1、大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的誘變和篩選鑒定關(guān)于菌株的幾個概念：野生型菌株：從自然界別離到的微生物在其發(fā)生突變前的原始狀態(tài).營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)過人工誘變或自然突變失去合成某種營養(yǎng)的水平,只有在根本培養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長.原養(yǎng)型：營養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株,其營養(yǎng)要求在表型上和野生型相同關(guān)于培養(yǎng)基：根本培養(yǎng)基minimalmediumMM:僅能滿足微生物野生型菌株生長需要的培養(yǎng)基,用來表不.完全培養(yǎng)基completemedium,CM:凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基.用+來表示.補充培養(yǎng)基supplementalmedium,SM:凡只能滿足

2、相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組全培養(yǎng)基,它是在根本培養(yǎng)基中參加該菌株不能合成的營養(yǎng)因子而組成.摘要：本實驗選用紫外線為誘變劑,來誘發(fā)大腸桿菌突變,并用青霉素法淘汰野生型,逐個測定法檢出缺陷型,獲得100秋腸桿菌菌株,最后經(jīng)生長譜法鑒定出該菌株為xxx缺陷型.關(guān)鍵詞：大腸桿菌紫外線營養(yǎng)缺陷型青霉素逐個測定法生長譜法一、目的1、了解營養(yǎng)缺陷型突變株選育的原理.2、學(xué)習(xí)并掌握細菌氨基酸營養(yǎng)缺陷型的誘變、篩選與鑒定方法.二、原理篩選營養(yǎng)缺陷型菌株一般具有四個環(huán)節(jié)：誘變處理、營養(yǎng)缺陷性的濃縮、檢出、鑒定缺陷型.本實驗選用紫外線為誘變劑,來誘發(fā)突變,并用青霉素法淘汰野生型,逐個測定法檢出缺陷型,最后經(jīng)生長譜

3、法鑒定細菌的營養(yǎng)缺陷型.三、器材離心機,紫外線照射箱,冰箱,恒溫箱,高壓滅菌鍋；三角燒瓶,試管,離心管,移液管,培養(yǎng)皿,接種針四、材料一菌種E.coli二培養(yǎng)基、1 LB培養(yǎng)液Luria-Bertani培養(yǎng)基,這個名字來源于英語的lysogenybroth,即溶菌肉湯.是微生物學(xué)實驗中最常用的培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)大腸桿菌等細菌,分為液態(tài)培養(yǎng)基和參加瓊脂制成的固態(tài)培養(yǎng)基.參加抗生素的LB培養(yǎng)基可用于篩選以大腸桿菌為宿主的克隆.：酵母膏,0.5g;蛋白月東,1g;NaCl,0.5g;水,100ml,pH7.2121c滅菌15min2 2XLB培養(yǎng)液：其它不變,水,50ml.3 根本培養(yǎng)基：葡萄糖0.5

4、g,NH42SO40.1g,檸檬酸鈉0.1g,MgSO47H2.0.02g,K2HPO40.4g,KH2PO40.6g,重蒸水100mL,pH7.2,110c滅菌20min.配固體培養(yǎng)基時需加2%洗滌處理過的瓊脂.全部藥品需用分析純,使用的器皿需用蒸儲水或重蒸水沖洗23次.4 無N根本液體培養(yǎng)基：K2HPO4,0.7g;KH2PO4,0.3g;檸檬酸鈉3H2O,0.5g;MgSO47H2O,0.01g;葡萄糖2g;水100ml,pH7.0110c滅菌20min5 2N根本培養(yǎng)基：K2HPO4,0.7g;KH2PO4,0.3g;檸檬酸鈉3H2O,0.5g;MgSO47H2O,0.01g;NH42

5、SO4,0.2g;葡萄糖2g;水100ml,pH7.0110c滅菌20min6 完全培養(yǎng)基同LB培養(yǎng)基,配置固體培養(yǎng)基,需加2%的瓊脂.7 混合氨基酸和混合維生素五、步驟1菌懸液制備1取E.coliK12一環(huán)參加到10mlLB培養(yǎng)液中在37c下過夜培養(yǎng)；2取0.3屋菌液轉(zhuǎn)接到10mlLB培養(yǎng)液中,在37c搖床上振蕩培養(yǎng)46小時,使細胞處在對數(shù)生長期；3取適量菌液參加到5ml離心管中,7000rpm離心3到4min,離心2次,棄上清液,打勻沉淀,各參加4ml無菌生理鹽水,充分振蕩混勻.2誘變處理1取3ml菌懸液,參加到7cm小皿內(nèi),輕輕震蕩使其均勻在皿底形成一薄層.平放在滅菌的超凈工作臺上,蓋蓋

6、滅菌1min,然后翻開皿蓋照射2min15Wo2誘變后處理取3ml誘變后菌液參加到離心管中,7000rpm離心3到4分鐘,棄上清,參加4ml生理鹽水離心洗滌2次,重懸于3ml生理鹽水中,取0.2屋參加到5ml2LB根本培養(yǎng)基內(nèi),37C培養(yǎng)過夜后培養(yǎng).3檢出缺陷性菌株1初篩：從培養(yǎng)12、16、24h的菌液中,各自取100,分別在LB完全培養(yǎng)基和根本培養(yǎng)基上涂布2個平板,做好標記,在37C下培養(yǎng)36h.2復(fù)篩：簽挑取完全培養(yǎng)基上長出的菌落200個,分別點種在根本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上,37C過夜培養(yǎng).4復(fù)證挑取LB完全培養(yǎng)基上有而根本培養(yǎng)基上沒有的菌落,在根本培養(yǎng)基上劃線復(fù)證,并在完全培養(yǎng)基上保存?zhèn)?/p>

7、份,37C過夜培養(yǎng).24小時后仍不長的為缺陷型.5生長譜鑒定1營養(yǎng)缺陷型濃縮淘汰野生型3thday,延遲處理：吸菌液5ml于離心管中,3500rpm離心10min,棄上清.離心洗滌兩次加生理鹽水至原體積,打勻沉淀,離心,棄上清,重復(fù)一次,最后加生理鹽水制成5ml菌懸液.取0.1ml菌液于5ml無N培養(yǎng)基中,37c培養(yǎng)12h.消耗體內(nèi)的N素,使停止生長,預(yù)防缺陷型被以后參加的青霉素殺死4thday,按1:1比例參加2N根本培養(yǎng)液5ml,加5萬U/ml青霉素鈉鹽溶液100ul,使青霉素在溶液中的最終濃度約為500U/ml,再放入37c培養(yǎng).野生型利用氮大量生長,細胞壁不能完整合成而死亡,缺陷型因不

8、長預(yù)防被殺死.5thday,從培養(yǎng)12、14、16、24小時根據(jù)實際情況,選擇2-3個時間段的菌液中分別取0.1ml菌液到根本及完全培養(yǎng)基兩個培養(yǎng)皿中,涂布,37c培養(yǎng).2營養(yǎng)缺陷型檢出7thday,檢出營養(yǎng)缺陷型.上述平板培養(yǎng)3648h后,進行菌落計數(shù).選取完全培養(yǎng)基上長的菌落數(shù)大大超過根本培養(yǎng)基的那一組,用滅菌牙簽挑取完全培養(yǎng)基上長出的菌落100個分別點種于基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上先根本,后完全,37c培養(yǎng).9thday,選在根本培養(yǎng)基上不長,完全培養(yǎng)基上生長的菌落在根本培養(yǎng)基上劃線,37c培養(yǎng)24h,仍不長的是營養(yǎng)缺陷型.3營養(yǎng)缺陷型鑒定在同一平皿上測定一種缺陷型菌株對許多種生長因子的需

9、求情況為生長譜法.單一生長因子：鑒定氨基酸或維生素的營養(yǎng)缺陷型,較為簡便的方法是分組測定法.將21種氨基酸,組合6組,每6種不同氨基酸歸為一組.如果以15種維生素進行測定,那么把5種維生素歸為一組,共5個組合組別氨基酸組合組1 賴氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸異亮氨酸2 繳氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸3 蘇氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸大冬氨酸4 丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸絲氨酸5 鳥氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6 月瓜氨酸異亮氨酸組氨酸大冬氨酸絲氨酸谷氨酰胺組別維生素組合組維生素A維生素B1維生素B2維生素B6維生素B12維生素C維生素B1維生素D2維生素E煙酰胺葉酸維生素

10、B2維生素D2膽堿泛酸鈣4對氨基苯甲酸維生素B6維生素E膽堿肌醇5生物素維生素B12煙酰胺泛酸鈣肌醇10thday,生長譜的測定：將檢出的營養(yǎng)缺陷型菌落接種于5mlLB液試管中,37c培養(yǎng)1416h.11thday,培養(yǎng)16h的菌液離心.3500rpm,10min,棄上清,力口生理鹽水,打勻沉淀,再次離心.加5ml生理鹽水制成菌懸液.取其1ml于培養(yǎng)皿中,參加融化后冷卻到40-50c的根本培養(yǎng)基,混勻,平放,共二皿.平板外表分別沾上沾有混合氨基酸或酪素水解液的濾紙片,30c培養(yǎng)24h,經(jīng)培養(yǎng)后營養(yǎng)物質(zhì)周圍有生長圈,即說明為氨基酸的營養(yǎng)缺陷型菌株.將皿底分成分格用接種環(huán)依次放入少許混合氨基酸等,

11、37c培養(yǎng)24h,觀察生長情況,確定是哪種氨基酸營養(yǎng)缺陷型.圖1生長譜鑒定點樣圖示右圖中1、2、3、4、5均為氨基酸組合六、實驗結(jié)果與分析1、營養(yǎng)缺陷型檢出點植對照時每平皿點30株菌,最后在根本培養(yǎng)基上沒有長出的菌株,而在是完全培養(yǎng)基上長出菌落的,即為篩選出的營養(yǎng)缺陷型菌株.2、營養(yǎng)缺陷型鑒定通過如圖1生長譜鑒定,得到如圖2結(jié)果：生長譜鑒定結(jié)果圖圖2分析：如圖中,1,2,3,4,5任意區(qū)域有生長圈生成即對應(yīng)為相應(yīng)氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株.七、結(jié)論與討論結(jié)論：本實驗選用紫外線為誘變劑,來誘發(fā)大腸桿菌突變,并用青霉素法淘汰野生型,逐個測定法檢出缺陷型,獲得100#大腸桿菌菌株,最后經(jīng)生長譜法鑒定出該菌

12、株為XXX缺陷型.討論：1、考前須知：紫外線對皮膚和眼睛有很大傷害,實驗中應(yīng)預(yù)防人體暴露在紫外線中.各種器具、培養(yǎng)基及需參加培養(yǎng)基中的試劑均需滅菌.2、本實驗中的突變型是氨基酸缺陷型,我們是可以檢測的,如果是與N元素代謝有關(guān)的其他缺陷型,我們無法通過這個實驗檢測.3、本實驗中經(jīng)紫外線照射后,誘變率較低,可能是由于照射時間短,誘變劑量小,或者是黑暗培養(yǎng)不完善導(dǎo)致光復(fù)活作用,可將誘變后的菌體進行后培養(yǎng).八.考前須知實驗過程中要嚴格限制無菌,在菌落的選取、劃線培養(yǎng)、菌懸液的吸取、接種等環(huán)節(jié)都要進行嚴格的無菌操作,任何一部的雜菌污染都會對最終的實驗結(jié)果造成嚴重影響.在用牙簽篩選點種的時候要注意牙簽不能

13、將培養(yǎng)基戳破,這樣不利于菌落的生長,也不利于觀察,另外還要注意點樣的順序是先基本培養(yǎng)基后完全培養(yǎng)基.在根本培養(yǎng)基上的點接量一定要少,以預(yù)防細胞過多及細胞老化而導(dǎo)致自溶現(xiàn)象的發(fā)生,從而引起缺陷型突變體也可以在根本培養(yǎng)基上生長的現(xiàn)象.在傾注平板時培養(yǎng)皿必須在使用之前嚴格的無菌,培養(yǎng)基的溫度要嚴格限制,否那么容易燙死參加的細菌或者由于凝固而使混勻失敗.在最后一步鑒定營養(yǎng)缺陷型時要注意氨基酸的點樣不能過多,要用牙簽蘸取氨基酸后輕輕抖動即可.如果點樣過多會造成氨基酸在培養(yǎng)基中的擴散,從而對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響.拓展討論傾注培養(yǎng)法進行生長譜的鑒定有其優(yōu)點.由于氨基酸沒有經(jīng)過滅菌處理,而且在氨基酸點樣過程中很容易發(fā)生受雜菌污染,這樣就很有可能導(dǎo)致培養(yǎng)基的外表有雜菌菌落產(chǎn)生.比方這時候采用涂布法,那極有可能引發(fā)實驗的