1、細胞周期生物學基礎細胞的生成依賴于細胞的分裂而產生兩個子代細胞的過程。在分裂過程最需要復制并傳遞給子代細胞的是細胞核，因為它包含了細胞的遺傳信息載體-DNA。在絕大多數(shù)情況下，一個生物體的每個細胞都含有相等的 DNA物質和相同成份的染色體。因此，細胞在分裂前必須復制DNA這樣它的子代細胞就能夠擁有與父代相同的DNA含量。細胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代繼續(xù)復制并分裂，這個過程稱之為細胞周期。在細 胞周期中最具特征性的階段是在分裂前的DNA含量增加并達到2倍量的時候，并在此時細胞開始分裂其自身-有絲分裂期。細胞周期中這兩個循環(huán)步驟通常以一字母來表示：S期（合成期）和M期（有絲分裂期）。當

2、細胞周期中的S期和M期被定義后，我們可觀察到在有絲分裂完成后和DNA合成剛開始之時有短暫的停頓或間隙，同樣的停頓或間隙存在于DNA合成期后和有絲分裂開始之時。這兩個間隙我們將之命名為G1和G2期。這樣整個細胞周期可劃分為 G1 t S t G2 t Mt G1,如下圖 所示：當細胞沒有進入分裂過程時（我們機體中的絕大部分細胞），它們處于細胞周期的 G1期的位置上。因此G1細胞在數(shù)量上絕對是居各期細胞之首并在流式圖譜上形成最高的信號峰。在G1期細胞中有一群細胞特別安靜并且沒有進入細胞循環(huán)的任何生物學特征，我們稱這些細胞為G0期細胞。一些發(fā)生在G1和G2期細胞內的生物過程現(xiàn)還不完全明了。處于G1期

3、的細胞已開始為分裂前的DNA的復制和細胞成長準備許多 RNA和蛋白分子。處于 G2期的細胞則會修復在 DNA復制過程 發(fā)生的錯誤并識別出在 M期時將DNA平均等分的切割位置。G1細胞循環(huán)中這些階段的長度因細胞種類的不同而不同。典型細胞循環(huán)中各期的發(fā)展時間為: 期12小時，S期6小時，G2期4小時及M期0.5小時。分析和流式細胞術細胞周期分析流式細胞最初的應用之一便是檢測細胞的DNA含量，它可快速將細胞循環(huán)中的其它階段與有絲分裂期區(qū)別開來。這些檢測是基于對細胞內DNA以化學定量方式的染色（染料著色數(shù)量直接與細胞內DNA含量相關）。有相當多的對DNA有高親合力的染料可用于此應用。而不同的染料與 D

4、NA分子結合的位點不同。現(xiàn)用得最多的兩種 DNA結合染料是藍光激發(fā)的碘化匹啶（PI）（或偶爾也有用EB）和紫外激發(fā)的DAPI和Hoechst染料33342和33258。PI染料是一種插入性的與雙鏈 DNA和RNA （當要特異地 檢測DNA時，經(jīng)常使用RNAse去除RNA ）結合，而DAPI和Hoechst染料僅與DNA的螺旋結構的 亞級凹槽結合并與RNA完全沒有任何結合。Hoechst 33342是現(xiàn)唯一令人滿意的能對活細胞DNA時行染色的染料。其他一些染料在染色前需要破壞細胞膜，故經(jīng)常使用去污劑或低滲溶液處理 或溶劑進行固定（酒精）。*注意：使用溶劑進行固定（如酒精）經(jīng)常會引起細胞聚集，詳情

5、見分析細胞聚集。 當運用DNA結合熒光染料后，可觀察到一個有特征的圖譜，那就是由各種細胞組成的一個細胞 周期分布圖。當二倍體細胞被化學定量式 DNA染料著色后并在流式細胞儀上分析，會觀察到一個很“窄”熒 光峰。它將出現(xiàn)在以熒光強度為 X軸、細胞數(shù)量為Y軸的坐標上。因為種種原因 G1期細胞具有 相同的DNA含量，理論上G1期細胞的DNA含量熒光強度應當一致， 并在直方圖上的一個通道上 出現(xiàn)信號（如圖2.2A中，在直方圖上出現(xiàn)一條 G1期細胞的熒光直線）。圖2.2分別顯示了一個理想狀態(tài)中一臺完美的流式細胞儀無偏差檢測的直方圖（A ）和實際分析得到的呈高斯分布的直方圖（B）。在B圖中，使用Dea n

6、和Jett多項式S期分析模型進行分析識別出 的G1、G2和S期細胞分布。如果流式細胞儀十分完美且 DNA 染料的特異性絕對專一，這種情況將會發(fā)生。而在實際中，流 式細胞儀本身存在著許多變異性，此外DNA 染料的著色也存在生物學的變異。因此，檢測得出的G1期細胞的熒光分布正常的是呈高斯曲線分布。這種“鐘”型分布與檢測的變異相關（圖2.2B）。檢測中的變異越大，高斯曲線的寬度越寬。有一個名為“變異系數(shù)”（CV ）的指標用于描述峰的寬度。CV是一種規(guī)格化的標準差，定義為 CV=100*標準差/平均值。相類似，G2和M期細胞它們擁有兩部的正常 G1期細胞的DNA含量，從而在直方圖上形成一個兩 倍于G1

7、信號峰D.I.2.0的高斯峰（見圖2.2）。實際上，G2/G1的比值常小于2.0，可能是因為G2期細胞的DNA-蛋白（染色質）聚集得更緊密 或更濃縮。從而DNA染料著色時與DNA位點的結合能力被削弱。最常見的G2/G1的比值是1.97。在理論上的完美流式細胞儀上檢測時，S期細胞將分布自所有 G1期細胞直方圖右側并一至延伸到所有G2期細胞直方圖的左側。因為細胞一旦開始進入S期便會開始合成DNA，并緊帖著G1期細胞開始向外延伸。而后 DNA含量不斷增加直至完成 S期階段進入G2期。不幸的是，實際中的直方圖分布并不是如此簡單，這是因為G1、G2期的DNA峰分布并直線，而是有寬度的高斯分布，而 S期分

8、布則更寬。所形成的結果是早期 S期細胞與G1期細胞相互疊加， 而后期S期細胞與G2期細胞相互疊加。區(qū)分這些疊加細胞而計算出正確的G1、S和G2期細胞是以下章節(jié)討論的內容。二倍與異倍體細胞的 DNA 含量正如前面介紹的那樣， 機體所有的G1期細胞，極少例外，都具有相同的DNA含量和染色質結構。 在哺乳動物中，每個染色體具有兩條構成。 這在細胞遺傳學者認為是具有 “雙重DNA含量”（根 據(jù)實際觀察到的染色體數(shù)量）的細胞，并且定義了“2N ”來描述它們（N是指單個染色數(shù)量，單倍染色體的DNA含量）。而流式細胞儀通常也有相關的術語來描述：“DNA指數(shù)（D.I.）1.0”來指代這些 G1 期細胞的 DN

9、A 含量。具有其他DNA含量的細胞并意味著一定是屬于異常，如以上介紹的S期和G2細胞和僅有單倍染色體生殖細胞，及一些在體內具有四倍 DNA含量（D.I.2.0 ）的細胞（其他例外情況，如存在少 數(shù)多核細胞）。所有這些細胞的DNA都具有“整倍”關系，它們之間的差別都是以完整的染色 體組為單位的，而這些染色體組中的各染色體都擁有其自身的完整性。任何DNA 含量異常的細胞其染色體組首先發(fā)生的異變或致少染色體的結構發(fā)生了改變，這們將這些細胞稱為“異倍” DNA 含量（針對于整倍體之言） 。因為整個細胞或細胞核 DNA流式細胞儀無法確切檢測出染色體數(shù)量，流式細胞儀無法確定哪些 是DNA指數(shù)為1.0的正常

10、細胞，所以要使用已知樣本來事先定義二倍體細胞。同樣的，當細胞的DNA指數(shù)為2.0時我們稱之為G2期細胞，或四倍體細胞或一個擁有異常 DNA 含量的異倍體細胞。在流式細胞儀進行檢測時，它的位置事先也要精確地進行定義。流式細胞儀通過觀察 DNA指數(shù)為非1.0整倍的細胞而能檢測出染色體的變化，但這些細胞的染色 體的結構和數(shù)量必須發(fā)生了改變。因為名詞“異倍體”實際是指通過染色體來確認的，當我們通過流式細胞儀檢測 DNA含量來發(fā)現(xiàn)它們時，要以“ DNA-異倍體”來形容它們。DNA 異倍體細胞通常，但非絕對，與惡性組織有關系。但一些例外情況必須注意，如一些良性 腫瘤（如內分泌腺腫瘤）和惡變前的上皮細胞。當

11、一個惡性腫瘤通過流式細胞儀 DNA- 異倍體峰檢測出來時， 直方圖分析時會發(fā)現(xiàn)在腫瘤中異倍 體細胞與二倍體細胞相互混合。二倍體細胞包括淋巴細胞、內皮細胞、纖維原細胞和一些基質 成份，它們經(jīng)常在樣本中占一定的數(shù)量。腫瘤和基質細胞都會有部分細胞正在進行細胞循環(huán)過 程，經(jīng)歷著G1 t S t G2 t M期（基質細胞的S和G2期細胞數(shù)量通常比惡性細胞的要少得 多），所以此時得到的DNA直方圖通常是由兩個細胞循環(huán)相互疊加構成的，但MultiCycle和ModFit 都有專門的模型對它們進行分析。細胞周期分析和 DNA 含量直方圖DNA直方圖要求數(shù)學方法來進行分析目的是精確地識別出被覆蓋的 G1、S和G

12、2期細胞的分布; 這些分析方法已經(jīng)歷了過去二十多年的發(fā)展與完善。從 DNA含量直方圖中提煉出細胞周期圖的 方法也從簡單的圖形識別發(fā)展到更為復雜的曲線擬合。所有簡單分析方法都是基于 G1和G2期細胞與S期之間疊加很少，G1和G2期細胞數(shù)量與直方圖上 檢測到的G1、G2期數(shù)量接近的假設。有兩種具體計算方法。第一種是通過計算G1期曲線的左半部分和G2期曲線的右半部分，然后翻倍后得出G1、G2期細胞，而剩余部分便是 S期細胞。第二種方法是只利用最中間的 S期細胞分布，并向左側G1期平均熒光強度和右側 G2期平均強度延 伸而計算出S期細胞。而左、右側剩余部分便分別是G1和G2期細胞。這些方法僅在只有一個

13、細胞循環(huán)周期的直方圖上才能得出比較準的結果。以上兩種方法都假設G1和G2峰是左右對稱的（實際上不同組織染色后并不形成這種對稱峰）并且兩峰的中間點能夠被精確地識別出來。然而由于G1和G2峰與S期峰總是相互疊加的，所以這些峰的平均值往往并不在它們的最高點上， 特別是G2峰。如果存在第二個細胞周期時，兩種周期的細胞相互疊加從而使這種分析方式變得 很不可靠。 此外， 在這種簡單的圖形分析方法通常不對細胞碎片和細胞聚集建立模型進行排除。更具柔性和精確的細胞周期分析方法是基于用數(shù)學方法構造出的DNA含量分布圖，然后使用曲線擬合方法將這些模型與數(shù)據(jù)進行匹配。建立得最好的模型是由 Dea n和Jett在197

14、4年通過預言細胞周期直方圖是呈高斯分布的理論而建立的。相互疊加的G1、G2峰和S峰可用高斯曲線重新被描述出來。在最初的提議中，增寬的S期分布是由一個光滑的二次幕拋物線方程來描述的（拋物線的一個部分， y = a + bx + cx2 ）。這個模型可以被簡化為一次冪曲線（一個增寬的梯型，如以 一條直線方程，y = a + bx）或零度斜線（一個增寬的矩型，直線模型，y = a）來擬合。當直方圖的質量與理想中相差太大時，特別是G1或G2峰不呈高斯曲線分布時（底部增寬，傾斜或存在肩峰），簡化模型可減少引起 G1、S、G2峰疊加的影響。正如下面章節(jié)將要討論的那樣，這種情 況經(jīng)常出現(xiàn)在臨床樣本中。在這種

15、情況下，建意使用保守的零次幕或一次幕來擬后SB,除非對直方圖的質量高度可靠可選用二次冪。有些實驗驅動形成的S期 （通常是培養(yǎng)細胞）分布將會更復雜些，一些可選的分析模型可運用于 這些分布。最為適合的模型是將S期切割成一系列的高斯曲線，然后計算這些曲線的和。 在這個模型中，每個高斯曲線都可達到任意高度。因此S期可被完全地描述出來， 故此模型適用于一些復雜的S期圖型。以上這些模型的優(yōu)點也是在實踐中的主要缺點。相當靈活的描述S期峰型時會將任何人為造成的假數(shù)據(jù)也描述出來，并且還會增加近G1、G2期端的S期區(qū)域模糊性。一個比較折中的解決辦法是由 Fox （1980）提出的，他在Dean和Jett的多項式S

16、期模型中再增加了一個高斯 曲線。Fox的模型能夠較好地描述 S期圖型并同時又保持了 S期曲線的平整性。它特別適用于分 析經(jīng)藥物干預后形成的高 S期細胞。Fox模型整合在MultiCycle軟件中，其名稱為“SynchronouSS”使用二次幕曲線模型幾乎可擬合所有直方圖數(shù)據(jù)。擬合模型可生成數(shù)學表達式或函數(shù)來計算直 方圖中各期細胞的分布。表達式中有一系列的參數(shù)（通常在7至22）,它們必須被調整從而給出最與原始數(shù)據(jù)一致的模型。因為模型使的函數(shù)并非簡單的線性方程，而是非線性的二次幕函數(shù)。對于這種二次幕函數(shù)分析方法和相應的計算機程序最初由Bevington （1969）提出。最為通用此類分析方法是由M

17、arquardt （1963）提出的。所有的二次幕擬合技術都是帶自修整功能的：擬合函數(shù) 模型中的參數(shù)能自動修正從而可得出與原始數(shù)據(jù)最為貼近的方程，最終模擬出最接近的圖型。當修正過程中無更優(yōu)方案出現(xiàn)時，計算便會停止并得出理論上的最佳方案。擬合的優(yōu)度使用卡 合數(shù)據(jù)與實際數(shù)據(jù)的離散程度。二次幕擬合的速度是由尋找并發(fā)現(xiàn)最佳擬合參數(shù)的效率來決定 的。馬夸特運算方法會使用優(yōu)化的方案來尋找最低卡方值及最佳的擬合參數(shù)。方檢測來驗證或是它的簡化公式:來求證,它可檢測擬二次幕擬合方法的優(yōu)點這種模型可以直接分析有兩個甚至三個細胞周期相互疊加的樣本。疊加 模式分析部分是運用去卷積的數(shù)學方法來統(tǒng)計單個細胞周期的。二次幕

18、擬合方法的另一個優(yōu)點 是在擬合過程中它被分析時的起點等參數(shù)的影響較小。這些參數(shù)包括人為定義的細胞峰算術平 均位置和CVs值，及直方圖所分析區(qū)域的范圍。當細胞周期和碎片分析模型能最優(yōu)化地擬合數(shù) 據(jù)時，分析結果幾乎不受起始參數(shù)和相關人員操作的影響。有一點需充分認識：從腫瘤組織中獲得的DNA含量直方圖經(jīng)常較正常直方圖相去甚遠（高 CVs值，多碎片和細胞聚集）或更加復雜（出現(xiàn)幾個相互疊加的細胞周期），并經(jīng)常出現(xiàn)意料之外的峰型（如，偏峰及非高斯分布峰型）。這些情況在福爾馬林固定的樣本中更為多見。當一個偏向 的G1峰或帶有尾峰的G1,其右側延伸至S期時，對S期細胞的統(tǒng)計應格外小心。在分析這些不典型直方圖時

19、的一個重要方面是通過簡化假設來減少模型的擬合參數(shù)而降低分析 模型的復雜性。這可能會降低模型對直方圖細節(jié)的分析能力，但它同樣也降低了錯誤分析數(shù)據(jù) 的可能性。如上所述，有些模型可能會假設一個偏態(tài)的或低部過寬的G0或G1峰是S期的一個部分，從而引起了真正S期細胞的過量統(tǒng)計。一些更保守的模型在分析，因多個細胞峰相互疊加或 聚集細胞和細胞碎片過多時而引起的CVs過寬或細胞峰未很好分離的樣本時，它的精度會更好。這些情況將在以下的章節(jié)中進行討論。在以上情況下推薦使用Dea n和Jett的計算方法中零次幕（加寬矩形）或一次幕（加寬的四邊形）來替代較為靈活但更易出錯的二次幕模型。此外還可強制規(guī)定G2和G1期峰的

20、CVs值相等（它們通常下是相當接近的），或規(guī)定二倍體細胞的CVs值與 異倍峰的相等，或根據(jù)以往實驗室經(jīng)驗提供 G2/G1的比值。請參考第8章-擬合選項，來獲得更多 的相關信息。最后，下面將介紹，仔細地擬合細胞聚集和碎片背景也是在分析復雜直方圖中獲得最佳細胞周 期結果的重要方面。擬合“碎片”及細胞核切割物背景幾乎所有作流式細胞儀 DNA含量分析的細胞或細胞核懸液都存在一些被破壞或損壞的細胞核 （碎片），它們通常分布在二倍體 G1期的左側。當樣本源自于新鮮組織或細胞，這些碎片信號 會出現(xiàn)在直方圖的左邊界并迅速回落至底線。在理想狀態(tài)下，碎片信號并不會影響細胞周期直方圖。然而實際中卻非如此，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)用

21、計算機擬合碎片分布并去除其對細胞周期各峰的影響 至關重要。傳統(tǒng)的碎片擬合假設是碎片曲線從高峰迅速回落至底線并可用一個指數(shù)函數(shù)（e-kx）來擬合。但是其中存在兩大原因而造成了指數(shù)曲線擬合并不能精確模擬出碎片的分布：1）許多碎片分布并不是真正成指數(shù)曲線分布的。而一個從高峰迅速回落至一定高度后進入一個緩慢回落或平臺過程的情況卻最為多見。這個較為緩慢的回落部分對細胞周期的影響比指數(shù)曲 線預測的影響要大得多。2）碎片是因為細胞被溶解、 破碎或細胞核被切割而造成的， 所以它們只向DNA峰的左側延伸（微 小DNA含量峰）。因此，碎片峰的形態(tài)是依靠于 DNA直方圖中個峰位置的，并且碎片不可能獨 立于細胞細胞峰

22、之外。因為 S期是細胞周期中含量最低分布最廣的部分，S期的計算受以上影響圖23 擬合石蠟包埋組織二倍體細胞。（A ）使用簡單指數(shù)曲線擬合碎片曲線，（B）直方圖依靠， 指數(shù)似后，（C）切核模式擬合碎片。如圖所示各種分析方法對細胞周期中 S期的影響各不相同。簡 單指數(shù)擬合開始點從碎片的最左側開始至接近于 G1峰，如圖（D），所得出的S期檢測結果與（A） 圖中差別很大。圖（E）顯示窄范圍直方圖依賴性指數(shù)碎片擬合， 得出的S期細胞比圖（B ）要少22%。 相比而言，切核模式擬合的結果受改變分析區(qū)域的影響最小，如圖（ E ）。為了演示以上兩種觀點，可以試用不同的模型來分析由石蠟包埋組織提取細胞的DNA直

23、方圖。圖2.3A顯示了以一個簡單的指數(shù)曲線來擬合G1期峰左側的碎片。這種模式并沒有識別出許多混入G1期的碎片，根據(jù)分析區(qū)域的不同過多或過少地預測了混入S和G2期峰內的碎片。在MultiCycle中整合了一個更為成熟的指數(shù)模型來擬合碎片。在此要意識到DNA碎片是從DNA陽性峰開始只向左側延伸，MultiCycle中的模型假設每個 DNA陽性峰都會產生一定的碎片并向左側延伸。因為DNA含量峰左側從零到陽性出現(xiàn)的左側與右側直方圖的坐標長度不同，所以MultiCycle 指數(shù)曲線會擬合出一個看似 “陡峭” 的曲線， 并且它的后端將延續(xù)覆蓋很多通道并因 下降速度不同而出肩峰。MultiCycle中的“直

24、方圖依賴”性指數(shù)模型的運用結果如圖2.3B和2.3E。在這兩個例子中，因數(shù)據(jù)中絕大部分細胞都屬于G1期，背景碎片曲線由 G1峰的左側向右側迅速下降。圖2.3E顯示了在近G1峰處擬合碎片的曲線，而 2.3B顯示了遠G1峰的擬合曲線。因為此碎片擬合 曲線并不是真正的指數(shù)函數(shù)，所以選擇的分析區(qū)域不同得出的曲線也不同。S期的統(tǒng)計數(shù)據(jù)也不相同，2.3B與2.3E圖中S期值分別是4.1%和3.2%。從有利的方面分析，這個模型比簡單的指數(shù)模型要更有效。然而使用一個可對經(jīng)切片機處理過 和石蠟組織所形成的碎片專門分析的模型可得到一個更佳的分析結果。此模型可擬合碎片曲線 的任何部分，并且它并不受不同分析區(qū)域的影響

25、，圖2.3C和2.3F顯示該模型的結果。這個模型在分析石蠟切片樣本時特別有效，詳情見下文。分析石蠟組織在流式細胞儀 DNA 檢測應用中變得越來越重要。它不僅可對這類樣本進行回顧性 研究，從而使流式細胞儀分析結果與病人長期追蹤建立關系，而且在許多新鮮組織不可用的情 況下分析石蠟標本已作為臨床檢測的重要來源。為了取得有效的細胞周期信息，在分離細胞核及選擇細胞周期分析模型時要特別注意。作為從石蠟組織中提取細胞的一個步驟，組織塊通常要用切片機將組織切成近50卩m的薄片，從而不可避免出現(xiàn)細胞核碎片。這些細胞核碎片將影響S期細胞的計算，但使用一個可分析切核的模 型來分析碎核可有助于糾正這些影響?？梢韵胂笤?/p>

26、切片機刀片軌道上的細胞核將被隨機地切成兩個部分。如果將細胞核簡單地想象成 球形體并被垂直地隨機切割，切割的部位從零位點到整個細胞核的概率應該是相等的。在這個假設模型下，將出現(xiàn)一個由自完整核 DNA 峰相開始的最大切割碎片或未切割核向左延伸 到DNA含量為零的連續(xù)線。這當然是一個最簡化的模型，但在1988年由MultiCycle推出后，它在擬合這些類型的碎片時比以往的模型的效果都要好。實際上，需仔細觀察這個模型所擬合曲 線并比較它與圖 2.4中介紹的改良后模型的效果。St-bauGlear UNA GontentsCheated Nucie-ar Ssetoriiricqvol LI rr. & (3r-h)DNA Content圖24顯示了細胞核經(jīng)切割后形成的碎片。以最簡單的球形細胞核為例，如果細胞核的直徑為“ r ”， 刀片以“h ”距離切割細胞核，所形成的碎片的體積計算公式如上