(I0125a6l>)afterthefirstimmunization,anditboostcdslowly(101粉±a胡5)afterthesecondimmunization.thenreach10-051±0-214afterathirdimmunization.Theneutralizingan

7、ti2bodylitervariedwiththesamelaw,andwas10'7510,90afterlhethirdimmunization.ELISAtiterandneutralizingantibodyliterboostedquickly(1O'02'l加andIO241ft245).TheseexperimentsindicatcthatDNAvaccinecanprotectdogfromCDVinfectionandeliminatethevirusinbody.Althoughthevaccinestiinulatedlowlevelofhumo

8、ralitnnui2nity,andtheneutralizingantibodydidn'treachthecriticallevel(10'、).thevaccinationpmtecteddogefficiently.ItispresumedthattheimmuneeffectmightbeprovidedmainlybycellularimmunityandniemoryBlymphocyte.Keywords:caninedistempervirus:DNAvaccine:antibody;immuneprotection自20世紀(jì)90年代初期，首次報(bào)道用質(zhì)粒DNA

9、作為疫苗,從而掀起了疫苗的第3次革命。其與傳統(tǒng)疫苗相比存在著許多優(yōu)點(diǎn)，首當(dāng)其中就是它的安全性，目前還未報(bào)道質(zhì)粒DNA與宿主染色體的整收稿日期:2(X)6211230基金項(xiàng)目：江蘇省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)資助項(xiàng)目(BM200301)：江蘇省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)U(VK4IOO82)作者簡介:徐向明(19692),男.副教授.博士。合現(xiàn)象，且質(zhì)?？稍诜莿?dòng)物源性環(huán)境下大量生產(chǎn)，并可高度純化。此外，機(jī)體可合成與病毒感染期內(nèi)結(jié)構(gòu)相同的抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。DNA疫苗也存在著一些亟待解決的問題，如激發(fā)的體液免疫不強(qiáng)“習(xí)，質(zhì)粒DNA進(jìn)入機(jī)體易被降解而造成APC攝取量降低等，因此，許多學(xué)者嘗試用不同

10、方法提高DNA疫苗的保持力，包括目的基因與細(xì)胞因子共表達(dá)”I將重組質(zhì)粒直接導(dǎo)入免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞z；用磷酸鋁或脂質(zhì)體及陽離子類脂包裝質(zhì)粒犬瘟熱的預(yù)防控制一直是研究的焦點(diǎn)，除了全球普遍使用的活疫苗外，近年來對犬瘟熱病毒(CDV)的重組活載體疫苗和DNA疫苗的研究也取得了長足的進(jìn)展，而國內(nèi)未見報(bào)道。徐向明等們將CDV中國分離株(CDV2YZ0101)的囊膜糖蛋白F和H基因插入pcDNA*J2)中，在COS27細(xì)胞驗(yàn)證其表達(dá)后，免疫BALB/c小鼠能激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答。為了進(jìn)步探討DNA免疫在自然宿主體內(nèi)的免疫應(yīng)答,本試驗(yàn)將以上2個(gè)表達(dá)質(zhì)粒及本室構(gòu)建的CDV核蛋白基因(N)的重組質(zhì)粒(pcDNA2N

11、)與聚乙烯胺(PEI)混合后免疫CDV抗體陰性犬，檢測其誘導(dǎo)的血清ELISA抗體和病毒中和抗體，并采用CDV感染犬的組織勻漿攻毒后觀察其保護(hù)力。1材料與方法1.1質(zhì)粒與菌種pcDNA2H、pCDNA2F和pcD2NA2N重組質(zhì)粒的構(gòu)建參照文獻(xiàn)6進(jìn)行；宿主菌D由本室保存。1.2重組質(zhì)粒DNA的大量制備與純化pcDNA2H、pcDNA2F和pcDNA2N重組質(zhì)粒的抽提按QIA2gen公司的PlasmidMegaKit說明書方法進(jìn)行，質(zhì)粒DNA定量后用5%無菌葡領(lǐng)糖注射液稀釋至015g/L,-20°C凍存?zhèn)溆?。PEI溶液配制后-20°C保存，使用時(shí)與DNA的比例為DNA:PEI=

12、100Pg:100ULoI.3試驗(yàn)動(dòng)物Beagle犬(普通級)由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。1.4動(dòng)物分組及處理3月齡的Beagle犬于試驗(yàn)前采血分離血清，選擇CDV抗體檢測陰性的15只犬。將其隨機(jī)分成2組，其中重組質(zhì)粒DNA免疫組10只，每只犬注射pcDNA2H、pCDNA2F和pcD2NA2N3種質(zhì)粒各200Ug與600uLPEI溶液的混合液，兩后肢分點(diǎn)肌注，以1個(gè)月為間隔，共免疫3次，同時(shí)設(shè)5%滅菌葡萄糖注射液肌注為陰性對照組，于每次免疫前、攻毒前、攻毒后2周肢靜脈采血，分離血清，-20°C保存待測。1.5血清中ELISA抗體及病毒中和抗體的檢測ELISA抗體采用北京世紀(jì)元亨動(dòng)物

13、防疫技術(shù)有限公司的CDV抗體ELISA試劑盒進(jìn)行，病毒中和抗體的檢測采用固定病毒稀釋血清法進(jìn)行。I. 6攻毒保護(hù)試驗(yàn)毒株CDVYZ0201(TCID*為IO"/。.1mL)由本室分離鑒定，將該毒株第5代Verc細(xì)胞培養(yǎng)物按lO'TCID、。接種2月齡未免疫的Beagle犬，取有典型犬瘟熱癥狀并死亡犬的腦、月干、肺、淋巴結(jié)和脾臟的組織勻漿作攻毒用。試驗(yàn)犬于最后一次免疫后28d,用上述組織勻漿進(jìn)行攻毒，采用點(diǎn)眼、滴鼻和腹腔注射3種方式混合接種，逐H測量體溫，觀察臨床體征,攻毒后3周，所有犬均撲殺，取各主要臟器,10%福爾馬林固定，石蠟切片,HE染色后進(jìn)行常規(guī)病理組織學(xué)觀察。1.7

14、外周血中病毒RNA檢測1.7.1外周血淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備在攻毒后第18天(對照組2只死亡犬于第15天)采取抗凝血。在離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液，再緩慢加入抗凝血，2000r/min離心20min后，吸出中間乳白色的細(xì)胞層，離心后加入適量的PBS溶解，-20C凍存。1.7.2RT2PCR參照GenBank已發(fā)表的CDV核衣殼蛋白(N)基因序列，設(shè)計(jì)1對引物(括號中的數(shù)字代表在全基因組中位置)：PI:5'2GCAGAATC2CGACCTATCTTTGAGGC23'(783798nt),P2:5/2CGAGTCGACGACTGGTCTTGAATA23,(1655I679nt)。模板RNA

15、抽提及RT2PCR參照文獻(xiàn)7進(jìn)行。2結(jié)果2.I重組質(zhì)粒免疫后ELISA抗體檢測結(jié)果3種質(zhì)粒DNA和PEI混合后肌注試驗(yàn)犬，于每次接種前均采血分離血清，攻毒前及攻毒后也同樣采血分離血清ELISA檢測血清中抗CDV抗體，所有試驗(yàn)犬在試驗(yàn)前ELISA抗體均為陰性，第1次肌注質(zhì)粒后，只激發(fā)了微弱的抗體水平(io*，士。頌)，二免后檢測出10,69±0285滴度的ELISA抗體，攻毒前抗體水平有所提高，達(dá)到io205±0-2,4,K性對照組在此過程中均未檢測出明顯的抗體水平。攻毒后試驗(yàn)組抗體水平迅速升高,達(dá)到了10"E*,而對照組也檢測出iow±w的elISA抗體

16、，但不如免疫組高。2.2重:組質(zhì)粒免疫后病毒中和抗體的動(dòng)態(tài)變化CDV囊膜糖蛋白和核蛋白基因首免后，只檢測出微弱的中和抗體10°*±°曷，二免后能檢測出10'202也加的中和抗體，再次免疫后中和抗體滴度有所升高，達(dá)到iomqm,攻毒后中和抗體迅速升高可達(dá)到左右，而陰性對照組在此期間除2只犬攻毒后檢測出低于1：8的中和抗體外，其余中和抗體均為陰性。2.3體溫變化情況采用CDV組織勻漿攻毒后，對照組于35d出現(xiàn)第I次發(fā)熱，體溫達(dá)到39.841.0°C,間隔5d后又有3只犬出現(xiàn)了第2次發(fā)熱，而另2只犬基本正常，隨后在攻毒第15天后其中2只犬體溫下降到37

17、°C以下，DNA免疫組除攻毒開始后有短暫的體溫升高后，其余體溫基本正常（圖1）。圖1免疫犬和對照犬人工感染CDV后體溫變化曲線I#5#犬為對照組;免疫組犬?dāng)?shù)值為平均數(shù)犬壬壬2.4臨床癥狀對照組犬攻毒后第3天出現(xiàn)厭食,眼角可見膿性或漿液性分泌物，表現(xiàn)出畏光，兩眼不能完全睜開；有3只犬出現(xiàn)咳嗽、I區(qū)比，糞便帶有粘液或呈西紅柿醬樣（血便），繼而表現(xiàn)為弓背、魂卜，腹式呼吸，食欲廢絕,并于攻毒后第16天有2只犬死亡，另1只癥狀明顯。試驗(yàn)組除開始幾天內(nèi)有食欲減退外,其余未見以上癥狀。2.5尸體剖檢和病理組織學(xué)觀察對照組病死犬和癥狀明顯犬（共3只）病理剖檢及組織學(xué)病變顯著:肺可見陳舊性出血點(diǎn)、實(shí)變

18、病灶，兩肺不同程度受累，切面可擠出帶泡沫的血性漿液，顯微鏡下主要呈現(xiàn)代償性肺氣腫、肺實(shí)變和細(xì)支氣管炎；肝微腫質(zhì)脆,肝細(xì)胞呈水樣變性、脂肪變性及氣球樣變性；膽囊充盈膽汁墨綠;脾微腫，組織結(jié)構(gòu)呈退行性變化；胃空虛，腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸腸壁增厚并有少許出血，小腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死脫落，腸壁水腫,有多少不等的炎細(xì)胞浸潤；腦可見軟化灶。對照組另2只犬除見肺上有少量陳舊性出血點(diǎn)，未能觀察到特征性變化。試驗(yàn)組臟器均正常。2.6RT2PCR檢測攻毒后外周血中病毒RNA采用CDV核衣殼蛋白（N）基因的引物對試驗(yàn)犬外周血單核細(xì)胞的RNA進(jìn)行RT2PCR擴(kuò)增（圖2）<>結(jié)果顯示，除對照組5只犬的外

19、周血樣品中擴(kuò)增出CDVN蛋白基因約890bp片段外.DNA免疫組的犬均未擴(kuò)增出特異性條帶。3討論一般認(rèn)為，CDV囊膜糖蛋白是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原，可激發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的體液免疫，而且兩囊膜K12345678910111213141516K12345678910111213141516圖2以外周血淋巴細(xì)胞RNA為模板作CDV核蛋白基因片段的RT2PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000Marker;I.陽性對照（以O(shè)P株為模板）;2.DNA免疫組未能擴(kuò)增特異條帶;1216.對照組犬?dāng)U增出890bp條帶2000-.糖蛋白上均含有相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞表位，其在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫與中和抗體在抗病毒免疫中占有重要地位

20、。同時(shí)另1個(gè)蛋白核衣殼蛋白（N）在病毒早期感染時(shí)可引起強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)g,且其上也含有T細(xì)胞表位們，在細(xì)胞免疫方面發(fā)揮了重要作用，因此有些學(xué)者也將該蛋白基因構(gòu)建了DNA疫苗的載體，并取得了一定成效1,01o本試驗(yàn)利用構(gòu)建的pcDNA2F、pcDNA2H利pcDNA2N質(zhì)粒DNA與PEI混合后免疫CDV抗體陰性犬,攻毒后，對照組大部分犬出現(xiàn)了典型癥狀和病理變化，并有2只犬在攻毒后第16天死亡，另有1只犬癥狀明顯，外周血淋巴細(xì)胞中均能檢測到病毒RNA,而DNA免疫組除出現(xiàn)一過性體溫升高和食欲減退外，其他未見明顯的癥狀,RT2PCR擴(kuò)增也均為陰性。該結(jié)果表明,CDVDNA疫苗免疫對機(jī)體可產(chǎn)生保護(hù)力，能

21、抵抗致病性毒株的攻擊,并對體內(nèi)病毒的消除發(fā)揮了重要作用。然而在對其ELISA抗體和病毒中和抗體檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然在免疫過程中及攻毒前能檢測出血清中抗體水平，但總體滴度偏低，ELISA抗體滴度最高達(dá)|0205±Q中和抗體最高達(dá)10-5土QWO。CDV弱毒疫苗激發(fā)的體液免疫水平與免疫保護(hù)是密切相關(guān)的,特別是抗糖蛋白抗體出現(xiàn)的早晚以及含量的高低被認(rèn)為是抗CDV感染的重要因素。機(jī)體感染CDV后，動(dòng)物的康復(fù)與其產(chǎn)生的高水平IgG相關(guān),康復(fù)犬的抗體滴度最高,致死性感染犬的抗體很少，乃至沒有。一般認(rèn)為犬的中和抗體滴度在10以上者均能完全保護(hù)其不受CDV的攻擊“，而木試驗(yàn)在攻毒前中和抗體均未能達(dá)到臨界

22、保護(hù)線。然而經(jīng)DNA免疫的試驗(yàn)犬對病毒攻擊卻能提供較好的保護(hù),這種現(xiàn)象在其他一些病毒的DNA免疫中也同樣存在，分析其原因，己有學(xué)者認(rèn)為在DNA免疫提供的保護(hù)上,細(xì)胞免疫可能占有主導(dǎo)地位，其中主要是CD8'T淋巴細(xì)胞的激活及其對靶細(xì)胞的殺滅。DNA免疫宿主細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的外源蛋白被分裂成短肽(8-10個(gè)氨基酸)，通過膜相關(guān)輸送器進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并與MHC2I類分子結(jié)合，這些MHC2I類分子/病毒蛋白肽復(fù)合物被提呈到細(xì)胞表面，繼而刺激CD8+CTL引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。而抗體的產(chǎn)生有賴于B細(xì)胞識別進(jìn)入細(xì)胞表面或間隙的完整蛋白，因而分泌性抗原可更有效的活化B細(xì)胞以危。然而DNA免疫產(chǎn)生的蛋白和天然

23、病毒感染有很大的差別：其產(chǎn)生的抗原蛋白是非細(xì)胞病變性的，因此不會導(dǎo)致細(xì)胞裂解，而旦許多編碼蛋白既不展示至細(xì)胞表面也不分泌到細(xì)胞外部,這些非分泌性抗原是如何釋放到胞外的，目前還沒有明確的答案，可能與以下因素相關(guān)：CTL細(xì)胞介導(dǎo)的特異殺傷溶解作用，轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡后裂解釋放，所以抗體反應(yīng)緩慢得多。可以推測CDVDNA疫苗中細(xì)胞免疫同樣發(fā)揮著極其重要的作用，這也可用在兩個(gè)囊膜糖蛋白和核蛋白上均含有相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞表位，在小鼠和犬體內(nèi)均能誘發(fā)較高水平的細(xì)胞免疫來解釋。本試驗(yàn)DNA免疫中使用了陽離子聚合體PEI,與200UgDNA混合免疫后激發(fā)的抗體水平比Ch2erpillod等頃報(bào)道的200獎(jiǎng)裸DNA免疫

24、要高，這可能由于本試驗(yàn)中免疫劑量略大，或者陽離子聚合體PEI的作用，或者與兩者的協(xié)同效應(yīng)有關(guān)。也有報(bào)道一次大劑量(0.51mg)DNA免疫后可激發(fā)機(jī)體較強(qiáng)的體液免疫水平心。但是否存在著劑量效應(yīng)，還頗有爭議。另外值得關(guān)注的是，與CDV具有較大抗原交又的麻疹病毒DNA疫苗研究中，Po2lack等5報(bào)道采用麻疹病毒2個(gè)囊膜糖蛋白H和F基因重組質(zhì)粒DNA一次免疫便口J在恒河猴體內(nèi)激發(fā)顯著水平的中和抗體。在這個(gè)試騎中他們采用了較大劑量的質(zhì)粒DNA(每種質(zhì)粒500Ug)，選用了皮下注射。在皮膚接種過程中有試驗(yàn)證明，角化細(xì)胞和朗罕氏細(xì)胞是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染最主要的APC細(xì)胞，能夠在轉(zhuǎn)染之后有效地表達(dá)病毒蛋白,并

25、從皮膚遷移至淋巳結(jié)，進(jìn)而激活T細(xì)胞"刃，從而比肌細(xì)胞具有更好的抗原提呈能力,在一些動(dòng)物模型中使用皮膚接種比肌肉注射能激發(fā)更好的免疫應(yīng)答1,61o當(dāng)然在犬體內(nèi)是否存在同樣的優(yōu)越性還需進(jìn)一步的研究。雖然本試驗(yàn)在整個(gè)免疫過程中未能檢測出高水平的抗體,然而在攻毒后2周無論是血清中ELISA抗體，還是中和抗體均迅速上升，這與Cherpillod等頃的試驗(yàn)結(jié)果相-致。這表明DNA免疫在攻毒前未能激發(fā)高水平的體液免疫，并不是該種免疫方式存在免疫耐受現(xiàn)象，在攻毒后短時(shí)間內(nèi)抗體水平的升高，可能是抗體的一種免疫記憶效應(yīng)，機(jī)體經(jīng)DNA免疫后產(chǎn)生了大量的記憶細(xì)胞或漿細(xì)胞的前身細(xì)胞，一旦采用病毒攻擊后,它們在

26、短時(shí)間內(nèi)迅速地轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞而產(chǎn)生高水平的抗體，從而提供了有效的免疫保護(hù)，這種推斷仍需試驗(yàn)來證實(shí)。此外，在攻毒后對照組犬也檢測出102,42±ftJ55的ELISA抗體,但未能檢測出明顯的申和抗體。我們認(rèn)為在CDV野毒接種后，在這些動(dòng)物體內(nèi)只激發(fā)了針對核衣殼蛋白的低水平抗體，而且該水平抗體不能對機(jī)體產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)。本試驗(yàn)構(gòu)建的CDV的囊膜糖蛋白和核蛋白基因的重組質(zhì)粒在自然宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)和保護(hù)力進(jìn)行了初步的嘗試。雖然攻毒后對照組和試驗(yàn)組間存在著明顯的區(qū)別，但對照組犬未能全部死亡，由于CDV野毒株在適應(yīng)細(xì)胞后其毒力大大降低，且不可能致死犬,如將病毒組織勻漿在易感宿主狐、雪貂機(jī)體復(fù)壯

27、后攻毒可提高犬的致死率。在犬瘟熱DNA疫苗研究中，須在免疫途徑、免疫劑量以及與細(xì)胞因子和佐劑的協(xié)調(diào)作用上作深入的探討，以期提高DNA疫苗免疫激發(fā)的抗體水平。參考文獻(xiàn)：1|KodihalliS,GotoH,KobasaDL,ctal.DNAvaccineencodinghemagglutininprovidesprolcciiveinununityagainstHSMinfluenzavirusinfectioninmiceJ|.JVirol,1999,73:209422098.I2OttenGR.DoeB,SchaeferM,etal.Relativepotencyofcellularandh

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