1、南京林業(yè)大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)開題報(bào)告 學(xué)生姓名陸陽(yáng)學(xué) 號(hào)120204111專 業(yè)生物工程指導(dǎo)教師姓名李鑫職 稱副教授所在學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院選題來源科研課題選題類型畢業(yè)論文選題名稱米根霉生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)產(chǎn)有機(jī)酸的影響機(jī)制研究的目的及意義 以米根霉為出發(fā)菌株，研究米根霉利用葡萄糖生產(chǎn)有機(jī)酸的過程，發(fā)酵條件的變化對(duì)產(chǎn)有機(jī)酸的影響機(jī)制，研究米根霉生長(zhǎng)環(huán)境的變化對(duì)產(chǎn)有機(jī)酸的影響，為生物轉(zhuǎn)化制備有機(jī)酸，提供數(shù)據(jù)依據(jù)。國(guó)內(nèi)外同類研究概況富馬酸作為重要的四碳平臺(tái)化合物之一，已經(jīng)被美國(guó)的能源部列入優(yōu)先發(fā)展的十二種平臺(tái)化合物之一，由于世界資源日益緊缺，尋找廉價(jià)的制備富馬酸的方法成了我們目前急需解決的問題。研究?jī)?nèi)容及計(jì)劃以

2、米根霉為出發(fā)菌株，研究pH值的變化對(duì)米根霉產(chǎn)富馬酸和L-蘋果酸的影響，并優(yōu)化產(chǎn)酸的米根霉發(fā)酵條件。2016.1-2016.3 文獻(xiàn)檢索，資料準(zhǔn)備，開題報(bào)告及探索性實(shí)驗(yàn)2016.4-2016.5 分步實(shí)驗(yàn)2016.5-2016.6 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，撰寫論文及論文答辯特色與創(chuàng)新1、研究米根霉的發(fā)酵條件變化對(duì)產(chǎn)富馬酸的影響。2、討論誘變條件使富馬酸產(chǎn)量變化的原因。指導(dǎo)教師意 見 指導(dǎo)教師簽名： 年 月 日1研究背景 隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步，人類對(duì)于自身的生存環(huán)境和資源利用越來越重視，特別是食品的安全問題以及石油資源的開發(fā)問題，這都和人類的長(zhǎng)期發(fā)展息息相關(guān)，而這就不得不提到富馬酸這種物質(zhì)。富馬酸

3、作為重要的四碳平臺(tái)化合物之一，已經(jīng)被美國(guó)的能源部列入優(yōu)先發(fā)展的十二種平臺(tái)化合物之一1。富馬酸(Fumaric Acid)，又名延胡索酸(Fumarate)或反丁烯二酸(Trans-Butenedioic Acid)，是生物體內(nèi)一種重要的中間代謝產(chǎn)物，另外它在醫(yī)藥、涂料、樹脂、增塑劑等領(lǐng)域方面也有重要作用。甚至是一種可以用作食品添加劑和飼料添加劑的重要的有機(jī)化工原料。富馬酸味道純，酸度恰好是檸檬酸的1.5倍，它不僅沒有毒副作用，而且在防腐抑菌方面有重要作用，是近些年來最新型的食品調(diào)味劑之一。并且我們可以通過富馬酸經(jīng)過酶法轉(zhuǎn)化的方法來制備L-蘋果酸和L-天冬氨酸，二者都是重要的食品添加劑，尤其是L

4、-蘋果酸，它是目前世界排名前列的酸味劑，開發(fā)前景巨大。隨著人們對(duì)日益枯竭的化石資源的開發(fā)，研究利用可再生生物資源制備富馬酸成為我們的必經(jīng)之路。由于世界糧食價(jià)格較往年呈上漲趨勢(shì)，使得發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸的方法成本隨之而增加，所以尋找廉價(jià)的制備富馬酸的方法成了我們目前急需解決的問題。2 文獻(xiàn)綜述2.1 富馬酸的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)富馬酸(Fumaric Acid)是最簡(jiǎn)單的不飽和的C4二元羧酸，它的結(jié)構(gòu)式見下圖它有兩個(gè)羧基，一個(gè)雙鍵。它的分子式為C4H4O4，分子量116.07。富馬酸為白色顆粒，結(jié)晶狀，有微酸氣味，沒有毒性，具有可燃性，可穩(wěn)定存在于空氣中，密度1.635 g/cm3，熔點(diǎn)299300 ，在

5、290 時(shí)升華，富馬酸可溶于乙醇溶液，在水和乙醚中微溶，在二氯甲烷中極微少可溶。其中在水中溶解度為0.63 g/100 mL，富馬酸即反丁烯二酸2，它和順丁烯二酸是幾何異構(gòu)體，反丁烯二酸經(jīng)過加熱到250-300 可轉(zhuǎn)變?yōu)轫樁∠┒?，富馬酸經(jīng)高錳酸鉀氧化還可以生成外消旋酒石酸。圖1 富馬酸結(jié)構(gòu)式2.2富馬酸的用途富馬酸在醫(yī)藥、涂料、樹脂、增塑劑、食品添加劑和飼料添加劑方面都有重要應(yīng)用。在醫(yī)藥方面，富馬酸鹽可以用來治療嚴(yán)重的銀屑病，它還可以防止多發(fā)性硬化癥，它還可以用于生產(chǎn)解毒藥二疏基丁二酸，它的反應(yīng)產(chǎn)物還可以用于治療小紅血球型貧血病，富馬酸鹽對(duì)人體的健康很有好處。它能改善牛皮癬的病癥，人體的皮膚

6、在陽(yáng)光照射下能自然產(chǎn)生富馬酸。富馬酸鹽常與左旋肉堿一起運(yùn)用，幫助身體產(chǎn)生對(duì)我們有利的物質(zhì)。此外，富馬酸鹽對(duì)鍛煉的恢復(fù)也有一定作用。在涂料方面，它是生產(chǎn)電泳漆的原料。它可以生產(chǎn)不飽和聚酯樹脂，這類樹脂具有耐熱和耐化學(xué)腐蝕性能好的優(yōu)良品質(zhì)，工業(yè)級(jí)富馬酸可生產(chǎn)醇酸樹脂。富馬酸與乙酸乙烯的共聚物又可以作為實(shí)用的粘合劑，它與苯乙烯的共聚物又可用來制玻璃鋼，由富馬酸所制得的增塑劑沒有毒性，乙酸乙烯乳膠與食品接觸時(shí)需要用到它。富馬酸鹽還可以使染料輕易地粘在織物上，生產(chǎn)服飾和毛毯3。富馬酸在食品方面的用途尤其廣泛，并且具有廣闊的發(fā)展前景?？偟膩碚f，富馬酸可用作酸度調(diào)節(jié)劑、酸化劑、抗氧化助劑、腌制促進(jìn)劑、香料、

7、發(fā)酵粉等。富馬酸以酸味劑的身份作為食品添加劑的一種，廣泛應(yīng)用于我們的日常生活中，例如涼茶類飲料、果味糖類、果凍類和布丁類制品、冰淇淋制品等，富馬酸與檸檬酸味道相似，它與NaOH反應(yīng)生產(chǎn)的單鈉鹽，也是酸味劑，另外它還可以用于肉、魚制品的加工等。富馬酸與NaCO3反應(yīng)生成的富馬酸鈉是一種獨(dú)特的風(fēng)味增強(qiáng)劑，它還是生產(chǎn)木糖醇的一個(gè)重要成分。2.3 富馬酸的制備方法目前，富馬酸制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。其中化學(xué)合成法主要是通過苯的催化氧化作用生產(chǎn)富馬酸，但這一方法面臨的難題是石油資源日益短缺的問題以及對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的巨大污染。這使得我們的關(guān)注點(diǎn)放在了微生物發(fā)酵法制備富馬酸的研究上，研究表明很多微

8、生物都可以用于制備富馬酸，如霉菌、酵母和細(xì)菌。尤其是根霉，它需要的營(yíng)養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，適應(yīng)力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，適合用于實(shí)驗(yàn)室研究等優(yōu)良品質(zhì)4。本次實(shí)驗(yàn)就是研究米根霉對(duì)富馬酸生產(chǎn)的影響。2.3.1 化學(xué)合成法富馬酸的化學(xué)合成法又分為順丁烯二酸酐（順酐）異構(gòu)法和糠醛氧化法。前者在合成樹脂、涂料、農(nóng)藥、潤(rùn)滑劑、醫(yī)藥產(chǎn)品、紙張?zhí)幚韯?、食品添加劑、穩(wěn)定劑等方面需求量大，該方法以順酐為原料，以苯法和正丁烷法為主要方法，催化劑為KBr-H2O2體系，產(chǎn)率93，具有少用量，運(yùn)輸便攜，不腐蝕設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是石油資源的緊缺5。 糠醛是水解農(nóng)林副產(chǎn)品而獲得的有機(jī)化工原料，它覆蓋面廣，生活中它在醫(yī)藥、農(nóng)夜、紡織、顏料、塑料、

9、絕緣材料、粘合劑、食品添加劑、合成樹脂和橡膠等產(chǎn)業(yè)都有著十分廣泛的用途。它是以糠醛為原料，植物纖維原料經(jīng)水解提純的方式，以V2O5為催化劑，它的產(chǎn)率為83，具有污染小，副產(chǎn)物可回收作為肥料的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是成本高?；瘜W(xué)合成法制備富馬酸目前面臨的最大的問題就是，資源的衰減速度大于我們對(duì)石油資源的開采，而且環(huán)境壓力也日益增大，我們?cè)诶觅Y源生產(chǎn)富馬酸的同時(shí)，也在產(chǎn)生著巨大的污染，破壞了生態(tài)的平衡。2.3.2 生物合成法富馬酸的生物合成法又分為酶催化轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。酶催化轉(zhuǎn)化法，一般以馬來酸為底物，在馬來酸異構(gòu)酶的催化作用下產(chǎn)富馬酸。這種方法具有高轉(zhuǎn)化效率和高產(chǎn)率。微生物發(fā)酵法，主要以霉菌發(fā)酵產(chǎn)富

10、馬酸，但是由于早期的技術(shù)水平還不夠，導(dǎo)致人們對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝不夠了解。是工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際可行性滯后的原因。再加上石油危機(jī)的加重，人們更加關(guān)注微生物發(fā)酵法制備富馬酸的研究?？梢杂脕碇苽涓获R酸的微生物有霉菌，酵母和細(xì)菌。其中，米根霉就是富馬酸發(fā)酵常用的菌種之一，米根霉具備淀粉糖轉(zhuǎn)化的能力，且所需的發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)物簡(jiǎn)單，適應(yīng)力強(qiáng)，生長(zhǎng)又快，菌絲和發(fā)酵液易分離，提取方便,產(chǎn)物純。本實(shí)驗(yàn)即使用米根霉產(chǎn)富馬酸6。2.4 利用米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸2.4.1 米根霉的簡(jiǎn)介米根霉屬真菌中的接合菌門、接合菌綱、毛霉目、毛霉科、根霉屬。菌落或疏松或稠密， 起初顯白色，后轉(zhuǎn)變?yōu)榛遥ê冢┖稚?。菌絲甸甸爬行，無色，米根霉的假根

11、發(fā)達(dá)，分枝呈指狀或根狀，顯褐色。抱囊梗直立或稍微彎曲，與假根對(duì)生，有時(shí)膨大或分枝，褐色，長(zhǎng)2102500 m，直徑518 m。囊軸呈球形或近球形或卵圓形，呈淡褐色，直徑30200 m囊托呈楔形。抱子囊呈球形或近球形，老后呈黑色，直徑60250 m抱囊抱子呈橢圓形、球形或其他形，呈黃灰色，直徑58 m。在3740 能正常生長(zhǎng)，最適合生長(zhǎng)的溫度為37 。米根霉可以利用淀粉等廉價(jià)原材料，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，菌絲體大且易分離，對(duì)富馬酸的精制有顯著提升作用，是國(guó)內(nèi)外目前研究火熱的發(fā)酵生產(chǎn)菌7。米根霉是中國(guó)藥和釀酒的重要霉菌，常見于土壤及空氣。能糖化淀粉、轉(zhuǎn)化蔗糖 ，產(chǎn)生乳酸、富馬酸和微量酒精。它還具有很強(qiáng)的淀

12、粉酶活力，常用于酒類及豆制品的發(fā)酵。 圖2 米根霉2.4.2 米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的代謝途徑富馬酸是TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物，而根霉菌的代謝過程中富馬酸則是通過其他途徑積累的。米根霉在葡萄糖的代謝模型中存在2條富馬酸合成途徑。一個(gè)是通過線粒體里的三羧酸循環(huán)，琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的作用下生成富馬酸，富馬酸可以借助于轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通過線粒體膜進(jìn)入胞液,也可在富馬酸酶催化下繼續(xù)反應(yīng)生成蘋果酸。另一條途徑存在于細(xì)胞液中，丙酮酸羧化酶是TCA還原途徑的關(guān)鍵酶之一，通過催化固定化CO2與丙酮酸反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶的作用下生成蘋果酸，蘋果酸再經(jīng)富馬酸酶的催化生成富馬酸8。 分析兩種途徑，后者途徑的

13、富馬酸理論得率遠(yuǎn)高于線粒體途徑的理論得率。不難看出，胞液途徑是富馬酸的主要合成途徑。為了提高富馬酸的實(shí)際得率,我們需要加大胞液途徑的代謝流，此外也不能過多地減少線粒體途徑，因?yàn)榫€粒體途徑產(chǎn)生的能量占細(xì)胞生長(zhǎng)和合成物質(zhì)所需要能量的絕大部分。 圖3 米根霉中富馬酸的代謝途徑所以我們要保證能量獲得充足的情況下，合理調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)，多增加胞液途徑的代謝通量來獲得較高的轉(zhuǎn)化率。2.4.3米根霉發(fā)酵條件優(yōu)化2.4.3.1發(fā)酵時(shí)間經(jīng)過不同時(shí)間的發(fā)酵，米根霉產(chǎn)得的富馬酸產(chǎn)量大約在120小時(shí)后趨于平穩(wěn)，合成富馬酸速度大幅衰減，所以可以確定米根霉最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間大約是120小時(shí)左右9。2.4.3.2碳氮源碳源：微生物

14、對(duì)碳的需求很大，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的干物質(zhì)里碳大約占一半 ，從 CO2、碳酸鹽等這些簡(jiǎn)單的無機(jī)物，到糖的衍生物、脂類等這些復(fù)雜的有機(jī)含碳的化合物，都可以作為微生物的碳源來源。米根霉是異養(yǎng)型微生物，它們能利用多種有機(jī)化合物為碳源。研究人員使用單因子變量的方法測(cè)葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，可溶性淀粉等8種碳源對(duì)米根霉產(chǎn)富馬酸含量的影響，最后得出結(jié)論：以可溶性淀粉作為碳源時(shí),富馬酸產(chǎn)量最高。氮源：氮源作為微生物合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞質(zhì)的主要營(yíng)養(yǎng)成分，是微生物生命活動(dòng)中不可缺少的部分?？梢允褂迷谂囵B(yǎng)基中的氮源一般分為有機(jī)氮源（酵母膏、蛋白胨等）和無機(jī)氮源（尿素、硫酸銨）等，研究人員研究發(fā)現(xiàn)酵母粉，蛋白胨

15、，牛肉膏，檸檬酸銨等氮源及氮源濃度對(duì)米根霉生長(zhǎng)環(huán)境產(chǎn)富馬酸的影響。氮源為蛋白胨時(shí)，富馬酸產(chǎn)量最高10?？偨Y(jié)得出，當(dāng)以可溶性淀粉為碳源時(shí)，氮源為蛋白胨時(shí)，此時(shí)米根霉為最優(yōu)產(chǎn)富馬酸條件，富馬酸產(chǎn)量45 g/L。2.4.3.3溫度溫度作為影響微生物酶活性的重要因素，能夠影響米根霉的代謝產(chǎn)物積累，經(jīng)考察不同溫度對(duì)米根霉產(chǎn)富馬酸的影響，得出28 為最適發(fā)酵溫度，在這個(gè)溫度下，富馬酸產(chǎn)量最高，能達(dá)到42 g/L。2.4.3.4 pHpH是影響微生物生命活動(dòng)和正常生長(zhǎng)的重要條件，它還能影響酸性發(fā)酵產(chǎn)物的積累。Taos等人研究了不同pH值對(duì)米根霉的影響及產(chǎn)富馬酸量的影響。得出米根霉的發(fā)酵最適pH為6.5左右，

16、此時(shí)富馬酸產(chǎn)量最高，為43 g/L。2.4.3.5 誘導(dǎo)劑實(shí)驗(yàn)中，我們還可以通過添加誘導(dǎo)劑的方式提高米根霉產(chǎn)富馬酸的含量。我們可以添加不同體積分?jǐn)?shù)的蘋果浸出液，在米根霉培養(yǎng)基中加入2 %的蘋果浸出液時(shí)富馬酸產(chǎn)量提高4 g/L，提高了10 %，還可以添加不同濃度的L-蘋果酸，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1.5 g/L的L-蘋果酸，富馬酸產(chǎn)量提高5 g/L，提高了13 %，由此可見，添加誘導(dǎo)劑對(duì)米根霉產(chǎn)富馬酸有顯著提升作用。2.4.3.6 中和劑在發(fā)酵過程中，隨著反應(yīng)進(jìn)行，酸不斷積累，培養(yǎng)基中pH值不斷降低，大約24小時(shí)后可以降低到3以下，而米根霉不能忍受高濃度的酸,這嚴(yán)重影響了米根霉的菌絲體生長(zhǎng)和酶活性，

17、但是我們可以通過加入中和劑的方法，中和溶液的pH值，解決這一問題，Taos等人研究了碳酸鈣、碳酸氫鈉、氫氧化鈣等用作中和劑對(duì)米根霉產(chǎn)富馬酸的影響，得出發(fā)酵液中加入過量碳酸鈣時(shí),富馬酸產(chǎn)量最高,達(dá)到37 g/L，效果明顯。2.4.4影響富馬酸產(chǎn)量的因素2.4.4.1種子液pH研究種子液pH對(duì)米根霉菌體形態(tài)、生物量發(fā)酵產(chǎn)富馬酸量的影響。種子液的pH能影響米根霉的菌體形態(tài),卻對(duì)生物量影響作用小。種子液pH為2.1時(shí)，孢子不能萌發(fā)，pH 2.3 2.7時(shí)，可形成直徑大約500 600 m的分散菌球,能在培養(yǎng)基中保持球形，pH 2.9時(shí)，形成一種菌球和絮狀菌絲的混合物，在培養(yǎng)基中呈相互纏繞的絮狀，pH

18、3.1 3.3時(shí)形成絮狀種子，在發(fā)酵過程中呈團(tuán)狀;培養(yǎng)基pH高于3.3時(shí)，形成緊密纏繞的菌絲體團(tuán)塊狀，在培養(yǎng)基中保持團(tuán)塊狀。將不同菌體形態(tài)的種子在其他條件相同的情況下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定富馬酸產(chǎn)量，結(jié)果顯示，球狀形態(tài)下，富馬酸量最高，平均質(zhì)量濃度可達(dá)55.2 g/L，比絮狀和團(tuán)狀形分別高60 %和112 %，因此,種子培養(yǎng)基中pH控在2.3 2.7內(nèi)，有利于富馬酸產(chǎn)生11。2.4.4.2 孢子密度孢子密度影響著米根霉菌球的大小，而菌球的大小又對(duì)富馬酸的生成影響巨大。向pH 2.5的培養(yǎng)基中接種孢子，增大其密度，在發(fā)酵條件相同的情況下，研究其對(duì)菌體形態(tài)和富馬酸產(chǎn)量的影響，在研究濃度范圍內(nèi)菌體形態(tài)

19、均呈球狀，但菌球直徑、數(shù)目和富馬酸產(chǎn)量隨著密度的變化而存在明顯差異。培養(yǎng)基中生物量呈增漲趨勢(shì)，菌球的直徑減小，數(shù)目增加,富馬酸產(chǎn)量提高。研究得出，接種米根霉的孢子密度應(yīng)控制在1.5× 108 3.0× 108 個(gè)/L最適12。2.4.4.3 鈣離子濃度鈣離子是影響菌絲頂端生長(zhǎng)的重要因素,而且鈣離子表面所帶的正電荷能抑制細(xì)胞間的排斥作用，增進(jìn)細(xì)胞間交聯(lián)。我們?cè)谂囵B(yǎng)基中加入少量CaCl2，觀察它對(duì)菌球直徑、生物量以及米根霉相應(yīng)富馬酸產(chǎn)量的影響,結(jié)果是，添加0.5 g/L CaCl2在培養(yǎng)基中，菌體生物量明顯有所增加，平均菌球直徑由0.53 mm增加到0.62 mm，富馬酸產(chǎn)量增

20、至58.9 g/L，與之前相比提高了5.9 %。隨著CaCl2添加量不斷加大，富馬酸生成量幾乎不變化了?？梢缘贸鼋Y(jié)論,培養(yǎng)基中加入鈣離子有助于富馬酸的生成13。3 總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)的目的是以米根霉為出發(fā)菌株，研究米根霉利用葡萄糖生產(chǎn)富馬酸的過程，發(fā)酵條件的變化對(duì)產(chǎn)富馬酸的影響機(jī)制，研究米根霉生長(zhǎng)環(huán)境的變化對(duì)產(chǎn)富馬酸的影響。從目前的發(fā)展趨勢(shì)來看，隨著我們?nèi)找鎸?duì)石油資源的開采以及環(huán)境的破壞，我們所生活的環(huán)境已經(jīng)不堪重負(fù)，尋找并合理運(yùn)用安全環(huán)保的方法制備富馬酸成了我們丞待解決的重要問題。利用生物法生產(chǎn)富馬酸工藝簡(jiǎn)單，天然無毒，安全有保障，市場(chǎng)前景無比廣闊，我們應(yīng)該加大生物法制備富馬酸的研究，選育優(yōu)良菌株

21、，改進(jìn)生產(chǎn)工藝流程，提高富馬酸得率和效率，降低成本，推動(dòng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)環(huán)境的同步發(fā)展。同時(shí)，通過科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新來尋求新型的處理技術(shù)，完善和開發(fā)更加高效、無污染且成本低的處理技術(shù)，將是今后生產(chǎn)富馬酸的發(fā)展趨勢(shì)。4 參考文獻(xiàn)1 Pietrzak, W., Kawa-Rygielska, J.,. Simultaneous saccharication and ethanol fermentation of waste wheatrye bread at very high solids loading: Effect of enzymatic liquefaction conditions. Fuel,2

22、015, 147, 236-242. 2田毅紅,雷照方,劉海軍.富馬酸的發(fā)酵工藝研究J.三峽大學(xué)報(bào).2007, 29(04):0371-0373. 3 Lei Huang,Peilian Wei,Ru Zang,etc. High-throughput screening of high-yield colonies of Rhizopus oryzae for enhanced production of fumaric acidJ. Ann Microbiol, 2010, 60(10):0287-0292. 4 Y. Zhou,J. Du,G. Tsao. Comparison of fumaric acid production by Rhizopus oryzae using different neutralizing agentsJ , Ann Microbiol ,2002,35(10):0225-0230. 5 Ying Zhou,Jianxin Du,George T. Tsao. Mycelial pellet formation by Rhizopus oryzae ATCC 20344J, Ann Micr