1、 原核生物的原核生物的 表表 達(dá)達(dá)l原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌大腸桿菌大腸桿菌、枯草桿菌、枯草桿菌、沙門氏菌沙門氏菌假單孢菌、假單孢菌、鏈球菌、鏈球菌、放線菌等。放線菌等。 原核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：原核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：。如。如E.coli DNA分子量為分子量為2.4 X109，相當(dāng)于，相當(dāng)于4.2 X106bp，含有，含有 30004000個(gè)基因。個(gè)基因。最小的病毒如雙鏈最小的病毒如雙鏈DNA病病毒毒SV40，其基因組相對(duì)分子質(zhì)量只有，其基因組相對(duì)分子質(zhì)量只有3106，含含5個(gè)基因，而單鏈個(gè)基因，而單鏈RNA病毒病毒Q，只含有，只含有4個(gè)基個(gè)基因。此外，細(xì)菌的質(zhì)粒、真核

2、生物的線粒體、高因。此外，細(xì)菌的質(zhì)粒、真核生物的線粒體、高等植物的葉綠體等也含有等植物的葉綠體等也含有DNA和功能基因，這些和功能基因，這些DNA被稱為被稱為染色體外遺傳因子染色體外遺傳因子。在功能上密切相關(guān)的基因高在功能上密切相關(guān)的基因高度集中，往往集中在一個(gè)或幾個(gè)特定部位，度集中，往往集中在一個(gè)或幾個(gè)特定部位，形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。它們可以轉(zhuǎn)形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。它們可以轉(zhuǎn)錄形成含有多個(gè)蛋白質(zhì)分子的一個(gè)錄形成含有多個(gè)蛋白質(zhì)分子的一個(gè)mRNA單單元，即元，即多順反子多順反子mRNA。n大腸桿菌為宿主的體系是表達(dá)外源蛋白的大腸桿菌為宿主的體系是表達(dá)外源蛋白的首選體系首選體系,其其遺

3、傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、易于操作遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、易于操作n編號(hào)：編號(hào)：U00096n名稱：名稱：Escherichia colin菌株：菌株： K-12 MG1655n基因數(shù)：基因數(shù)：4293個(gè)個(gè)n堿基數(shù)：堿基數(shù)：4639221 bp大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性l已經(jīng)掌握了大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分已經(jīng)掌握了大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)方面的背景知識(shí)子生物學(xué)方面的背景知識(shí),特別是對(duì)基因表達(dá)調(diào)控特別是對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理亦有了深刻的了解；的分子機(jī)理亦有了深刻的了解；l大腸桿菌已成為一種安全的基因工程試驗(yàn)體系，大腸桿菌

4、已成為一種安全的基因工程試驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列；擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列；l已證明已證明,許多真核基因許多真核基因,例如抑生長素基因和胰島例如抑生長素基因和胰島素基因等素基因等,都可以在大腸桿菌細(xì)胞中有效的都可以在大腸桿菌細(xì)胞中有效的,高水高水平的表達(dá)；平的表達(dá)；l大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易于大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。編碼序列編碼序列TTtetrOri起始密碼子起始密碼子(Start) codon AUG(91%) GUG(8%)UUG(1%)終止密碼子終止密碼子(Stop c

5、odon) UAAUUGAUAG mRNA 5 UAAGGAGG(N)816S rRNA 3 HOAUUCCUCC 原核表達(dá)系統(tǒng)模型原核表達(dá)系統(tǒng)模型-35-10PSDRTTGACA.TATAAT-35-10RBS基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方：n1轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（transcriptional regulation）；）；n2轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptional regulation），包括：），包括：q mRNA加工成熟水平上的調(diào)控加工成熟水平上的調(diào)控q 翻譯水平上的調(diào)控翻譯水平上的調(diào)控n原核生物中

6、，原核生物中，營養(yǎng)狀況營養(yǎng)狀況和和環(huán)境因素對(duì)環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)起著基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，中，激素水平和發(fā)育階段激素水平和發(fā)育階段是基因表達(dá)調(diào)控的最主要是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段。手段。 n原核生物的基因調(diào)控主要發(fā)生在原核生物的基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平上，根據(jù)調(diào)上，根據(jù)調(diào)控 機(jī) 制 的 不 同 可 分 為控 機(jī) 制 的 不 同 可 分 為 ; 負(fù) 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 控 （負(fù) 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 控 （ n e g a t i v e transcription regulation）和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控（）和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控（pos

7、itive transcription regulation）。）。n在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控決定于在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控決定于DNA的結(jié)構(gòu)、的結(jié)構(gòu)、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用作用。是是原核基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄單位原核基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄單位, 是是原核基因表達(dá)調(diào)控的一種重要的組織形式，原核基因表達(dá)調(diào)控的一種重要的組織形式，大腸桿菌的基因多數(shù)以操縱子的形式組成基大腸桿菌的基因多數(shù)以操縱子的形式組成基因表達(dá)調(diào)控的單元。操縱子應(yīng)該包括結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控的單元。操縱子應(yīng)該包括結(jié)構(gòu)基因、操縱基因和啟動(dòng)基因。因、操縱基因和啟動(dòng)基因。1961

8、年年,法國巴斯法國巴斯德研究所的和提出德研究所的和提出了乳糖操縱子概念了乳糖操縱子概念,后來人們在大腸桿菌中又后來人們在大腸桿菌中又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了色氨酸操縱子、組氨酸操縱子、陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了色氨酸操縱子、組氨酸操縱子、半乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子等多種操縱半乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子等多種操縱子子, ipozya阻遏物阻遏物 半乳糖苷酶半乳糖苷酶透性酶透性酶乙?；敢阴；竎IIItLNcIcrocII正調(diào)節(jié)蛋白正調(diào)節(jié)蛋白抗終止子抗終止子阻遏蛋白阻遏蛋白抗阻遏蛋白阻遏蛋白正調(diào)節(jié)正調(diào)節(jié)蛋白nutLPL/OLPRMPR/ORnutRtR1PRE(a)(c)(b)P OtrpLatrpEtrpDtrpBtrp

9、CtrpAtt鄰氨基苯甲酸鄰氨基苯甲酸合成酶合成酶吲哚甘油磷吲哚甘油磷酸合成酶酸合成酶色氨酸合色氨酸合成酶成酶 (a)大腸桿菌大腸桿菌乳糖操縱子乳糖操縱子控制區(qū)的結(jié)構(gòu)控制區(qū)的結(jié)構(gòu) (b)大腸桿菌大腸桿菌色氨酸操縱子色氨酸操縱子的基因順序組織的基因順序組織 (c) 噬菌體噬菌體 DNA的操縱子的操縱子組成組成三種大腸桿菌啟動(dòng)子所在操縱子的示意圖三種大腸桿菌啟動(dòng)子所在操縱子的示意圖n一、乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制n（一）乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)（一）乳糖操縱子的結(jié)構(gòu) 誘導(dǎo)型操縱子誘導(dǎo)型操縱子nP RNA聚合酶結(jié)合的聚合酶結(jié)合的DNA序列序列 -10區(qū)區(qū)TATAAT和和-35區(qū)區(qū)TTGACA, 強(qiáng)

10、啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子nO- 結(jié)合阻遏物結(jié)合阻遏物,是是RNA酶能否通過的開關(guān)酶能否通過的開關(guān)POZYA結(jié)構(gòu)基因阻遏物基因啟動(dòng)子操縱基因產(chǎn)生阻遏蛋白R(shí)NA酶結(jié)合結(jié)合阻遏物In乳糖操縱子的調(diào)控方式乳糖操縱子的調(diào)控方式i基因POLac ZLac Ylac A無誘導(dǎo)物時(shí)阻遏物蛋白亞基 阻遏蛋白R(shí)NA聚合酶i基因POLac ZLac Ylac A有誘導(dǎo)物時(shí)阻遏物蛋白亞基阻遏蛋白誘導(dǎo)物無活性的阻遏蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯-半乳糖苷酶-半乳糖苷通透酶-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶mRNACAP cAMPCAP-cAMPn轉(zhuǎn)錄衰減ntrp色氨酸操縱子色氨酸操縱子阻遏型操縱子n有trp時(shí)trp結(jié)合輔阻遏蛋白時(shí)阻斷轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶輔阻遏蛋

11、白OPR基因EDCBA+色氨酸原核生物載體中的高效表達(dá)條件原核生物載體中的高效表達(dá)條件 n1,強(qiáng)的可調(diào)控的原核啟動(dòng)子強(qiáng)的可調(diào)控的原核啟動(dòng)子.(提高表達(dá)量提高表達(dá)量)n2,強(qiáng)的強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(依賴依賴Rho蛋白和不依賴蛋白和不依賴Rho蛋白蛋白),不依賴不依賴Rho蛋白終止信號(hào)序列含發(fā)蛋白終止信號(hào)序列含發(fā)夾結(jié)構(gòu)夾結(jié)構(gòu),一連串一連串T及及YRTCTG.(穩(wěn)定穩(wěn)定)n3,最佳最佳SD序列序列 (Shine-Dalgarno) ：與起始信：與起始信號(hào)號(hào)ATG之間距離合適之間距離合適.(9bp,最好是最好是A或或U,-3位最位最好是好是A,AUG,或或AAAA.n4,多克隆位點(diǎn)多多克隆位點(diǎn)

12、多,方便方便.DNA水平水平: 松弛型復(fù)制的載體在宿主細(xì)胞中是多拷貝的松弛型復(fù)制的載體在宿主細(xì)胞中是多拷貝的,因此將外源基因插入松弛型載體中是是優(yōu)化高效表達(dá)條件因此將外源基因插入松弛型載體中是是優(yōu)化高效表達(dá)條件的一種選擇。的一種選擇。轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平:啟動(dòng)子啟動(dòng)子:啟動(dòng)子是影響外源基因表達(dá)效率的關(guān)鍵因啟動(dòng)子是影響外源基因表達(dá)效率的關(guān)鍵因素之一素之一,應(yīng)選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。如入應(yīng)選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。如入P1,入入PR、tac、trP、Lac、T7等等原核增強(qiáng)子樣序列原核增強(qiáng)子樣序列:例似于真核增強(qiáng)子的一段短例似于真核增強(qiáng)子的一段短DNA序列序列,可增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率可增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率,置于啟子上游或下

13、游置于啟子上游或下游均可。均可。轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子:利用強(qiáng)啟動(dòng)子時(shí)利用強(qiáng)啟動(dòng)子時(shí),必須在外源基因下必須在外源基因下游加入不依賴于游加入不依賴于P因子的轉(zhuǎn)錄終止子。因子的轉(zhuǎn)錄終止子。翻譯水平翻譯水平: 影響外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)因素影響外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)因素:誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)類型類型n根據(jù)啟動(dòng)子類型根據(jù)啟動(dòng)子類型,n大腸桿菌載體表達(dá)分為大腸桿菌載體表達(dá)分為;n1,化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá),(如異丙基硫代如異丙基硫代-D-半乳糖半乳糖苷苷IPT誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物);啟動(dòng)子類型為啟動(dòng)子類型為Plac, Ptrp, PT7.n2,溫敏誘導(dǎo)表達(dá)溫敏誘導(dǎo)表達(dá)。(37C42C)n啟動(dòng)子類型為啟動(dòng)

14、子類型為PL.原核表達(dá)基本的組成元件原核表達(dá)基本的組成元件n啟動(dòng)子啟動(dòng)子 增強(qiáng)子增強(qiáng)子n調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白(激活蛋白激活蛋白,阻遏蛋白阻遏蛋白) 衰減子衰減子n序列序列(TMV omega element) SD序列序列n核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS) 信號(hào)肽信號(hào)肽n轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 復(fù)制子復(fù)制子n多順反子多順反子(結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因,) 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)MCSn轉(zhuǎn)錄終止序列轉(zhuǎn)錄終止序列; 表型選擇標(biāo)記表型選擇標(biāo)記nTag (1) 啟動(dòng)子啟動(dòng)子：是一段供：是一段供RNA聚合酶定位用的聚合酶定位用的DNA序列，通序列，通常位于基因的上游，長度一般不超過常位于基因的上游，長度一般不

15、超過200bp，一系列的轉(zhuǎn)，一系列的轉(zhuǎn)錄作用就發(fā)生在這個(gè)區(qū)段內(nèi)。錄作用就發(fā)生在這個(gè)區(qū)段內(nèi)。(2)Pribnow盒盒: 與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的距離為與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的距離為510個(gè)堿基，所個(gè)堿基，所以又稱為以又稱為“-10元件元件”?；径际怯??；径际怯蒚ATAAT堿基序列組成。堿基序列組成。其中第其中第6個(gè)堿基個(gè)堿基(帶下劃線的帶下劃線的T)所有的啟動(dòng)子都有，故稱為所有的啟動(dòng)子都有，故稱為保守的保守的T堿基堿基(conserved T)。 Pribnow盒子是給盒子是給RNA聚合酶聚合酶定向的序列定向的序列，使，使RNA分子的合成按分子的合成按5到到3進(jìn)行。進(jìn)行。(3)-35序列序列(TTGAC

16、A)：是結(jié)合是結(jié)合RNA聚合酶的起始位點(diǎn)，聚合酶的起始位點(diǎn)，因此也稱之為因此也稱之為識(shí)別序列識(shí)別序列(recognition sequence)。(4) Pribnow盒盒 與與-35序列序列最佳間距為最佳間距為17bp.u啟動(dòng)子啟動(dòng)子(promoter, P)理想的啟動(dòng)子具有以下特性理想的啟動(dòng)子具有以下特性：強(qiáng)強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)子;可嚴(yán)格調(diào)控可嚴(yán)格調(diào)控; 易轉(zhuǎn)導(dǎo)入易轉(zhuǎn)導(dǎo)入E.coli,便于篩選便于篩選, 可大量生產(chǎn)可大量生產(chǎn),對(duì)其誘導(dǎo)簡便和價(jià)廉。對(duì)其誘導(dǎo)簡便和價(jià)廉。RBS在啟動(dòng)子下游在啟動(dòng)子下游,其跨度約其跨度約54bp,兩端限定在兩端限定在 -35(2)和和mRNA編碼序列的編碼序列的+19到到

17、+22之間。之間。Shine-Dalgarno(SD)位點(diǎn)在翻譯起始階段與位點(diǎn)在翻譯起始階段與16S rRNA的的3端相互作用端相互作用.SD與起始密碼子間的距離約為與起始密碼子間的距離約為5-13bp, 此區(qū)的序列在此區(qū)的序列在mRNA轉(zhuǎn)錄物中應(yīng)避免出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄物中應(yīng)避免出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),否則否則將會(huì)降低翻譯起始的效率。將會(huì)降低翻譯起始的效率。在在RBS的的5和和3端均為端均為A豐富區(qū)。豐富區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止子位于編碼序列的下游轉(zhuǎn)錄終止子位于編碼序列的下游,作為轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)和作為轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)和組成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的保護(hù)性元件組成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的保護(hù)性元件,阻止核酸外切酶對(duì)阻止核酸外切酶對(duì)mRNA的的降解，從

18、而延長降解，從而延長mRNA的半衰期。的半衰期。n原核原核基因基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)通常是嘌呤通常是嘌呤,其序列為其序列為CAT(A為為起始位點(diǎn)起始位點(diǎn).) n-10區(qū)區(qū)是一個(gè)是一個(gè)6核苷酸保守序列核苷酸保守序列(多以多以-10為中心為中心) T80A95t45A60A50T96,有助于有助于DNA解鏈解鏈.聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)聚合酶的結(jié)合位點(diǎn).這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度. n-35區(qū)區(qū)(框框) ,是另一個(gè)是另一個(gè)6核苷酸核苷酸保守序列保守序列(多以多以-35為中心為中心T82T84G78A65C54a45 .是是聚合

19、酶的聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn) .n-10區(qū)與區(qū)與-35區(qū)中心位置區(qū)中心位置16-18bp的的間隔間隔時(shí)為好時(shí)為好.堿基序列并不特別重要堿基序列并不特別重要,但這兩個(gè)序列之間的但這兩個(gè)序列之間的距離十分重要。距離十分重要。 -35區(qū)區(qū)-10區(qū)區(qū)間隔區(qū)間隔區(qū)間隔區(qū)間隔區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)TTGACATATAATN17N5-9A/G5NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN33AACTGTNNNNNNNNNNNNNNNNNATATTANNNNNNN(T/C)NNNNN55(A/G)NNNN(a)(b)(c)(d) (a)具有具有-10和和-35元件的啟動(dòng)子的典型結(jié)構(gòu)；元件的啟動(dòng)子的典型結(jié)

20、構(gòu)；(b)啟動(dòng)子的保守序列；啟動(dòng)子的保守序列；(c)雙鏈雙鏈DNA上的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其相關(guān)元件的序列；上的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其相關(guān)元件的序列；(d)RNA合成的典型起合成的典型起點(diǎn)是點(diǎn)是A或或G，且不需要引物。，且不需要引物。N=任何一個(gè)核苷酸任何一個(gè)核苷酸大腸桿菌啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)大腸桿菌啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)常用大腸桿菌啟動(dòng)子的類型常用大腸桿菌啟動(dòng)子的類型(1)Plac：來自：來自乳糖操縱子乳糖操縱子?？刂茀^(qū)主要由阻遏基因控制區(qū)主要由阻遏基因(lacI)、操、操縱元縱元(lacO)和啟動(dòng)子和啟動(dòng)子(lacP)組成。組成。 (2)Ptrp：來自：來自色氨酸操縱子。色氨酸操縱子。有一個(gè)轉(zhuǎn)錄控制區(qū)和有一個(gè)轉(zhuǎn)錄控制區(qū)和5

21、個(gè)分別編個(gè)分別編碼碼5種色氨酸合成酶的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)。種色氨酸合成酶的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)。(3) Pl：來自：來自噬菌體噬菌體 (4)PT7：PET系列系列載體，既可在原核系統(tǒng)中表達(dá)，也可在真載體，既可在原核系統(tǒng)中表達(dá)，也可在真核系統(tǒng)中表達(dá)。核系統(tǒng)中表達(dá)。(5)雜和雜和tac啟動(dòng)子啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)譯起始序列轉(zhuǎn)譯起始序列n 外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)在很大程度上還與外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)在很大程度上還與mRNA的翻譯起的翻譯起始效率密切相關(guān)。而始效率密切相關(guān)。而mRNA的翻譯起始效率主要由其的翻譯起始效率主要由其5端的結(jié)構(gòu)序列所端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(R

22、BS)。主要包括。主要包括四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：n（1）SD (Shine-Dalgarno)序列序列：位于翻譯起始密碼子上游的：位于翻譯起始密碼子上游的6至至8個(gè)個(gè)氨基酸序列氨基酸序列5UAAGGAGG3，它通過識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的，它通過識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區(qū)域端區(qū)域3AUUCCUCC5并與之專一性結(jié)合，將并與之專一性結(jié)合，將RNA定位定位于核糖體上，從而啟動(dòng)子翻譯。于核糖體上，從而啟動(dòng)子翻譯。n（2）翻譯起始密碼子翻譯起始密碼子：大腸桿菌絕大部分基因以：大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用起始

23、位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或或UUG作為起始密碼子。作為起始密碼子。n（3）SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成。n（4）基因編碼區(qū)基因編碼區(qū)5端若干密碼子的堿基序列端若干密碼子的堿基序列。n1.翻譯起始區(qū)翻譯起始區(qū)(TDR): 是指是指SD序列與起始密碼子序列與起始密碼子AUG之間之間及其上下游的一部分序列及其上下游的一部分序列,可使表達(dá)水平相差幾千倍?？墒贡磉_(dá)水平相差幾千倍。nSD序列序列:是與細(xì)菌中是與細(xì)菌中16SrRNA3端互補(bǔ)的序列端互補(bǔ)的序列,不同的不同的SD序序列對(duì)基因表達(dá)的影響不同。列對(duì)基因表達(dá)的影響不同。nSD序列與序列與AU

24、G之間的距離及組成之間的距離及組成: SD序列與序列與AUG之間的距之間的距離以離以5至至10個(gè)核苷酸為佳個(gè)核苷酸為佳,其組成應(yīng)富含其組成應(yīng)富含A、U。nSD序列上游與序列上游與AUG序列下游的序列序列下游的序列:一般應(yīng)富含一般應(yīng)富含A、U。nTIR的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu):mRNA的的TIR若存在阻止核糖體結(jié)合的二級(jí)若存在阻止核糖體結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu))有效起始翻譯的效率將大大降低有效起始翻譯的效率將大大降低n2.密碼子密碼子:n3.mRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性:若能增加若能增加mRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性,有可能捏高表有可能捏高表達(dá)效率。達(dá)效率。翻譯起始的調(diào)控翻譯起始的調(diào)控n蛋白質(zhì)翻譯

25、起始于蛋白質(zhì)翻譯起始于mRNA上的上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）。）。所謂所謂RBS，是指起始密子，是指起始密子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。在上游的一段非翻譯區(qū)。在RBS中有中有SD序列，長度一般為序列，長度一般為5個(gè)核苷酸，富含個(gè)核苷酸，富含G、A，該序列與核糖體該序列與核糖體16S rRNA的的3 端互補(bǔ)配對(duì)，促使核糖體端互補(bǔ)配對(duì)，促使核糖體結(jié)合到結(jié)合到mRNA上，有利于翻譯的起始。上，有利于翻譯的起始。RBS的結(jié)合強(qiáng)度的結(jié)合強(qiáng)度取決于取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及其與起始密碼序列的結(jié)構(gòu)及其與起始密碼AUG之間的距離。之間的距離。SD與與AUG之間相距一般以之間相距一般以410核苷酸為

26、佳，核苷酸為佳，9核苷酸最核苷酸最佳。佳。n此外，此外，mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)也是翻譯起始調(diào)控的重要因素。的二級(jí)結(jié)構(gòu)也是翻譯起始調(diào)控的重要因素。mRNA5 端必須有一定的空間結(jié)構(gòu)，才能與核糖體的端必須有一定的空間結(jié)構(gòu)，才能與核糖體的30S亞基結(jié)合。亞基結(jié)合。SD序列的微小變化，往往會(huì)導(dǎo)致表達(dá)效率上序列的微小變化，往往會(huì)導(dǎo)致表達(dá)效率上百倍甚至上千倍的差異，這是由于核苷酸的變化改變了形百倍甚至上千倍的差異，這是由于核苷酸的變化改變了形成成mRNA5 端二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能，影響了核糖體端二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能，影響了核糖體30S亞基亞基與與mRNA的結(jié)合，從而造成了蛋白質(zhì)合成效率上的差異。的結(jié)合，從而造成了蛋白

27、質(zhì)合成效率上的差異。核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)n核糖體結(jié)合位點(diǎn)緊靠啟動(dòng)子下游,從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始延伸幾拾個(gè)堿基長度的一段序列.翻譯起始密碼子ATG位于它的中心位置.核糖體結(jié)合位點(diǎn)中與rRNA16S亞基3端互補(bǔ)的核心部分稱;SD序列(Shine-Dalgarno序列).一個(gè)富嘌呤區(qū)AAGGA和.UAAGGAGG是最常見的典型序列.位于翻譯起始密碼子上游,距離一般為5-13bp.nSD序列對(duì)于形成起始復(fù)合物,有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯是必需的.序列TMV omega element 序列是煙草花葉病毒TMV的5端非翻譯區(qū)的一段68bp序列.能提高翻譯效率.n序列都位于Promoter的下游.其對(duì)翻譯的增強(qiáng)機(jī)

28、制可能是阻止mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成,或者是成為一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn).n序列位于Promoter的上游.可能性1,增強(qiáng)子為轉(zhuǎn)錄因子提供進(jìn)入Promoter區(qū)的位點(diǎn).2,增強(qiáng)子能改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象,染色質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)的變化決定DNA對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的接受效率.轉(zhuǎn)譯起始序列轉(zhuǎn)譯起始序列已知序列的絕大部分（已知序列的絕大部分（91%）E.coli基因的翻譯基因的翻譯起始區(qū)均含有起始密碼子起始區(qū)均含有起始密碼子AUG，GUG的利用率為的利用率為8%，而，而UUG的利用率則為的利用率則為1%。 n另外,單鏈具有1個(gè)堿基對(duì)間隙的各種長度間隔序列下轉(zhuǎn)錄活性的研究也支持“間隔序列的結(jié)構(gòu)而非精確順序是影響功能的重要因素”的假

29、設(shè) ,間隔序列只是用來調(diào)節(jié)-35和-10區(qū)的相對(duì)方物理位,而間隔序列的扭角可能是該方位調(diào)節(jié)的敏感元素.ncAMP對(duì)轉(zhuǎn)錄有雙重作用,這種作用可能與啟動(dòng)子區(qū)的構(gòu)象特點(diǎn)及RNA聚合酶與啟動(dòng)子的特異結(jié)合有關(guān)。 多順反子栽體構(gòu)建策略n多啟動(dòng)子;n存在啟動(dòng)子間的干擾現(xiàn)象.位于3端啟動(dòng)子下游基因較位于5端啟動(dòng)子基因更容易受影響.這類抑制不是決對(duì)的,.n在有三個(gè)啟動(dòng)子的多基因質(zhì)粒表達(dá)栽體中也存在這種現(xiàn)象,但二個(gè)啟動(dòng)子頭-尾相接則可避免這種現(xiàn)象,說明這是一種順式作用.表型選擇標(biāo)記n質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后,利用表型選擇標(biāo)記將轉(zhuǎn)化體篩選出來.n微生物表型選擇標(biāo)記;(二種)n1,顯性標(biāo)記;Apr,Tetr, 等等抗性基

30、因.n2,營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記.n信號(hào)肽n信號(hào)肽是能啟動(dòng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的任何一斷多肽.n信號(hào)肽(15-30bp)(N-末端)有利于蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外.在原核生物中，轉(zhuǎn)錄終止有兩種不同的機(jī)制。一種是依賴六聚體蛋白rho的rho依賴性轉(zhuǎn)錄終止，rho蛋白能使新生RNA轉(zhuǎn)錄本從模板解離。另一種是rho非依賴性轉(zhuǎn)錄終止，它特異性依賴于模板上編碼的信號(hào)，即在新生RNA中形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的一回文序列區(qū)，和位于該回文序列下游4-9bp處的dA、dT富含區(qū)。有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達(dá)。有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達(dá)載體必不可少的元件。貫穿啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動(dòng)子載體必不可少的元件。貫穿啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動(dòng)子的功能，造成所謂的啟動(dòng)子封

31、堵的功能，造成所謂的啟動(dòng)子封堵。在啟動(dòng)目的基因的啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因的啟動(dòng)子上游放置一轉(zhuǎn)錄終止子，上游放置一轉(zhuǎn)錄終止子，將最大限度地減小背景轉(zhuǎn)錄將最大限度地減小背景轉(zhuǎn)錄。強(qiáng)啟強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄會(huì)使轉(zhuǎn)錄通讀到復(fù)制區(qū)，造成控制質(zhì)粒動(dòng)子啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄會(huì)使轉(zhuǎn)錄通讀到復(fù)制區(qū)，造成控制質(zhì)?？截悢?shù)的拷貝數(shù)的ROP蛋白的過量表達(dá)，從而導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定。蛋白的過量表達(dá)，從而導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定。 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子n共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn);n有一個(gè)富含有一個(gè)富含G/C區(qū)區(qū),一個(gè)富含一個(gè)富含A/T區(qū)區(qū), G/C區(qū)又具有區(qū)又具有回文結(jié)構(gòu)這段回文結(jié)構(gòu)這段終止子終止子轉(zhuǎn)錄后形成的轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)具有莖環(huán)

32、結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 轉(zhuǎn)錄終止增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，從而的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。如果來源于提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。如果來源于E.coli rrB rRNA操縱子的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄操縱子的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子終止子T1和和T2串聯(lián)則效果更好。但串聯(lián)則效果更好。但其他的許多轉(zhuǎn)錄終止子通常情況下都其他的許多轉(zhuǎn)錄終止子通常情況下都是十分有效的。是十分有效的。轉(zhuǎn)譯終止子轉(zhuǎn)譯終止子 對(duì)對(duì)mRNA轉(zhuǎn)譯終止而言，一個(gè)必不可少的條件是必轉(zhuǎn)譯終止而言，一個(gè)必不可少的條件是必須存在著一個(gè)終止密碼子。因此在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)須存在著一個(gè)終止密碼子。因此在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，通常是給安置上全部的三個(gè)終止密碼子載體時(shí)，

33、通常是給安置上全部的三個(gè)終止密碼子(UAA, UAG, UGA )以阻止發(fā)生核糖體的以阻止發(fā)生核糖體的“跳躍跳躍”(skipping)現(xiàn)象。大腸桿菌偏愛使用終止密碼子現(xiàn)象。大腸桿菌偏愛使用終止密碼子UAA(UAAU的轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)譯終止效率更好譯終止效率更好)。 轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子 大腸桿菌和噬菌體基因中存在著一些特殊的序大腸桿菌和噬菌體基因中存在著一些特殊的序列元件，能夠顯著的增強(qiáng)異源基因在大腸桿菌列元件，能夠顯著的增強(qiáng)異源基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率。這類序列元件特稱為中的表達(dá)效率。這類序列元件特稱為轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子子(translational enhancer)。但機(jī)理目前尚但機(jī)理目前尚不清

34、楚。不清楚。衰減子及其作用衰減子及其作用n實(shí)驗(yàn)觀察表明：當(dāng)色氨酸達(dá)到一定濃度、但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時(shí)，產(chǎn)生色氨酸合成酶類的量已經(jīng)明顯降低，而且產(chǎn)生的酶量與色氨酸濃度呈負(fù)相關(guān)。仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)這種調(diào)控現(xiàn)象與色氨酸操縱子特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)。 結(jié)構(gòu)基因群結(jié)構(gòu)基因群 操縱元中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因可稱為結(jié)構(gòu)基因操縱元中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因可稱為結(jié)構(gòu)基因(structural gene, SG)。一個(gè)操縱元中含有。一個(gè)操縱元中含有2個(gè)以上的結(jié)構(gòu)個(gè)以上的結(jié)構(gòu)基因，多的可達(dá)十幾個(gè)。每個(gè)結(jié)構(gòu)基因是一個(gè)連續(xù)的開放讀框基因，多的可達(dá)十幾個(gè)。每個(gè)結(jié)構(gòu)基因是一個(gè)連續(xù)的開放讀框(open readi

35、ng frame), 5端有翻譯起始碼端有翻譯起始碼AUG，3端有翻端有翻譯終止碼譯終止碼UAA、UGA或或UAG。各結(jié)構(gòu)基因頭尾銜接、串連排。各結(jié)構(gòu)基因頭尾銜接、串連排列，組成結(jié)構(gòu)基因群。至少在第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因列，組成結(jié)構(gòu)基因群。至少在第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因5側(cè)具有核糖體側(cè)具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site, RBS)。核糖體沿。核糖體沿mRNA移動(dòng)，在合成完第一個(gè)編碼的多肽后，核糖體可以不脫離移動(dòng)，在合成完第一個(gè)編碼的多肽后，核糖體可以不脫離mRNA而繼續(xù)翻譯合成下一個(gè)基因編碼的多肽，直至合成完而繼續(xù)翻譯合成下一個(gè)基因編碼的多肽，直至合成完這條多順反子這條多順反子

36、mRNA所編碼的全部多肽。所編碼的全部多肽。結(jié)構(gòu)基因群結(jié)構(gòu)基因群, 密碼子使用頻率密碼子使用頻率(提高產(chǎn)量提高產(chǎn)量) 產(chǎn)物的穩(wěn)定性產(chǎn)物的穩(wěn)定性,產(chǎn)量產(chǎn)量,免疫原性免疫原性,提純提純 (表達(dá)融合蛋白質(zhì)表達(dá)融合蛋白質(zhì))n 多基因串聯(lián)表達(dá)多基因串聯(lián)表達(dá)(適當(dāng)?shù)拿附馕稽c(diǎn)適當(dāng)?shù)拿附馕稽c(diǎn)) n 多表位串聯(lián)表達(dá)多表位串聯(lián)表達(dá)(適當(dāng)?shù)倪B結(jié)子適當(dāng)?shù)倪B結(jié)子n linker.保持免疫原性保持免疫原性) n 產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置(可溶性可溶性,包函體包函體)n 產(chǎn)物便于提純產(chǎn)物便于提純 . n外源基因串聯(lián)外源基因串聯(lián)在強(qiáng)啟動(dòng)子下進(jìn)行表達(dá)在強(qiáng)啟動(dòng)子下進(jìn)行表達(dá),是增是增加基因劑量的一種方法。加基因劑量的一

37、種方法。nShen等首先通過目的基因自身串聯(lián)來增等首先通過目的基因自身串聯(lián)來增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性加產(chǎn)物的穩(wěn)定性;并有效地利用細(xì)胞代謝并有效地利用細(xì)胞代謝能力能力,提高目的蛋白的產(chǎn)量。操縱子串聯(lián)對(duì)提高目的蛋白的產(chǎn)量。操縱子串聯(lián)對(duì)宿主細(xì)胞無毒害作用宿主細(xì)胞無毒害作用,是行之有效的提高基是行之有效的提高基因劑量的方法。因劑量的方法。 （1）對(duì)于絕大多數(shù)的簡并密碼子中的一個(gè)或兩個(gè)具有偏好；（2）某些密碼子對(duì)所有不同的基因都是最常用的，無論蛋白質(zhì)的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密碼子；（3）高度表達(dá)的基因比低表達(dá)的基因表現(xiàn)更大程度的密碼子偏好；（4）同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的tRNA含量有高度相關(guān)性

38、。這些結(jié)果暗示,富含E.coli不常用密碼子的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表達(dá)。 簡并密碼微精氨酸t(yī)RNAArg(AGG/AGA)是多種哺乳動(dòng)物基因在細(xì)菌中表達(dá)的限制因子。因?yàn)锳GA和AGG在E.coli中不常用。用常用密碼子替換稀有密碼子或與“稀有”tRNA基因共表達(dá)可以提高外源基因在E.coli中的表達(dá)水平。至今尚未找到協(xié)調(diào)密碼子的使用和轉(zhuǎn)錄本翻譯的精確規(guī)則。似乎在轉(zhuǎn)錄本5末端附近存在稀有密碼子將會(huì)影響翻譯效率。另外，基因5編碼區(qū)中GC含量似乎也影響其表達(dá)。 E.coli中不常用的密碼子中不常用的密碼子 密碼子 氨基酸AGA,AGG,CGA,CGG ArgUGU,UGC Cys

39、AUA IleCUA,CUC LeuCCC,CCU,CCA ProUCA,AGU,UCG,UCC SerACA Thr 稀有密碼子對(duì)翻譯的影響稀有密碼子對(duì)翻譯的影響n大腸桿菌DNA復(fù)制時(shí)岡崎片段的RNA引物是由dnaG基因編碼的引物酶催化合成的，細(xì)胞對(duì)這種酶的需求量不大，而引物酶過多對(duì)細(xì)胞是有害的。已知dnaG和rpoD及rpsU（30S核糖體上的S21蛋白）屬于同一個(gè)操縱子，而這3個(gè)基因產(chǎn)物在數(shù)量上卻大不相同，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)僅有50個(gè)拷貝的dnaG蛋白，卻有2 800個(gè)拷貝的rpoD蛋白，更有高達(dá)40 000個(gè)拷貝的rpsU蛋白。n研究dnaG序列發(fā)現(xiàn)其中含有不少稀有密碼子。由于細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)于稀有

40、密碼子的tRNA較少，高頻率使用這些密碼子的基因翻譯過程速度十分緩慢，合成蛋白質(zhì)的量就少。n許多調(diào)控蛋白如LacI、AraC、TrpR與 dnaG情況相似，使用稀有密碼子。GenBank 原始記錄中記載的編碼區(qū)有 6058 個(gè)，但只有 5922 個(gè)是完整的。下列大腸桿菌的密碼子頻率表是根據(jù)這些完整的編碼區(qū)（共編碼 1813623 個(gè)氨基酸）得出的。 密碼子使用頻率密碼子使用頻率 T C A G T phe 58.22 % ser 14.88% Tgr 57.74% cys 44.00 % T phe 41.78 % ser 14.91 % Tgr 42.26% cys 42.260 % C l

41、eu 13.52 % ser 13.69 % stp 59.54% stp 32.10 % A leu 12.60% ser 14.49 % stp 8.37% Trp 100.0 % GStp終止終止密碼子密碼子 密碼子使用頻率密碼子使用頻率 T C A G C leu 11.13 % pro 16.85% his 57.59% Arg 35.63% T leu 10.24% pro 12.94% his 42.41% Arg 37.23% C leu 3.91% pro 19.45% Glu 33.83% Arg 6.87% A leu 48.60% pro 50.77% Glu 66.1

42、7% Arg 11.08% G 密碼子使用頻率密碼子使用頻率 T C A G A ILeu 49.79% Thr 16.93% Asn 47.80% Ser 15.82% T ILeu 40.16% Thr 40.90% Asn 52.20% Ser 26.21% C ILeu 10.05% Thr 15.39% Lys 74.83% Arg 5.72 % A Met 100.00% Thr 26.79% Lys 25.17% Arg 3.47% G 密碼子使用頻率密碼子使用頻率 T C A G G Val 25.9% Ala 16.00% Asp 63.04% Gly 33.06% T Va

43、l 21.25% Ala 27.05% Asp 39.93% Gly 38.19% C Val 15.70% Ala 22.21% Glu 67.23% Gly 12.61% A Val 37.06% Ala 34.04% Glu 32.77% Gly 16.14% GnGuo Y J,報(bào)道人的EPO基因在大腸桿菌中使基因在大腸桿菌中使用頻率為用頻率為0%或或1%的密碼子占密碼子總量的確的密碼子占密碼子總量的確14.3 %,表達(dá)融合蛋白量為表達(dá)融合蛋白量為29.7 %和和17.5 %.說說明一個(gè)基因中的密碼子使用頻率與翻譯延伸明一個(gè)基因中的密碼子使用頻率與翻譯延伸速率之間不是簡單的對(duì)應(yīng)關(guān)系速率

44、之間不是簡單的對(duì)應(yīng)關(guān)系.n n稀有密碼子對(duì)翻譯延伸的影響不僅與含量有關(guān)更稀有密碼子對(duì)翻譯延伸的影響不僅與含量有關(guān)更重要的是它在重要的是它在mRNA中分布中分布.稀有密碼子不能集中稀有密碼子不能集中分布分布.n影響翻譯速率因素中影響翻譯速率因素中,翻譯起始是一個(gè)主要限制因翻譯起始是一個(gè)主要限制因素素.n5加加36bp(12)和和1300bp的多肽組成的融合表達(dá)的多肽組成的融合表達(dá),表表達(dá)水平相近達(dá)水平相近.n密碼子使用偏向密碼子使用偏向;n認(rèn)為認(rèn)為;n1,翻譯的準(zhǔn)確性和效率翻譯的準(zhǔn)確性和效率.n2,選擇性和非選擇性堿基替換偏向選擇性和非選擇性堿基替換偏向.n同義密碼子的使用與翻譯的快慢同義密碼子

45、的使用與翻譯的快慢(核糖體沿核糖體沿mRNA行進(jìn)的速度行進(jìn)的速度)有關(guān)有關(guān).n不同物種在堿基非隨機(jī)使用有差異不同物種在堿基非隨機(jī)使用有差異.原核生物和真原核生物和真核生物在蛋白質(zhì)翻譯和折疊機(jī)制上有差異核生物在蛋白質(zhì)翻譯和折疊機(jī)制上有差異.n對(duì)對(duì)Ecoli和和Yeast將同義密碼子分為將同義密碼子分為;最適密最適密碼子碼子,非最適密碼子非最適密碼子,稀有密碼子稀有密碼子.n高表達(dá)基因偏好使用高表達(dá)基因偏好使用tRNA豐富的密碼子豐富的密碼子.或或能與能與tRNA更好結(jié)合的密碼子更好結(jié)合的密碼子.5端端同義密碼密碼子用語很重要子用語很重要.nLi W J報(bào)道報(bào)道;n稀有密碼子稀有密碼子CUA和和C

46、GA(尤其是在起始區(qū)尤其是在起始區(qū))對(duì)基因?qū)虮磉_(dá)影響不是很大表達(dá)影響不是很大.n起始區(qū)起始區(qū)NNW(W=U或或A)型密碼子偏好型密碼子偏好.NNS尤其是尤其是NNG型密碼子被較強(qiáng)抑制是普遍現(xiàn)象型密碼子被較強(qiáng)抑制是普遍現(xiàn)象.n終止區(qū)密碼子對(duì)表達(dá)有影響終止區(qū)密碼子對(duì)表達(dá)有影響;Arg(AGA,和和AGG 增增強(qiáng)強(qiáng)),Gly(GGA,和和GGG增強(qiáng)增強(qiáng)),Glu(GAG增增強(qiáng)強(qiáng)),Ile(AUA增強(qiáng)增強(qiáng)). 克隆基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)克隆基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá) 外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位大腸桿菌細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使表達(dá)的外源蛋白可大腸桿菌細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使表達(dá)

47、的外源蛋白可能定位的五個(gè)位置是能定位的五個(gè)位置是:胞質(zhì)胞質(zhì),胞質(zhì)膜胞質(zhì)膜,胞周質(zhì)胞周質(zhì),外外膜和胞外培養(yǎng)基膜和胞外培養(yǎng)基 不同部位表達(dá)外源基因各有優(yōu)缺點(diǎn)不同部位表達(dá)外源基因各有優(yōu)缺點(diǎn)許多外源蛋白在大腸桿菌中高水平表達(dá)，許多外源蛋白在大腸桿菌中高水平表達(dá)，最后都會(huì)導(dǎo)致形成變性的包涵體，它是最后都會(huì)導(dǎo)致形成變性的包涵體，它是致密的不溶性蛋白和致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚體，含的凝聚體，含有大部分的表達(dá)蛋白。蛋白質(zhì)沉淀形成有大部分的表達(dá)蛋白。蛋白質(zhì)沉淀形成包涵體有利的一面是可以利用包涵體的包涵體有利的一面是可以利用包涵體的不溶性和致密性，相對(duì)容易地對(duì)之進(jìn)行不溶性和致密性，相對(duì)容易地對(duì)之進(jìn)行初級(jí)純化

48、。此外，以可溶性蛋白形式表初級(jí)純化。此外，以可溶性蛋白形式表達(dá)時(shí)往往易被降解的蛋白質(zhì)，達(dá)時(shí)往往易被降解的蛋白質(zhì)，以包涵體形式表達(dá)時(shí)卻可以很穩(wěn)定。以包涵體形式表達(dá)時(shí)卻可以很穩(wěn)定。包涵體包涵體 溶解菌體分離了包含體；溶解菌體分離了包含體；28M的鹽的鹽酸胍均能溶解表達(dá)產(chǎn)物酸胍均能溶解表達(dá)產(chǎn)物 形成的包含體；形成的包含體；24 M的尿素只能部分溶解包含體，的尿素只能部分溶解包含體，68 M 的尿素可基本溶解包含體鹽的尿素可基本溶解包含體鹽酸胍的變性能力較尿素強(qiáng)，然而使用尿素酸胍的變性能力較尿素強(qiáng)，然而使用尿素 更為經(jīng)濟(jì)更為經(jīng)濟(jì)n屬于大腸桿菌家族蛋白屬于大腸桿菌家族蛋白,是周是周質(zhì)腔肽基脯氨酸順反異構(gòu)

49、酶的一種。它有兩種質(zhì)腔肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的一種。它有兩種功能功能,有順反異構(gòu)和分子伴侶功能有順反異構(gòu)和分子伴侶功能,確切地講確切地講,能與早期折疊中間體結(jié)合并阻止它的聚合能與早期折疊中間體結(jié)合并阻止它的聚合,因此能有效地促進(jìn)目的蛋白的可溶表達(dá)。因此能有效地促進(jìn)目的蛋白的可溶表達(dá)。 表達(dá)部位表達(dá)部位優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)缺缺 點(diǎn)點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)1)形成包涵體形成包涵體蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用蛋白質(zhì)無活性，不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害蛋白質(zhì)無活性，不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害2)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高3)表達(dá)

50、的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單1)形成包涵體形成包涵體蛋白質(zhì)折疊，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法蛋白質(zhì)折疊，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法 恢復(fù)其生物學(xué)活性恢復(fù)其生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本較高蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本較高2)還原的環(huán)境不利于二硫鍵形成還原的環(huán)境不利于二硫鍵形成3)由于由于N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白質(zhì)末端存在甲硫氨酸，使蛋白質(zhì)的真實(shí)性受影響的真實(shí)性受影響4)蛋白質(zhì)會(huì)被酶解蛋白質(zhì)會(huì)被酶解5)蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復(fù)雜蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復(fù)雜周質(zhì)周質(zhì)1)蛋白種類少，純化較簡單。蛋白種類少，純化較簡單。2)蛋白質(zhì)酶解程度不嚴(yán)重蛋白質(zhì)酶解程度不嚴(yán)

51、重3)促進(jìn)二硫鍵形成和蛋白質(zhì)的折疊作用促進(jìn)二硫鍵形成和蛋白質(zhì)的折疊作用4)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)N-端結(jié)構(gòu)真實(shí)端結(jié)構(gòu)真實(shí)1) 信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)2)有可能形成包涵體有可能形成包涵體胞外胞外1)蛋白質(zhì)的酶解作用程度最低蛋白質(zhì)的酶解作用程度最低2)分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，易于純化。分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，易于純化。3)增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)N-末端的結(jié)構(gòu)真實(shí)末端的結(jié)構(gòu)真實(shí)1)在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去。不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去。2)由于分泌在胞

52、外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白的純化過程比較復(fù)雜。此目標(biāo)蛋白的純化過程比較復(fù)雜。在大腸桿菌中不同部位表達(dá)外源蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)在大腸桿菌中不同部位表達(dá)外源蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)n胞質(zhì)胞質(zhì),胞質(zhì)膜胞質(zhì)膜,胞周質(zhì)胞周質(zhì),胞外膜和胞外胞外膜和胞外培養(yǎng)基培養(yǎng)基,五種表達(dá)定位方式各有其五種表達(dá)定位方式各有其特點(diǎn)和用途。特點(diǎn)和用途。 非融合蛋白質(zhì)的表達(dá)和非融合蛋白質(zhì)的表達(dá)和融合蛋白質(zhì)的表達(dá)融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白稱為的表達(dá)蛋白稱為非融合蛋白質(zhì)非融合蛋白質(zhì)。反之稱反之稱為為融合蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)。重

53、組體的篩選重組體的篩選重組體的篩選是重組體的篩選是DNA體外重組技術(shù)中的一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。體外重組技術(shù)中的一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。基本策略基本策略: 直接篩選法直接篩選法:借助遺傳學(xué)表型進(jìn)行篩選的方法借助遺傳學(xué)表型進(jìn)行篩選的方法間接篩選法間接篩選法:檢測重組體克隆中是否含有目的基因的核苷酸序列檢測重組體克隆中是否含有目的基因的核苷酸序列或產(chǎn)生目的基因所編碼的產(chǎn)物?；虍a(chǎn)生目的基因所編碼的產(chǎn)物。直接篩選常用的方法直接篩選常用的方法: 插入失活法插入失活法插入表達(dá)法插入表達(dá)法 遺傳互補(bǔ)法遺傳互補(bǔ)法 噬菌斑形成篩選法噬菌斑形成篩選法間接篩選常用的方法間接篩選常用的方法: 核酸水平上的檢測核酸水平上的檢測

54、: 根據(jù)質(zhì)粒大小與酶切圖譜鑒定根據(jù)質(zhì)粒大小與酶切圖譜鑒定 核酸探針檢測法核酸探針檢測法: 菌落菌落(噬菌斑噬菌斑)原位雜交原位雜交 Southern blot Northern blot PCR DNA序列測定序列測定nTrx-TagnV5 epitope 41bpnGST非融合蛋白質(zhì)非融合蛋白質(zhì)表達(dá)，是將帶有的真核基表達(dá)，是將帶有的真核基因插到因插到原核原核啟動(dòng)子和序列的下游，表達(dá)表達(dá)得到非融合蛋白質(zhì)非融合蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)接近天然蛋白質(zhì)，缺點(diǎn)蛋白質(zhì)，缺點(diǎn)是容易被宿主細(xì)菌破壞是容易被宿主細(xì)菌破壞。融合蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)表達(dá)，是表達(dá)，是指蛋白質(zhì)的末端由指蛋白質(zhì)的末端由原核原核序列或其它序列，末端由真核

55、基因的完整末端由真核基因的完整序列，表表達(dá)達(dá)得到融合蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)的表達(dá)融合蛋白質(zhì)的表達(dá)(1) 由報(bào)告基因的編碼序列和另一個(gè)基因的啟動(dòng)子及其它的調(diào)節(jié)序列由報(bào)告基因的編碼序列和另一個(gè)基因的啟動(dòng)子及其它的調(diào)節(jié)序列構(gòu)成。被廣泛用于研究啟動(dòng)子的功能及其調(diào)控作用的分子機(jī)理。構(gòu)成。被廣泛用于研究啟動(dòng)子的功能及其調(diào)控作用的分子機(jī)理。(2) 由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成。被用于生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)。構(gòu)成。被用于生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)。 融合基因融合基因(fusion gene)：通常是指通過自發(fā)突變事件通常是指通過自發(fā)突變

56、事件(如兩個(gè)如兩個(gè)連鎖基因之間發(fā)生的不等價(jià)交換連鎖基因之間發(fā)生的不等價(jià)交換)形成的、或是應(yīng)用形成的、或是應(yīng)用DNA體外重組技體外重組技術(shù)構(gòu)建的、一類來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新基術(shù)構(gòu)建的、一類來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新基因。其中由體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型：因。其中由體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型：n融合表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)融合表達(dá)的優(yōu)點(diǎn):n(1)利用原核宿主的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)利用原核宿主的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),易于啟動(dòng)易于啟動(dòng),可增加目的蛋白的表達(dá)量可增加目的蛋白的表達(dá)量;n(2)可減少菌體內(nèi)水解酶的作用可減少菌體內(nèi)水解酶的作用,使目的蛋白、使目的蛋白、特別是小分子目的蛋白得

57、到保護(hù)特別是小分子目的蛋白得到保護(hù)n(3)融合蛋白大多可正確折疊融合蛋白大多可正確折疊,減少了包涵體減少了包涵體的形成的形成;n(4)便于親和層析分離和檢測便于親和層析分離和檢測,目的蛋白可從目的蛋白可從融合蛋白獲得融合蛋白獲得;n(5)引導(dǎo)蛋白引導(dǎo)蛋白(或肽或肽)一般不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)一般不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能和功能,免疫原性小免疫原性小,融合蛋白可直接作抗原融合蛋白可直接作抗原生產(chǎn)抗體。但如果融合蛋白的兩部分互相作生產(chǎn)抗體。但如果融合蛋白的兩部分互相作用影響折疊用影響折疊,很容易受蛋白酶水解很容易受蛋白酶水解 。n6),克隆的外源基因的有效轉(zhuǎn)譯克隆的外源基因的有效轉(zhuǎn)譯,不僅取決于核糖體結(jié)

58、不僅取決于核糖體結(jié)合位點(diǎn)的存在與否合位點(diǎn)的存在與否,而且同樣也受到編碼區(qū)起點(diǎn)的核而且同樣也受到編碼區(qū)起點(diǎn)的核苷酸序列的影響苷酸序列的影響.可能是由于鏈內(nèi)堿基配對(duì)所形成的可能是由于鏈內(nèi)堿基配對(duì)所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)干擾了核糖體同其結(jié)合位點(diǎn)之間接觸二級(jí)結(jié)構(gòu)干擾了核糖體同其結(jié)合位點(diǎn)之間接觸.如果如果該區(qū)段完全是由天然的大腸桿菌序列構(gòu)成該區(qū)段完全是由天然的大腸桿菌序列構(gòu)成,這種情況這種情況就可以避免。就可以避免。n7),在融合蛋白質(zhì)的起始部位存在著大腸桿菌的多肽在融合蛋白質(zhì)的起始部位存在著大腸桿菌的多肽片段片段.可使蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定可使蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定,免受寄主胞內(nèi)酶的降解免受寄主胞內(nèi)酶的降解作用作用,因而可以

59、得到較高的產(chǎn)率。因而可以得到較高的產(chǎn)率。n8),融合蛋白的大腸桿菌多肽片段融合蛋白的大腸桿菌多肽片段,有可能構(gòu)成一種信有可能構(gòu)成一種信號(hào)肽號(hào)肽,使大腸桿菌蛋白質(zhì)分配到細(xì)胞的正確位置。使大腸桿菌蛋白質(zhì)分配到細(xì)胞的正確位置。n9),融合蛋白質(zhì)中的大腸桿菌多肽片段融合蛋白質(zhì)中的大腸桿菌多肽片段,同樣也能夠使同樣也能夠使得能夠用親和層析技術(shù)分離純化融合蛋白質(zhì)。得能夠用親和層析技術(shù)分離純化融合蛋白質(zhì)。10),利用融合蛋白對(duì)目的基因進(jìn)行示蹤利用融合蛋白對(duì)目的基因進(jìn)行示蹤,研究其表達(dá)調(diào)控特征研究其表達(dá)調(diào)控特征及生理功能其中應(yīng)用最多的標(biāo)記基因當(dāng)屬基因及生理功能其中應(yīng)用最多的標(biāo)記基因當(dāng)屬基因,因?yàn)橐驗(yàn)樗子谟^察

60、它易于觀察,不需顯色反應(yīng)。不需顯色反應(yīng)。11),利用融合基因增強(qiáng)目的基因的表達(dá)通常是利用生物體中利用融合基因增強(qiáng)目的基因的表達(dá)通常是利用生物體中高效表達(dá)的基因或其部分序列為擔(dān)體高效表達(dá)的基因或其部分序列為擔(dān)體(Carrier)序列序列,將目的將目的基因嵌合在它的下游基因嵌合在它的下游,隨著擔(dān)體序列的高度表達(dá)隨著擔(dān)體序列的高度表達(dá),目的基因目的基因也得到高效表達(dá)也得到高效表達(dá),表達(dá)出的融合蛋白的端含有由擔(dān)體序列表達(dá)出的融合蛋白的端含有由擔(dān)體序列編碼的片段。編碼的片段。12),利用融合蛋白改變目的蛋白的免疫原性利用融合蛋白改變目的蛋白的免疫原性,產(chǎn)生無毒疫苗產(chǎn)產(chǎn)生無毒疫苗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌腸毒素大腸