1、頂空液相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)葡萄酒中的氨基甲酸乙酯姜自軍1,2，閻雪1,2* 基金項(xiàng)目：吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010ZJK07）作者簡(jiǎn)介：姜自軍（1963），男，高級(jí)工程師，主要從事食品生產(chǎn)許可證審查工作。E-mail：通訊作者：閻雪(1979)，女，吉林省通化人，研究生，主要從事食品中揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機(jī)物檢測(cè)的研究與應(yīng)用。E-mail：，電話：，單紀(jì)平1,2，徐剛1,2，慈慧2（1.國(guó)家果酒及果蔬飲品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，吉林 通化 134001；2.通化市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林 通化 134001）摘要：建立了頂空液相微萃取/氣相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的

2、方法。對(duì)影響萃取效率的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用Rtx-Wax毛細(xì)管柱進(jìn)行檢測(cè)，以癸烷為萃取溶劑，在60、攪拌速度為200r/min條件下對(duì)1mL葡萄酒樣品萃取30min。該方法對(duì)氨基甲酸乙酯的富集倍數(shù)為62；在1001600 µg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。相關(guān)系數(shù)為0.9999；氨基甲酸乙酯的檢出限為1µg/L（S/N=3）。實(shí)際酒樣的加標(biāo)回收率為81.0%103.1%。關(guān)鍵詞：頂空液相微萃取；葡萄酒；氨基甲酸乙酯；氣相色譜儀-質(zhì)譜Applied the method of headspace liquid-phase micro-extraction coupled wi

3、th gas chromatography-mass spectrometry to the determination of ethyl carbamate in winesJIANG Zi-jun1,2, YAN Xue1,2*, SHAN Ji-ping1,2, XU Gang1,2, CI Hui2(1. National ratafia and fruits and vegetables drinks quality surveillance test center, Tonghua 134001, China2. Tonghua manufactured product quali

4、ty surveillance test institute, Tonghua 134001, China)Abstract：Headspace liquid-phase micro-extraction (HS-LPEM) coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to determine the ethyl carbamate of wines. Some main experimental parameters that affect the extraction efficiency were

5、optimized. Decane was selected as extraction solvent. The extraction was carried out at 60 in a 2mL vial filled with 1mL of sample solution at a stirring rate of 500r/min for 30min. The enrichment factors for the ethyl carbamate was 62. The linear range for the quantification of the ethyl carbamate

6、was 1001600 µg/L(R2=0.9999) . The limit of detection was 1µg/L（S/N=3）for the ethyl carbamate. Recovery was 81.0%103.1%.Key word: headspace liquid-phase micro-extraction(HS-LPEM)；wines；ethyl carbamate；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC) 又名尿烷，是發(fā)酵食物和酒精飲品在發(fā)酵或貯

7、存過(guò)程中天然產(chǎn)生的污染物，包括葡萄酒在內(nèi)的發(fā)酵飲料和食品中含有的微量氨基甲酸乙酯早在1943年就被證實(shí)是一種致癌物質(zhì)。加拿大和美國(guó)的衛(wèi)生與預(yù)防部門規(guī)定佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超過(guò)30g/L和15g/L1。目前我國(guó)尚未對(duì)葡萄酒中的EC作出限量標(biāo)準(zhǔn)2。目前，葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的萃取方法有液/液萃取、固/液萃取、固相微萃取及固相萃取柱萃取等幾種，但是以上方法各有其缺點(diǎn)和不足3。液/液萃取法用于葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的定量檢測(cè), 提取效率很高，但是有機(jī)溶劑用量大，容易對(duì)環(huán)境造成二次污染，而且大部分萃取溶劑都是有毒的，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體傷害比較大；固/液萃取，固相萃取柱萃取仍然要使用較多的有

8、機(jī)溶劑；固相微萃取法無(wú)需有機(jī)溶劑、所需樣品量少，靈敏度高，重現(xiàn)性號(hào)，操作簡(jiǎn)單、快捷，但是由于萃取纖維重復(fù)使用，存在目標(biāo)物殘留的問(wèn)題4-5。機(jī)溶劑都液相微萃取技術(shù)（LPME）是在液-液萃取(LLE)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在1996年由Jeannot和Cantwell提出的。LPME技術(shù)靈敏度高，富集效果好，同時(shí)集采樣、萃取和濃縮于一體，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，而且還具有快捷，廉價(jià)等特點(diǎn)。另外，該技術(shù)僅需幾到幾十微升的有機(jī)溶劑，是一項(xiàng)環(huán)境友好的樣品前處理新技術(shù)，特別適用于揮發(fā)性，半揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定6-11。1.實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑樣品氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津GCMS-QP2010,日本島津公司）

9、，微量進(jìn)樣器（10L,美國(guó)hamilton公司）。氨基甲酸乙酯（98.5%，德國(guó)產(chǎn)）氨基甲酸丙酯（98.0%，德國(guó)產(chǎn)）癸烷（99.5%，德國(guó)產(chǎn)），十二烷（99.0%，德國(guó)產(chǎn)）辛烷（99.0%，天津產(chǎn)）甲苯（99.9%，天津產(chǎn)）乙酸乙酯（99.8%，天津產(chǎn)）正辛醇（99.5%，德國(guó)產(chǎn)）葡萄酒樣品為不同葡萄酒廠取得的原酒和成品酒。1.2.GC-MS分析條件島津氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS-QP2010）；30 m×0.25 mm×0.25µm Rtx-Wax毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度為250；載氣(He)流速1.0 ml/min；柱箱起始溫度為80，然后以20/min的速

10、度升溫到250，保持1.5 min。不分流進(jìn)樣。分析時(shí)間為10 min。離子源溫度200；接口溫度220；電離方式El；選擇離子模式SIM；電離能量70 Ev；切割溶劑時(shí)間4.0 min。檢測(cè)離子m/z 62、44、74，定量離子m/z 62。1.3. 頂空液相微萃取頂空液相微萃取包括以下幾個(gè)步驟： (1) 按照?qǐng)D1所示組裝液相微萃取裝置 (2) 取一支干凈的10 µl 色譜進(jìn)樣針用萃取溶劑清洗至少20次，以確保針筒和針尖內(nèi)沒(méi)有氣泡殘留 (3) 用進(jìn)樣針吸2.6 µL 萃取溶劑，針尖穿透樣品瓶的隔墊，小心按下進(jìn)樣器的活塞，使溶劑懸于針尖，在樣品上空1 cm 處形成一個(gè)小液滴

11、 (4) 接通電源，攪拌樣品溶液，萃取30 min，確保水浴的溫度始終控制在60 (5) 收回萃取溶劑液滴到進(jìn)樣針內(nèi)，并將針移出樣品瓶，直接進(jìn)GC-MS進(jìn)行分析。圖1 HS-LPME 示意圖 1. 色譜進(jìn)樣針；2. 有機(jī)溶劑液滴；3. 樣品溶液；4. 磁力攪拌子；5. 磁力攪拌器；6.水浴Fig.1 Schematic diagram of the HS-LPME apparatus 1.Micro syringe; 2.Extracting solvent; 3.sample; 4.magnetic muddler; 5.magnetic stirrer; 6.water heater2.結(jié)

12、果與討論2.1色譜條件的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)考慮了色譜柱的影響，采用30 m×0.25 mm×0.25µm Rtx-Wax毛細(xì)管柱和30 m×0.25 mm×0.25µm Rtx-5MS毛細(xì)管柱進(jìn)行分析，對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行了比較。Rtx-5MS毛細(xì)管柱幾乎不出峰。因?yàn)镋C和PC是屬于極性較強(qiáng)的酯類。所以最后實(shí)驗(yàn)選擇使用Rtx-Wax毛細(xì)管柱進(jìn)行分析，得到如圖二的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的色譜圖及如圖三的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的質(zhì)譜圖。圖二 氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的GCMS色譜圖Fig.2 Chromatogram of ethyl car

13、bamate and propyl carbamate by GCMS圖三 氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of ethyl carbamate and propyl carbamate by GCMS2.2 LPME條件的優(yōu)化2.2.1萃取溶劑的選擇萃取溶劑在液相微萃取中是至關(guān)重要的影響因素。本實(shí)驗(yàn)考察了癸烷、甲苯、正辛醇三類溶劑對(duì)氨基甲酸乙酯的萃取效率。分別在室溫，攪拌速度為200r/min的條件下萃取30min。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，甲苯和正辛醇在氨基甲酸乙酯的出峰時(shí)間內(nèi)對(duì)其有干擾。又對(duì)十二烷、癸烷、辛烷的萃取效果進(jìn)行了比較，十二烷在氨基甲酸乙酯的出峰

14、時(shí)間內(nèi)對(duì)其有干擾，辛烷在萃取時(shí)揮發(fā)的比較多，中間的萃取過(guò)程很難控制。故確定癸烷為萃取溶劑。2.2.2萃取溫度的影響萃取溫度是影響分析物分布平衡的一個(gè)重要因素，升高溫度有助于分析物從基體中脫離出來(lái)，也有利于提高分析物的擴(kuò)散速度，從而提高分析速度。本實(shí)驗(yàn)研究溫度從30到80范圍內(nèi)對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明，溫度在60以后萃取效率的變化不大，因此本實(shí)驗(yàn)采用60作為萃取溫度。2.2.3萃取時(shí)間的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了萃取時(shí)間分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min時(shí)對(duì)EC萃取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取時(shí)間越長(zhǎng)萃取效率越高。但是考慮到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，最終選擇了30min

15、作為萃取時(shí)間。2.2.4攪拌速度的影響在液相微萃取過(guò)程中，攪拌樣品，有利于氨基甲酸乙酯的揮出，可縮短達(dá)到萃取平衡的時(shí)間，從而提高萃取效率。但是如果攪拌速度過(guò)快，2mL樣品瓶?jī)?nèi)的樣品會(huì)產(chǎn)生很大的渦旋，影響萃取過(guò)程中懸掛液滴的穩(wěn)定性。因此，考察了攪拌速度從0500r/min時(shí)對(duì)萃取效率的影響。最后確定攪拌速度為200r/min。2.2.5樣品溶液PH值的影響本實(shí)驗(yàn)研究了PH值從酸性、中性、堿性范圍內(nèi)對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明，PH值對(duì)EC萃取效率影響不大。因此樣品溶液未作PH值的調(diào)整。2.3 線性范圍、檢出限和富集倍數(shù)用丙酮配置EC+PC的濃度分別為100+300、200+300、300+300、

16、800+300、1600+300 µg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（PC為內(nèi)標(biāo)）。用“1.3”節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行萃取、測(cè)定。得到如圖四的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)EC的線性關(guān)系良好。相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9999。EC的檢出限為1µg/L（S/N=3）富集倍數(shù)為62。圖四 內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of internal standard method2.4 實(shí)際葡萄酒樣品及加標(biāo)回收率的測(cè)定按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)未經(jīng)處理的11個(gè)實(shí)際葡萄酒樣品進(jìn)行液相微萃取、測(cè)定。測(cè)得氨基甲酸乙酯的含量在5.056.1 µg/kg之間。 3. 結(jié)論葡萄酒中氨基甲酸乙酯含

17、量問(wèn)題已經(jīng)引起了世界各國(guó)的普遍關(guān)注，當(dāng)前迫切需要對(duì)我國(guó)葡萄酒中的EC限量及降低其含量。本實(shí)驗(yàn)建立了頂空液相微萃取/氣相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的方法?？煽焖佟㈧`敏地分析葡萄酒樣品中的氨基甲酸乙酯含量。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的方法為在釀造過(guò)程中產(chǎn)生的EC含量的檢測(cè)提供了依據(jù)。也為進(jìn)一步研究在發(fā)酵過(guò)程中減少EC的方法研究提供了方法支持。參考文獻(xiàn)：1 Canas B J, Joe F L, Diachenko GW, et al. Determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages and soy sauce bv chroma

18、tography with mass selective detection：collaborative study JJournal of AOAC International，1994，77：153015362 中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口酒類中氨基甲酸乙酯殘留量檢驗(yàn)方法S3 梁新紅，趙功玲. 酒精飲料中氨基甲酸乙酯分析前處理技術(shù)研究進(jìn)展J, 中國(guó)釀造，2009. 8:144 閻雪，姜自軍. 頂空液相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜在葡萄酒風(fēng)味組分檢測(cè)中的應(yīng)用J. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2011. 17(7); 51555 Yan X, Yang C, Li DH, et al. Import

19、ance of extracting solvent vapor pressure in headspace liquid-phase microextractionj. Journal of Chromatography A, 2008, 1205:1821856 Deng C, Yao N, Wang A, et al. Determination of essential oil in a traditional Chinese medicine, Fructus amomi by pressurized hot water extraction followed by liquid-phase microextraction and gas chromatographymass spectrometryJ. Analytica Chimica Acta, 2005.536(1): 2372447 Chen Y I, Su Y S, Jen J F. Determination of dichlorvos by on-line microwave-assisted extraction coupled to headspace soli