1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化一.試齊U16-BA(6-BenzylaminoPurine)SigmaCatNo.B-58982KT(Kinetin)SigmaCatNo.K-07533NAA(Napthaleneaceticacid)SigmaCatN-06404IAA(Indole-3-aceticacid)SigmaCatNo.I-514852,4-D(2,4-Dichlorophenoxyaceticacid)SigmaCatNo.D-84076KanamycinUSBCatNo.179247CH(CaseinEnzymaticHydrolysate)SigmaCatNo.C-72908Hn(hyg

2、romycinB)GiBcoBRLCatNo.10687-0109Cn(Carbenicillin)國產(chǎn)分裝10NicotinicacidSigmaCatNo.N-076511PyridoxineHClSigmaCatNo.P-866612ThiamineHClSigmaCatNo.T-390213InositolSigmaCatNo.I-301114PhytagelSigmaCatNo.P-816915DimethylSulfoxide-DMSOSigmaCatNo.D-587916X-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)SigmaCa

3、tNo.B-378317AS(Acetosringone)Aldrichchem.,CO01531EG二.溶液1.MSmaxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO41.7gMgSO4?7H2O3.7gCaCl2l2H2O4.4g或CaCl23.32g2.逐一溶解藥品后，加dH2O定容到1000ml。MSmin母液(100為KI0.083gH3BO30.62gMnSO4?4H2O2.23g或MnSO4?H2O1.69g3.ZnSO4?7H2O0.86gNa2MoO4?2H2O0.025gCuSO4?5H2O0.0025gCoCl2?6H2O0.0025g注意：Na2MoO4必須單獨溶

4、解后再與其它組分混合。加dH2O定容到1000ml室溫保存。N6max母液(10>)28.3g4.0g4.63gKNO3KH2PO4(NH4)2SO4MgSO4?7H2O1.85gCaCl2?2H2O1.66g或CaCl21.25g逐一溶解藥品后，加dH2O定容到1000ml。4.N6min母液(100乃KI0.08gH3BO30.16gMnSO4?4H2O0.44g或MnSO4?H2O0.3335gZnSO4?7H2O0.15g加dH2O定容到1000ml室溫保存。5. Fe2+-EDTA(100>)取一個燒杯加300mldH2O以及FeSO4?7H2O2.78g；在另一個燒杯中

5、也加300mldH2O加熱到70后加入Na2EDTA?2H2O3.73g；待到兩種藥品都溶解了，混合，70c保溫2hr,然后加d”O(jiān)定容到1L,4c保存。8.6. 維生素(100學(xué)Nicotinicacid0.1gPyridoxineHCl(VB6)0.1gThiamineHCl(VB1)0.1gGlycine0.2gInositol10g加dH2O定容到1000ml4保存。AAmax母液(10為KCl29.50gNaH2PO41.50g或NaH2PO4?2H2OMgSO4-7H2O2.50gCaCl2?2H2O1.50g或CaCl21.13g加dH2O定容到1000ml室溫保存。7.AAmi

6、n母液(1000兇1.95gMnSO4?H2O1.0gH3BO30.3gZnSO4?7H2O0.2gKI0.075gNaMoO4?2H2O0.025gCuSO4?5H2O0.0025gCoCl2?6H2O0.0025gNa2MoO4必須單獨溶解后再與其它組分混合，加dH2O定容到1000ml室溫保存。9. 2,4-D母液(1mg/ml)9.1- D100mg先加1.0ml1NKOH搖5min，然后加10mlH2O繼續(xù)搖直到2,4-D溶解，加水定容到100ml室溫保存。10. 6-BA母液(1mg/ml)6-BA100mg加1.0ml1NKOH搖直到6-BA溶解，加水定容到100ml室溫保存。1

7、1. NAA母液(1mg/ml)NAA100mg加1.0ml1NKOH并攪動直到NAA溶解，加水定容到100ml室溫保存。12. IAA母液(1mg/ml)IAA100mg加1.0ml1NKOH搖直到IAA溶解，加水定容到100ml室溫保存。13. 100mMAS母液(1mg/ml)AS0.196gDMSO10ml分裝到1.5ml離心管4保存。14. 1NKOH母液(1mg/ml)KOH5.6g用100mlH2O溶解后室溫保存。15. 竣芳青霉素2鈉(CN)(200mg/ml)CN干粉1g用5ml滅菌dH2O溶解后，分裝到1.5mlTub中(無菌操作)或者用5ml75酒精溶解，分裝到1.5ml

8、Tub中(無菌操作)16. Astocksolution(繼代A)硝酸銨16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g七水硫酸鎂3.5g二水氯化鈣4g/無水氯化鈣3g加水依次溶解，定容1000ml，室溫保存17. Bstocksolution(繼代B):四水硫酸錳5.0g硼酸1.5g七水硫酸鋅2.0g(未完)周， 不可接碘化鉀0.75g二水鉬酸鈉0.25g五水硫酸銅0.0389g六水氯化鈷0.025g加水依次溶解，定容1000ml，室溫保存(二水鋁酸鈉單獨稱，單獨溶，緩慢加入，邊加邊攪)三農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷的遺傳轉(zhuǎn)化過程1 愈傷誘導(dǎo)1) 成熟種子脫殼后70%酒精滅菌1min，0.15%HgCl

9、2處理15min；2) 滅菌單蒸水洗5-7次；3) 將種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接6-8粒；4) 置黑暗中26±1處理約4-7周。2 愈傷繼代挑取淺黃、致密且相對較干的胚性愈傷接種到繼代培養(yǎng)基上26±1處理2太多。3 預(yù)培養(yǎng)挑取致密且相對較干的胚性愈傷接種到預(yù)培養(yǎng)基上置黑暗中3至4天。4 農(nóng)桿菌準備準備浸染的農(nóng)桿菌擴大培養(yǎng)。在相應(yīng)抗性平皿中涂菌，28度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23天5 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)準備將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移(粳稻：用接種環(huán)刮入半環(huán)-1環(huán)菌，秈稻：3環(huán)-4環(huán)菌)到100ml懸浮培養(yǎng)基中28搖瓶培養(yǎng)30-60min。6 農(nóng)桿菌侵染(共培養(yǎng))1) 經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移到一個滅菌的三

10、角瓶中；2) 調(diào)整農(nóng)桿菌懸浮液的OD600值到0.8-1.0之間；3) 用農(nóng)桿菌懸浮液浸泡愈傷2030min；4) 倒去菌液，將三角瓶倒立于含濾紙的滅菌小皿中約15min；5) 愈傷放在滅菌的濾紙上晾干后，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上去。培養(yǎng)物19-20黑暗處理2天。7 水洗和篩選1) 經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移到一個滅菌的三角瓶中；2) 用滅菌單蒸水洗5至7次愈傷；3) 用含有400ppmCn(羧芐青霉素二鈉)的滅菌水浸泡愈傷30min(封好口后，可于28度，180至200RPM搖2030min)；4) 倒去含抗生素的滅菌水，將三角瓶倒立于含濾紙的滅菌小皿中約15min；5) 在滅菌的濾紙上晾干愈傷；6)

11、 轉(zhuǎn)移愈傷到相應(yīng)抗性的篩選培養(yǎng)基篩選2-3個循環(huán)(每個循環(huán)約2周)8 預(yù)分化與分化1) 經(jīng)過篩選得到的抗性愈傷轉(zhuǎn)到帶抗性的預(yù)分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，黑暗處理5-7天；2) 經(jīng)過預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶里的分化培養(yǎng)基中，每瓶3粒愈傷，只選亮黃色的抗性愈傷，不必接入太多。；3) 26光照處理，約需4060天。9 生根1) 從分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一塊愈傷所得的苗子只選一棵；2) 剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生組織；3) 將苗子轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，28光照處理7至10天。10 移栽移去生根管的封口膜，倒入約1cm深的自來水，在光照培養(yǎng)室煉苗34天，移栽至準備好的栽種處。四培養(yǎng)基注意：

12、所有的培養(yǎng)基必須現(xiàn)配現(xiàn)用。(一)粳稻的轉(zhuǎn)化1. 誘導(dǎo)培養(yǎng)基(用于粳稻)N6max母液（10）100mlN6min母液(100為10mlFe2-EDTA母液（100）10mlVitamin母液（10010ml2,4-D母液2.5ml脯氨酸0.3g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel3g加H2O600-700ml并用KOH調(diào)節(jié)pH到5.9，煮沸后加H2O定容到1000ml，分裝到50ml三角瓶中（25ml/瓶），封口膜封口滅菌。2. 繼代培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液（10）100mlN6min母液（I。為10mlFe2-EDTA母液（100）10mlVitamin母液（100m10ml

13、2.4- D母液2.0ml脯氨酸0.5g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel3g加H2O900ml并用1NKOH調(diào)節(jié)pH到5.9,煮開后加H2O定容到1000ml,分裝到50ml三角瓶中（25ml/瓶），封口膜封口滅菌。3. 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液（10）12.5mlN6min母液（100為1.25mlFe2-EDTA母液（100）2.5mlVitamin母液（100學(xué)2.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.15g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加H2O250ml并用1NKOH調(diào)節(jié)pH到5.6，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄

14、糖溶液）和250dAS母液，然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。4. 共培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液（10）12.5mlN6min母液（100為1.25mlFe2-EDTA母液（100）2.5mlVitamin母液（1002.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加H2O250ml并調(diào)節(jié)pH到5.6，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄糖溶液）和250dAS母液，然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。5. 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液（10）5mlN6min母液（100為0.5mlFe2-EDTA母液

15、（100）0.5mlVitamin母液（100m1ml2,4-D母液0.2ml水解酪蛋白0.08g蔗糖2g力口H2O100ml并調(diào)節(jié)pH到5.4,分裝到2個100ml三角瓶（50ml/瓶），封口膜封口滅菌。使用前，加入1ml葡萄糖和100MAS母液。6.篩選培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液（10）25mlN6min母液（100為2.5mlFe2-EDTA母液（100）2.5mlVitamin母液（100學(xué)2.5ml2,4-D母液0.625ml水解酪蛋白0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加H2O250ml并調(diào)節(jié)pH到6.0，封口膜封口滅菌。封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入250lHn

16、（潮霉素）和200ppmCn（國產(chǎn)），然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。7.預(yù)分化培養(yǎng)基（用于粳稻）MSmax母液（1。）25mlMSmin母液（100為2.5mlFe2-EDTA母液（100）2.5mlVitamin母液（100學(xué)2.5ml6-BA母液0.5mlKT母液0.5mlNAA母液50MIAA母液50M水解酪蛋白0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加H2O250ml并調(diào)節(jié)pH到5.9，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入250MHn和200ppmCn（國產(chǎn)），然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。8.分化培養(yǎng)基（用于粳稻）MSmax母液（10）100mlMSmin母液（100為

17、10mlFe2-EDTA母液（100）10mlVitamin母液（100學(xué)10ml6-BA母液2.0mlKT母液2.0mlNAA母液0.2mlIAA母液0.2ml水解酪蛋白1g蔗糖30gPhytagel3g加H2O1000ml并用1NKOH調(diào)節(jié)pH到6.0，煮開后分裝到100ml三角瓶中（50ml/瓶），封口膜封口滅菌。9.生根培養(yǎng)基MSmax母液（10）50mlMSmin母液（100為5mlFe2-EDTA母液（100）10mlVitamin母液（100m10ml蔗糖20gPhytagel3g加H2O1000ml并用1NKOH調(diào)節(jié)pH到5.8，煮開后分裝到生根管中，封口膜封口滅菌。秈稻的轉(zhuǎn)化

18、1. 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（用于秈稻）MSmax母液（10）100mlMSmin母液（100為10mlFe2-EDTA母液（100）10mlVitamin母液（100m10ml1.4- D母液2.5ml脯氨酸0.5g谷氨酰胺0.5g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel3g加H2O600-700ml并用KOH調(diào)節(jié)pH到6.0，煮沸后加H2O定容到1000ml，分裝到50ml三角瓶中（25ml/瓶），封口膜封口滅菌。2. 繼代培養(yǎng)基（用于秈稻）繼代A（10刀100ml繼代B（100X）10mlFe2-EDTA母液（100）10mlVitamin母液（100m10ml2.4- D母液3.0ml脯氨酸0

19、.6g谷氨酰胺0.5g水解酪蛋白0.8g麥芽糖30gPhytagel3g加H2O900ml并用1NKOH調(diào)節(jié)pH到6.0,煮開后加H2O定容到1000ml,分裝到50ml三角瓶中（25ml/瓶），封口膜封口滅菌。3. 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于秈稻）MSmax母液（10）12.5mlMSmin母液（100為1.25mlFe2-EDTA母液（100）1.25mlVitamin母液（1001.25ml3.4- D母液0.75ml水解酪蛋白0.15g5g1.75g加H2O250ml并用1NKOH調(diào)節(jié)pH到6.0，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄糖溶液）和250dAS

20、（乙酰丁香酮）母液，然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。4. 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基（用于秈稻）AA max母液（10）AAmin母液（100為Fe2-EDTA 母液（100 ）Vitamin 母液（100 2,4-D 母液谷氨酰胺天冬酰胺精氨酸5ml0.5ml0.5ml1ml0.2ml0.08760.02160.01762g2g（葡萄糖可以配成50%的母液分開滅，在倒皿時加4ml/100ml瓶）力口H2O100ml并調(diào)節(jié)pH到5.4,過濾滅菌，加入100口AS母液，分裝到2個100ml三角瓶（50ml/瓶）。5. 共培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于秈稻）MSmax 母液（1。）MSmin母液（100為Fe2-ED

21、TA 母液（100 ）Vitamin 母液（100 學(xué)2,4-D 母液水解酪蛋白6.25ml1.25ml2.5ml2.5ml0.75ml0.2g5g加 H 2O 250ml 并調(diào)節(jié)pH 到 6.0 ，封口膜封口滅菌。25ml2.5ml2.5ml2.5ml0.625ml0.15ml 0.1g 0.15g 7.5g 1.75g1.75g加H2O250ml并調(diào)節(jié)pH到5.6，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄糖溶液）和250AS母液，然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。6. 篩選培養(yǎng)基（用于秈稻）A母液（10不B母液（100學(xué)Fe2-EDTA母液（100）Vi

22、tamin母液（100學(xué)2,4-D母液脯氨酸谷氨酰胺水解酪蛋白蔗糖瓊脂粉使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入250MHn（潮霉素）和200PpmCN（國產(chǎn)），然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。CN配方：10g/40ml滅菌雙蒸水，劇烈搖勻，后分裝于1.5ml離心管，-20度保存；CN加量：一篩400-500ul/250ml瓶，二篩300-350ul/250ml瓶，三篩250ul/250ml瓶）7. 預(yù)分化培養(yǎng)基（用于秈稻）N6max母液（1。）25mlN6min母液（100為2.5mlFe2-EDTA母液(100)2.5mlVitamin母液(100學(xué)2.5ml6-BA母液0.5mlKT母液0.5mlNAA母液50MIAA母