1、生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第三章基因工程載體第三章基因工程載體第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體 第二節(jié)表達(dá)載體第二節(jié)表達(dá)載體 第三節(jié)其它特殊用途載體第三節(jié)其它特殊用途載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容掌握載體、克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、掌握載體、克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、-互補(bǔ)、插入失活、人工染色體載體的概念?；パa(bǔ)、插入失活、人工染色體載體的概念。 克隆載體克隆載體DNA分子具備的條件。分子具備的條件。 標(biāo)記基因的分類及其作用。標(biāo)記基因的分類及其作用。 pUC18/19質(zhì)粒載體的組成、優(yōu)點(diǎn)及質(zhì)?？寺≥d體用途。質(zhì)粒載體的組成、優(yōu)點(diǎn)及質(zhì)粒克隆載體用途。 -DNA載體的構(gòu)建

2、、類型及其優(yōu)點(diǎn)。載體的構(gòu)建、類型及其優(yōu)點(diǎn)。 植物表達(dá)載體的組成、啟動子的類型等植物表達(dá)載體的組成、啟動子的類型等 遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì) + + 載體載體 重組的重組的DNADNA分子分子 引入細(xì)胞或生物體內(nèi)引入細(xì)胞或生物體內(nèi) 復(fù)制與表達(dá)復(fù)制與表達(dá) 穩(wěn)定地遺傳給下代穩(wěn)定地遺傳給下代 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院基因工程流程圖基因工程流程圖生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院DNA： 1）獨(dú)立的一個(gè)包括啟動子（）獨(dú)立的一個(gè)包括啟動子（promoter)、編碼區(qū)、編碼區(qū)（encoding region)和終止子（和終止子（terminator)的基因，的基因，or 組成組成基因的某個(gè)元件，一般是

3、不可以進(jìn)入受體細(xì)胞的；基因的某個(gè)元件，一般是不可以進(jìn)入受體細(xì)胞的； 2）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。所以，通過不同途徑能將承載的外源所以，通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。分子稱為基因工程載體。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院載體的概念載體的概念u載體（載體（vector) 是由在細(xì)胞中能夠是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的自主復(fù)制的DNA分子分子構(gòu)成的一構(gòu)成的一種遺傳成分；種遺傳成分； 基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)基因工程中

4、，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具稱為載體。增和表達(dá)的工具稱為載體。u目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持高效表達(dá)，在很大程度上決定于載體高效表達(dá)，在很大程度上決定于載體 。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院載體的功能載體的功能載體的功能載體的功能 u運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 u為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 u為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 載體的要求載體的要求A A、復(fù)制起點(diǎn)：能在受體中復(fù)制；、復(fù)制起點(diǎn)：能在受

5、體中復(fù)制；B B、篩選標(biāo)記；、篩選標(biāo)記；C C、限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；、限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；D D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；、載體的大小：原則上要求載體越小越好；E E、適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；、適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；F F、載體的安全性：質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移、載體的安全性：質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移; ;G G、外源基因的表達(dá)：啟動子、外源基因的表達(dá)：啟動子。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)大腸桿菌質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體 pB

6、R322結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) 遺傳標(biāo)記基因遺傳標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院載體的分類載體的分類按功能分類按功能分類 克隆載體克隆一個(gè)基因或克隆載體克隆一個(gè)基因或DNA片斷片斷 表達(dá)載體用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)表達(dá)載體用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá) 整合載體把一個(gè)基因插入到染色體組中整合載體把一個(gè)基因插入到染色體組中 按來源分類按來源分類 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 噬菌體載體噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體 人工染色體載體人工染色體載體 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院載體的種類和特征載體的種類和特征質(zhì)粒質(zhì)粒*受體細(xì)胞受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)插入片斷插入片斷舉例舉例 E.coli

7、環(huán)狀環(huán)狀 8kbpUC18/19 , T-載體等載體等 噬菌體噬菌體E.coli線狀線狀9 - 24kb EMBL系列，系列， gt系列系列絲狀噬菌體及噬菌粒絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀環(huán)狀 10 kbM13mp系列系列粘粒載體粘粒載體E.coli環(huán)狀環(huán)狀35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli環(huán)狀環(huán)狀300 kb Pel oBAC系列系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞線性染色體線性染色體 100 -

8、2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細(xì)胞哺乳類細(xì)胞線性染色體線性染色體 1000 kb病毒載體病毒載體動物細(xì)胞動物細(xì)胞環(huán)狀環(huán)狀SV40 載體，昆蟲載體，昆蟲 桿狀病毒載體桿狀病毒載體穿梭載體穿梭載體動物細(xì)胞動物細(xì)胞 和細(xì)菌和細(xì)菌環(huán)狀環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，質(zhì)粒，PBV, Ti質(zhì)粒質(zhì)粒生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) 克隆載體克隆載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體1.質(zhì)粒的概念質(zhì)粒的概念 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid)是一種存在于細(xì)菌或真是一種存在于細(xì)菌或真菌染色體外的小型菌染色體外的小型環(huán)狀環(huán)狀（線型質(zhì)粒（線型質(zhì)粒DNA

9、分子分子 眼蟲、衣藻等）雙鏈眼蟲、衣藻等）雙鏈DNA 分子分子（酵母的（酵母的“殺傷質(zhì)粒殺傷質(zhì)?！笔鞘荝NA），可），可自身自身復(fù)制和表達(dá)復(fù)制和表達(dá)。 并不是寄主生長所必需的，但可以賦并不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力的能力（帶有抗性基因等）（帶有抗性基因等） 。 分子量在分子量在1-200kb之間之間 。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體大腸桿菌的質(zhì)粒大腸桿菌的質(zhì)粒生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體2.質(zhì)粒的空間構(gòu)型質(zhì)粒的空間構(gòu)型 共價(jià)閉合環(huán)狀共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（Covalent close

10、 circular DNA，cccDNA) 呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil） 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 開環(huán)開環(huán)DNA（ open circular， ocDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。 線形線形DNA （ linear ，LDNA）生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： SC DNA最快、最快、L DNA次之、次之、OC DNA最慢。最慢。 SC OC L 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一

11、、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體3.質(zhì)粒的基本特性質(zhì)粒的基本特性 質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒的自主復(fù)制性 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent plasmid） (拷貝數(shù)少，為拷貝數(shù)少，為1-5個(gè)個(gè))和和松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxed） (拷貝數(shù)

12、多，可達(dá)拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷個(gè)拷貝貝) 因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。 質(zhì)粒質(zhì)粒 復(fù)制子復(fù)制子 拷貝數(shù)拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 pMB1 1520 pUC 系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 突變的突變的 pMB1 500700 pSC101 及其衍生質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒pSC101 5 ColE1ColE11520生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性又稱質(zhì)粒的不親和性) 兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。兩個(gè)

13、質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體稱為具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體稱為不相容群不相容群，一般具有相，一般具有相同的復(fù)制子。同的復(fù)制子。 以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性 接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)

14、粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用）。細(xì)胞（接合作用）。 甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。粒的受體菌中。 非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用。不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 mob、tra 基因順式因子基因順式因子bom及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位

15、點(diǎn)及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn)nic決定。決定。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體Tra protein from conjugative plasmidbom siteMob genemob mRNAMob proteinopen recipient cellhelper plasmid即即mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的oriT位點(diǎn)位點(diǎn)，借助接合質(zhì)，借助接合質(zhì)粒粒tra基因的產(chǎn)物基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒，使非接合質(zhì)粒被動遷移到被動遷移到受體細(xì)胞中，這受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為種現(xiàn)象稱為遷移作用遷移作用(mobilization)。質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的可

16、轉(zhuǎn)移性生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體大腸桿菌接合（大腸桿菌接合（conjunctionconjunction）質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的的tratra基因基因E.ColiE.Coli產(chǎn)生菌毛產(chǎn)生菌毛宿主與受體細(xì)胞結(jié)合宿主與受體細(xì)胞結(jié)合遺傳物在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移遺傳物在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移（指令）（指令）（遷移）（遷移）生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體攜帶特殊的遺傳標(biāo)記攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 野生型的質(zhì)粒野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基 因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀

17、，包括： 物質(zhì)抗性物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物 物質(zhì)合成物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿 這些標(biāo)記基因?qū)@些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義重組分子的篩選具有重要意義生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體遺傳標(biāo)記基因遺傳標(biāo)記基因 定義定義: :在基因工程中使用與選擇重組體在基因工程中使用與選擇重組體DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因 標(biāo)記基因的作用標(biāo)記基因的作用 1. 指示外源指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 2. 指示外源指示外源

18、DNA分子是否插入載體分子形成了重組子分子是否插入載體分子形成了重組子 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體標(biāo)記基因的種類標(biāo)記基因的種類 1. 抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金屬抗性基因重金屬抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代謝抗性基因代謝抗性基因: TK，抗除草劑基因，抗除草劑基因 2. 營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成

19、酶類的基因，主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因， 這這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。等。 3. 生化標(biāo)記基因生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ， GUS，CAT 4. 噬菌斑噬菌斑生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法插入失活法) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因常用的遺傳標(biāo)記基因 -半乳糖苷酶基

20、因（半乳糖苷酶基因（lacZ和和lacZ） -半乳糖苷酶基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋半乳糖苷酶基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：白質(zhì)可分為兩部分：鏈和鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具-半乳半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為-互補(bǔ)作用互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，分別由兩個(gè)基因編碼。為。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，分別由兩個(gè)基因編碼。為鏈編鏈編碼的基因稱之為碼的基因稱之為lacZ(編碼編碼145 AAs)。這兩個(gè)基因（。這兩

21、個(gè)基因（LacZ和和LacZ）均可作為標(biāo)記基因。均可作為標(biāo)記基因。 -半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn)半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn): a. 酶催化酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZ編碼編碼5-端可容許很大的變化而不影響酶活性端可容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZ和和鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 P LacZ LacZ 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 常用的遺傳標(biāo)記基因常用的遺傳標(biāo)記基因 LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體la

22、cZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解半乳糖分解半乳糖i P O 調(diào)控蛋白調(diào)控蛋白P 大腸桿菌的大腸桿菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系統(tǒng)系統(tǒng)生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖i P O 調(diào)控蛋白調(diào)控蛋白P -肽段肽段分解分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑IPTGa-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突變體突變體M15 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體X-galX-gal -peptideC-terminus of b b-gala

23、ctosiase +生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體互補(bǔ)顯色反應(yīng)互補(bǔ)顯色反應(yīng) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體-互補(bǔ)互補(bǔ)(-complementation) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因常用的遺傳標(biāo)記基因 葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 該基因編碼一種可分解各種該基因編碼一種可分解各種-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十分廣泛，因基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十分廣泛，因?yàn)樵S多生物中沒有這種基因。為許多生

24、物中沒有這種基因。 熒光素酶基因熒光素酶基因 熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的倍；或由發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的熒光素酶，它與熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。的變化測定酶活。 發(fā)光蛋白質(zhì)基因發(fā)光蛋白質(zhì)基因 發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。菌菌落呈藍(lán)色。 生命科學(xué)學(xué)院

25、生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體4.質(zhì)粒的命名原則質(zhì)粒的命名原則 人工組建的質(zhì)粒人工組建的質(zhì)粒 人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字（人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的）的第一個(gè)字符第一個(gè)字符p，用小寫。，用小寫。p后有后有2個(gè)字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和個(gè)字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號。如實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號。如pBR322，字母，字母p代表質(zhì)代表質(zhì)粒，粒，BR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，322代表代表構(gòu)建的一系構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號。質(zhì)粒的編號。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載

26、體質(zhì)粒載體 5.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況質(zhì)粒載體的發(fā)展概況 第一階段第一階段（1977年前）天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，年前）天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和和pBR322。 第二階段第二階段增大載體容量（降低載體長度），建立多克增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。系列載體。 第三階段第三階段完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如要求，如M13mp系列載體，含系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，啟動子載體，表達(dá)型載體及各種

27、探針型載體。表達(dá)型載體及各種探針型載體。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體6.質(zhì)粒載體構(gòu)建質(zhì)粒載體構(gòu)建 天然存在的野生型質(zhì)粒由于天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。 目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 5

28、 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 Tcr ColE1 6.5 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Ampr 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 第一個(gè)用于基因第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒克隆的天然質(zhì)粒, 克隆位點(diǎn)少，克隆位點(diǎn)少，Tetr 作為篩選標(biāo)志。作為篩選標(biāo)志。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院A、刪除不必要的、刪除不必要的DNA區(qū)域區(qū)域: 盡量縮小質(zhì)粒的分子量，以提盡量縮小質(zhì)粒的分子量，以提高外源高外源DNA片段的裝載量。片段的裝載量

29、。B、減少限制性酶切點(diǎn)、減少限制性酶切點(diǎn): 缺失突變，限制性酶、核酸外切酶缺失突變，限制性酶、核酸外切酶和連接酶的共同作用，機(jī)械破碎和質(zhì)粒之間的重組等方法。和連接酶的共同作用，機(jī)械破碎和質(zhì)粒之間的重組等方法。C、加入易于識別的選擇標(biāo)記：、加入易于識別的選擇標(biāo)記：通過質(zhì)粒之間的重組，可以通過質(zhì)粒之間的重組，可以使質(zhì)粒帶有合適的選擇性標(biāo)記。使質(zhì)粒帶有合適的選擇性標(biāo)記。D、安全性能改造：、安全性能改造：質(zhì)粒載體不能在細(xì)菌之間隨便轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒載體不能在細(xì)菌之間隨便轉(zhuǎn)移。E、改造或加入基因表達(dá)的調(diào)控序列：、改造或加入基因表達(dá)的調(diào)控序列：啟動子。啟動子。質(zhì)粒的改造質(zhì)粒的改造生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、

30、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體7.質(zhì)粒載體的分類質(zhì)粒載體的分類 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因擴(kuò)增基因 低拷貝質(zhì)粒低拷貝質(zhì)粒 來自來自pSC101 拷貝數(shù)小于拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因表達(dá)某些毒性基因 溫敏質(zhì)粒溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì) 測序質(zhì)粒測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker 整合質(zhì)粒整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因

31、及位點(diǎn)裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合便于外源基因的整合 穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆便于基因克隆 表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件 探針質(zhì)粒探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因裝有報(bào)告基因 便于啟動子等元件的克隆篩選便于啟動子等元件的克隆篩選 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體8.常用質(zhì)粒載體常用質(zhì)粒載體 （1）pBR322 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) ori：pMB1系列（來源于系列（來源于ColE1）高拷貝型高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因：基因：

32、pSP2124質(zhì)粒的質(zhì)粒的Ampr基因基因 Tetr基因：基因：pSC101的的Tetr 基因?；?。 長度：長度：4363bp 選擇標(biāo)記：選擇標(biāo)記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 克隆位點(diǎn)：克隆位點(diǎn)：含有多個(gè)克隆位點(diǎn)。含有多個(gè)克隆位點(diǎn)。 Ampr基因內(nèi)可被基因內(nèi)可被Pst I，Pvu I，Sac I切開，而切開，而Tetr基因可被基因可被BamH I，Hind III切開，通過插入失活篩選重組子。切開，通過插入失活篩選重組子。pBR322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pB

33、R322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院普通型載體普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖的結(jié)構(gòu)圖pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體Amp rTet rTet rAmp sPstI. . . .涂布有涂布有Tet的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基涂布有涂布有Amp的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基. . .重組

34、體的篩選重組體的篩選.外源基因的插入：外源基因的插入： BamHI片段片段(Tcr) pBR322PstI(Apr)片段片段重組分子重組分子(Aps Tcr) PstI片段片段 外源外源DNABamHI片段片段重組分子重組分子I 涂布涂布Ap平板平板分別轉(zhuǎn)化分別轉(zhuǎn)化E.coli(ApS TcS) 重組分子重組分子 涂布涂布Tc平板平板影印到影印到Tc平板上平板上Apr Tcr為原載體為原載體即為非重組子即為非重組子影印到影印到Ap平板上平板上利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程重組分子重組分子I (Apr Tcs）Apr TcS為重組子為重組子ApS Tcr為重

35、組子為重組子Tcr轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子Apr轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pBR322重組克隆的篩選重組克隆的篩選 重組克隆的重組克隆的 “插入失活插入失活”篩選方法篩選方法 pBR322插入在插入在Tetr中，基因型為中，基因型為Tets 、Ampr在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長；上不生長； pBR322插入在插入在Ampr中，基因型為中，基因型為Tetr 、Amps、在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長，在含有四環(huán)素培在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生

36、長；養(yǎng)基可生長； 而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。這種在而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫失的現(xiàn)象叫插入失活。插入失活。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pBR322重組克隆的篩選重組克隆的篩選pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：第一，具有較小的分子量第一，具有較小的分子量 4363bp。第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。 第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)

37、細(xì)第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可累積胞中可累積10003000個(gè)拷貝。個(gè)拷貝。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體（2） pUC系列質(zhì)粒載體系列質(zhì)粒載體 在在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體，其組成如下：的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體，其組成如下： 含有含有pBR322完整的完整的Ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)?；蚝蛷?fù)制起始點(diǎn)。 含有大腸桿菌含有大腸桿菌b -半乳糖酶基因半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編的啟動子及其編碼碼 -肽鏈的肽鏈的DNA序列，即序列，即lacZ基因?；颉?在在lacZ

38、基因中靠近基因中靠近5端的一段有端的一段有MCS區(qū)段，但并不區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。破壞該基因的功能。 pUC18、pUC19 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 具有較小的相對分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個(gè)細(xì)具有較小的相對分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)胞可達(dá)500-700個(gè)拷貝。個(gè)拷貝。 適用于適用于組織化學(xué)方法檢測重組體組織化學(xué)方法檢測重組體，有來自大腸桿菌有來自大腸桿菌lac操縱子的操縱子的lacZ基因，所編碼的基因，

39、所編碼的 -肽鏈可參與肽鏈可參與 -互補(bǔ)作互補(bǔ)作用，在用，在IPTG誘導(dǎo)和底物誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍(lán)色和白色存在下，形成藍(lán)色和白色菌落篩選重組體。菌落篩選重組體。 具有具有MCS區(qū)段，便于外源基因的克隆。區(qū)段，便于外源基因的克隆。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體（3）穿梭質(zhì)粒載體）穿梭質(zhì)粒載體(shuttle vector) ： 這種質(zhì)粒分子上含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及這種質(zhì)粒分子上含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細(xì)相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測，如大腸桿菌胞中復(fù)制并檢

40、測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌鏈霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒等。酵母菌穿梭質(zhì)粒等。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體TA克隆載體克隆載體(補(bǔ)充補(bǔ)充) 用用Taq酶的酶的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物3端加上了一個(gè)端加上了一個(gè)A。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出一種線。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出一種線性質(zhì)粒，其性質(zhì)粒，其5端突出的端突出的T，它們之間可以連接，即，它們之間可以連接，即TA克隆。克隆。 再生再生TA克隆載體的方法：克隆載體的方法：克隆載體的線性化克隆載體的線性化克隆載體末端補(bǔ)平克隆載體末端補(bǔ)平克隆載體末端加克隆載體末端加T生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院一、一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體生命科學(xué)學(xué)院生

41、命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體噬菌體（噬菌體（Bacteriophage）它）它本身是一種核蛋白，核心是一段本身是一種核蛋白，核心是一段DNA(線性線性)，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。注入細(xì)菌內(nèi)。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體 噬菌體或病毒的噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋河杏幂d體，因?yàn)椋?1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞；細(xì)胞； 2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在

42、受體細(xì)胞中自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增高效擴(kuò)增。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(一一)噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體；噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體； 噬菌體由外殼包裝蛋白和噬菌體由外殼包裝蛋白和-DNA組成；組成； DNA在噬菌體中是線狀在噬菌體中是線狀DNA分子，全長分子，全長 48.502kb雙鏈雙鏈DNA，60多多個(gè)基因，個(gè)基因，其中有其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增

43、殖，并不影響噬菌體的增殖，這就，這就是是噬菌體可作為基因載體的依據(jù)噬菌體可作為基因載體的依據(jù) 。 cos位點(diǎn)位點(diǎn)（cohesive end site): 在在DNA兩端各有兩端各有12nt的的5單鏈突出單鏈突出(5-GGGCGGCGACCT-3) ，彼此序列互補(bǔ)。它是包裝時(shí)的切割信號。，彼此序列互補(bǔ)。它是包裝時(shí)的切割信號。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體( (一一)噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性 噬菌體的生活周期噬菌體的生活周期生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體 噬菌體：雙鏈?zhǔn)删w：雙鏈DNA溫和噬菌體溫和噬菌體 DNA大小約為大小約為50kb 粘

44、性末端：粘性末端：12bp的互補(bǔ)單鏈的互補(bǔ)單鏈 當(dāng)當(dāng)噬菌體進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)后噬菌體進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)后, , 其粘性末端能通過堿基互其粘性末端能通過堿基互補(bǔ)作用補(bǔ)作用, , 形成環(huán)狀形成環(huán)狀DNADNA分子。粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為分子。粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為coscos位點(diǎn)位點(diǎn), , 它是它是包裝蛋白的識別位點(diǎn)包裝蛋白的識別位點(diǎn), , 噬菌體的包裝與噬菌體的包裝與DNADNA特性和其它序列無關(guān)特性和其它序列無關(guān), , 但對包裝的但對包裝的DNADNA大小有要求大小有要求, , 包裝范圍包裝范圍大約在大約在36kb-51kb36kb-51kb。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體

45、載體噬菌體作為構(gòu)建載體材料的依據(jù)：噬菌體作為構(gòu)建載體材料的依據(jù)： 噬菌體是一種溫和噬菌體；噬菌體是一種溫和噬菌體； 能承載比較大的外源能承載比較大的外源DNA片段；片段； 在在噬菌體分子上有許多限制性核酸酶識別位點(diǎn)，噬菌體分子上有許多限制性核酸酶識別位點(diǎn)，便于多種便于多種DNA酶切片段的克隆。酶切片段的克隆。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(二二)構(gòu)建構(gòu)建噬菌體的基本原理噬菌體的基本原理 (1)噬菌體的缺陷：噬菌體的缺陷： 基因組太大（基因組太大（48.5kb）；）； 酶切點(diǎn)太多，它有酶切點(diǎn)太多，它有5個(gè)個(gè)BamH1位點(diǎn)（位點(diǎn)（GGATCC），），6個(gè)個(gè)Bg位點(diǎn)（位點(diǎn)（AG

46、ATCT），），5個(gè)個(gè)EcoR位點(diǎn)位點(diǎn)（GAATTC）。）。 野生型只能接納一定長度的野生型只能接納一定長度的DNA。若相當(dāng)于。若相當(dāng)于噬菌體噬菌體的的75-105%，那么只能接納，那么只能接納48.5kb5%=2.425kb的的DNA。 重組的重組的DNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞利用體外利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(三三)構(gòu)建構(gòu)建噬菌體的基本內(nèi)容噬菌體的基本內(nèi)容 構(gòu)建構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略：噬菌體克隆載體的基本策略： 切去部分非必須的區(qū)域；切去部分

47、非必須的區(qū)域； 抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)； 插入可供選擇的標(biāo)記基因；插入可供選擇的標(biāo)記基因； 建立體外包裝系統(tǒng)。建立體外包裝系統(tǒng)。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記 (1)加裝選擇標(biāo)記加裝選擇標(biāo)記imm434 imm434基因編碼一種阻止基因編碼一種阻止-噬菌體噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的記基因的-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾渾濁斑濁斑；當(dāng)外源；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，插入到標(biāo)記基因中，基因

48、滅活，基因滅活，-重組分子便進(jìn)入溶菌循重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成環(huán)，形成透明斑透明斑。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記 (2)加裝選擇標(biāo)記加裝選擇標(biāo)記lacZ LacZ基因編碼基因編碼-半乳糖半乳糖苷酶，能催化無色的苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到因插入到lacZ基因中，基因基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體而空載體-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。透明斑。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(四四)噬菌體載體的類型噬菌體載體的類型 （1）插入型

49、載體）插入型載體 只有只有12種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn) 大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖苷酶失活半乳糖苷酶失活 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體（1）插入型載體）插入型載體 載體長度載體長度37kb插入位點(diǎn)插入位點(diǎn)體外包裝體外包裝插入片段大小：插入片段大?。?-14kb（5137）插入片段插入片段體外包裝體外包裝生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體gt10 gt10 載體載體 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(四四)噬菌體載體的類型噬菌體載體的類型 （2）替換型載體）替換型載體 在其中央部位有一個(gè)可以被外源

50、插入的在其中央部位有一個(gè)可以被外源插入的DNA分子取代的分子取代的DNA片段片段的克隆載體的克隆載體 。這是由于構(gòu)建此載體時(shí)，安排在中央可取代片段兩側(cè)的。這是由于構(gòu)建此載體時(shí)，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此，當(dāng)外源多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此，當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對克隆位插入時(shí)，一對克隆位點(diǎn)之間的點(diǎn)之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效提高了克隆外源片段便會被置換掉，從而有效提高了克隆外源DNA片段片段的能力。如：的能力。如： EMBL3生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院

51、二、噬菌體載體二、噬菌體載體插入型載體插入型載體替換型載體替換型載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(五五)常用的常用的噬菌體載體噬菌體載體 （一）（一） 半乳糖苷失活插入型載體半乳糖苷失活插入型載體 （二）（二） 免疫功能失活插入型載體免疫功能失活插入型載體 （三）（三） Charon系列取代型載體系列取代型載體 （四）（四） EMBL系列取代型載體系列取代型載體 （五）（五） Spi-正選擇取代型載體正選擇取代型載體 （六）（六） ZAP插入型載體插入型載體 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(六六)Lambda 噬菌體載體的克隆原理及步驟噬菌體載體的

52、克隆原理及步驟 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體(七七)-DNA重組分子的體外包裝重組分子的體外包裝 噬菌體噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后將重組后將重組DNA通過噬菌體導(dǎo)入通過噬菌體導(dǎo)入E.coli細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)。 這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少少E組份組份，另一部分則缺少，另一部分則缺少D組份組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液

53、被重組進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。的。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體D基因缺失的基因缺失的噬噬 菌體突變株（菌體突變株（D-） E基因缺失的基因缺失的噬噬 菌體突變株（菌體突變株（E-） E proteinD protein重組重組DNA（裂解物）（裂解物）（裂解物）（裂解物）infectassembleBHB2688-E- 的溶原菌的溶原菌BHB2690-D- 的溶原菌的溶原菌噬菌體的體外包裝系統(tǒng)噬菌體的體外包裝系統(tǒng) 生命科學(xué)學(xué)院

54、生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)作為載體的優(yōu)點(diǎn) u-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 u-DNA載體的裝載能力為載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 u重組重組-DNA分子的篩選較為方便分子的篩選較為方便 u重組重組-DNA分子的提取較為簡便分子的提取較為簡便 u-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外片段，但不適合表達(dá)外源基因源基因 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體M13、f1、fd都為絲狀單鏈都為絲狀單鏈DN

55、A噬菌體噬菌體。 優(yōu)越性：優(yōu)越性： 單鏈單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的為媒介的，這種復(fù)制形式的 DNA簡稱簡稱RFDNA； 2. 不論是不論是RFDNA還是還是ssDNA都能感染大腸桿菌；都能感染大腸桿菌； 3. 單鏈單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多的多制約的，不存在包裝限制問題；制約的，不存在包裝限制問題； 4. 容易測定外源容易測定外源DNA片斷的插入取向；片斷的插入取向； 1.5. 可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。分子。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬

56、菌體載體 M13噬菌體載體噬菌體載體 M13是一種含單鏈（是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為其基因組大小為6.4kb。 這類載體主要用來獲得大量的單這類載體主要用來獲得大量的單鏈鏈DNA片段，主要用來測定片段，主要用來測定DNA序序列（列（sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。的分析等。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體 M13噬菌體的特點(diǎn)噬菌體的特點(diǎn) 感染感染Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會形成雙鏈的復(fù)制型后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會形成雙鏈的復(fù)制型DNA

57、 （ replication form DNA, RF DNA）?？梢韵筚|(zhì)粒）?？梢韵筚|(zhì)粒DNA那那樣在體外進(jìn)行純化和操作。樣在體外進(jìn)行純化和操作。 無論是無論是RF DNA或或ss DNA都能轉(zhuǎn)染都能轉(zhuǎn)染E.coli的的F+或或F-細(xì)胞。細(xì)胞。 噬菌體顆粒的大小是受其噬菌體顆粒的大小是受其DNA的大小制約的，這一點(diǎn)的大小制約的，這一點(diǎn)正好與正好與噬菌體相反，所以噬菌體相反，所以M13噬菌體并不存在包裝限制噬菌體并不存在包裝限制的問題。的問題。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體 M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈?zhǔn)删w產(chǎn)生單雙鏈DNA的機(jī)制的機(jī)制 1、以（、以（+）鏈）鏈DNA為摸板，

58、合成互補(bǔ)（）鏈，該雙鏈稱為摸板，合成互補(bǔ)（）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型復(fù)制型DNA（RFDNA）。）。 2、RFDNA在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約約200個(gè)拷貝。個(gè)拷貝。 3、單鏈特異的、單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（結(jié)合蛋白結(jié)合在（+）鏈上，從而阻斷）鏈上，從而阻斷了其互補(bǔ)鏈，即（）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會不斷的了其互補(bǔ)鏈，即（）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會不斷的合成（合成（+）鏈）鏈DNA 。 4、游離出來的（、游離出來的（+）鏈）鏈DNA先與基因先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特的編碼產(chǎn)物形成特異的異的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)蛋

59、白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)基因基因V的蛋白質(zhì)從（的蛋白質(zhì)從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的鏈上脫落下來，余下的M13（+）鏈）鏈DNA則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體插入一段插入一段lac DNA片段，即帶有片段，即帶有b b-半半乳糖苷酶基因乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列的調(diào)控序列及其及其N端頭端頭146個(gè)個(gè)a

60、a編碼信息，宿主編碼信息，宿主F因子攜帶缺失第因子攜帶缺失第11-41位氨基酸的位氨基酸的lacZ M13mp 載體系列載體系列生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體二、噬菌體載體單純以噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體單純以噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體: : 裝載量大，裝載量大， 能排斥空載體，能排斥空載體， 轉(zhuǎn)染效率高轉(zhuǎn)染效率高, , 操作較難，操作較難， DNADNA不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。 單純以質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體單純以質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體: : 有天然的抗性選擇標(biāo)記，有天然的抗性選擇標(biāo)記， 操作容易（易于分離和轉(zhuǎn)化），操作容易（易于分離和轉(zhuǎn)化）， 較穩(wěn)定較穩(wěn)定, , 裝載量小，裝載量小， 轉(zhuǎn)化效率較低；轉(zhuǎn)化