1、光化學傳感器理論和實踐第一節(jié)第一節(jié) 識別原理識別原理生物修飾傳感組成：由內傳感器生物修飾傳感組成：由內傳感器(普通光學波導普通光學波導傳感器或化學修飾光化學傳感器傳感器或化學修飾光化學傳感器)和修飾的生物和修飾的生物敏感層組成。敏感層組成。識別原理：在生物修飾傳感器中，識別原理：在生物修飾傳感器中，修飾的生物敏感層在修飾的生物敏感層在對分析對象進行生物識別的同時，能向普通光學波對分析對象進行生物識別的同時，能向普通光學波導傳感器或化學修飾光化學傳感器提供可檢測的光導傳感器或化學修飾光化學傳感器提供可檢測的光學信號。學信號。特點：與分子或離子化學識別相比，生物識特點：與分子或離子化學識別相比，生

2、物識別有更高的選擇性與靈敏度。別有更高的選擇性與靈敏度。具有生物識別功能的生物物質具有生物識別功能的生物物質生物修飾敏感層生物修飾敏感層目前應用：生物修飾敏感層主要涉及酶，抗原或抗體目前應用：生物修飾敏感層主要涉及酶，抗原或抗體。酶酶微微生生物物抗抗原原或或抗抗體體激激素素抗抗體體結結合合蛋蛋白白植植物物凝凝血血素素酶相關知識酶相關知識酶的定義：是一類具有催化活性的蛋白質分子。酶的定義：是一類具有催化活性的蛋白質分子?；钚曰鶊F種類：組氨酸上的咪唑基、絲氨酸上的活性基團種類：組氨酸上的咪唑基、絲氨酸上的羥基、半胱氨酸上的巰基等羥基、半胱氨酸上的巰基等酶特點酶特點(優(yōu)點優(yōu)點)非常高的催化效率非常高

3、的催化效率非常高的特異性非常高的特異性影影響響酶酶活活性性因因素素環(huán)境因素：環(huán)境因素：pH值影響值影響(最佳：生理最佳：生理pH7.4), 抑制劑抑制劑 (Ag+、Hg2+、As3+等等)存在使酶失活存在使酶失活活性中心的空間構象：獨特的三維結構決定了活性中心的空間構象：獨特的三維結構決定了酶發(fā)揮其活性的基礎酶發(fā)揮其活性的基礎全酶的結構與分子組成全酶的結構與分子組成全酶全酶酶蛋白酶蛋白活性中心活性中心輔助因子輔助因子蛋蛋白白鏈鏈底底 物物 活性中心以活性中心以外的必需基團外的必需基團 結合基團結合基團 催化基團催化基團 活性中心活性中心 多肽鏈多肽鏈圖圖7-1 酶活性中心示意圖酶活性中心示意圖

4、底物敏感鏈底物敏感鏈 類別功能舉例氧化還原酶促進電子或氫轉移葡萄糖氧化酶轉移酶促進化學基團轉移轉氨酶水解酶促進水解反應蛋白、淀粉酶裂解酶促進消去反應形成雙鍵碳酸酐酶異構酶促進同分異構體的相互轉變磷酸葡萄糖變化酶連接酶促進鍵的形成，同時使ATP分子中的高能磷酸鍵斷裂谷氨酰胺合成酶酶的分類酶的分類目前主要限于：氧化還原酶，轉移酶。目前主要限于：氧化還原酶，轉移酶。原因：原因：常常伴隨有可供光學檢測的物質的產生或消耗常常伴隨有可供光學檢測的物質的產生或消耗;可直接采用普通光學波導傳感器作為內傳感器器件可直接采用普通光學波導傳感器作為內傳感器器件;有時酶所催化的化學反應可能不產生或不消耗可供檢測的物質

5、，有時酶所催化的化學反應可能不產生或不消耗可供檢測的物質，但往往伴隨有易于被化學修飾光化學傳感器檢測的物質（例如但往往伴隨有易于被化學修飾光化學傳感器檢測的物質（例如H、O2、NH3等）的生成與消耗。等）的生成與消耗。酶在光化學傳感器中應用酶在光化學傳感器中應用酶分化反應速率方程酶分化反應速率方程(一一) E + S ES P + E (酶酶 ) ( 底物底物) (中間物中間物 ) (產物產物) (酶酶)K1K-1K1葡萄糖葡萄糖(S)己糖激酶己糖激酶(E)復合物復合物(ES)誘導契誘導契合作用合作用例如：例如：酶分化反應速率方程酶分化反應速率方程(二二)穩(wěn)態(tài)近似法：穩(wěn)態(tài)近似法：米氏方程米氏方

6、程( (一一):): 米氏方程米氏方程( (二二):): 光學波導光學波導內傳感器內傳感器生物催化層生物催化層底物底物產物產物酶酶圖圖7-2 酶催化光化學傳感器識別原理酶催化光化學傳感器識別原理底物底物產物產物樣品樣品檢測器檢測器光極光極識別過程識別過程傳質傳質擴散擴散底物底物( (分析對象分析對象) )：樣品相：樣品相 生物催化層生物催化層產物：生物催化層產物：生物催化層 樣品相樣品相 穩(wěn)態(tài)響應信號：產物生成速度恰好等于產物離開生物穩(wěn)態(tài)響應信號：產物生成速度恰好等于產物離開生物 層的凈速度。層的凈速度。分析對象分析對象濃度測定濃度測定根據校正曲線根據校正曲線+穩(wěn)態(tài)響應信號穩(wěn)態(tài)響應信號(快響應

7、快響應)根據校正曲線根據校正曲線+反應速率反應速率(響應時間較長響應時間較長) 免疫反應免疫反應免疫反應：當動物體收到外界異性物質（抗原）的侵入時，免疫反應：當動物體收到外界異性物質（抗原）的侵入時，動物體內的免疫系統(tǒng)細胞就會產生一種與這些異性物質相動物體內的免疫系統(tǒng)細胞就會產生一種與這些異性物質相對抗的物質（抗體），通過抗體與抗原的結合使抗原的作對抗的物質（抗體），通過抗體與抗原的結合使抗原的作用消失。用消失。免疫反應免疫反應抗原：具有免疫原性與抗原特異性。按來源可分為天抗原：具有免疫原性與抗原特異性。按來源可分為天然抗原、人工抗原和合成原。一般為具有較大分子然抗原、人工抗原和合成原。一般為

8、具有較大分子量的生物活性物質，例如蛋白質、多糖、核酸等，量的生物活性物質，例如蛋白質、多糖、核酸等，有時為小分子活性物質有時為小分子活性物質(半抗原半抗原)，藥物，激素，肽等。，藥物，激素，肽等。免疫反應免疫反應抗體：是一類稱為免疫球蛋白的蛋白質。五種免抗體：是一類稱為免疫球蛋白的蛋白質。五種免疫球蛋白包括疫球蛋白包括IgG (主要主要)、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE。-COOH端端-NH2端端圖圖7-3 IgG 分子結構示意圖分子結構示意圖結合抗原碎結合抗原碎片片Fab可結晶可結晶 碎碎片片Fc重鏈（重鏈（heavy chain，H鏈）鏈）450550個氨基酸殘基，分子量約個氨基酸

9、殘基，分子量約5575kD。根據根據Ig重鏈抗原性的差異，重鏈抗原性的差異，Ig可分為五類可分為五類即即 IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，相應相應H鏈為鏈為、 、 、 及及 鏈。鏈。五種免疫球蛋白結構示意圖五種免疫球蛋白結構示意圖抗體與抗原的結合力抗體與抗原的結合力非極性非極性作用作用氫鍵力氫鍵力作用作用庫侖力作庫侖力作用用分子間吸分子間吸引力引力立體排立體排斥力斥力通過通過 -NH2 -OH 作作用用通過非通過非極性側極性側鏈作用鏈作用通過兩通過兩側鏈相側鏈相反電荷反電荷吸引吸引通過范通過范德華力德華力作用作用通過結通過結合部電合部電子云互子云互補補抗原抗原-抗體結合抗體結合力的主要

10、貢獻力的主要貢獻者者抗體識別抗體識別抗原分子抗原分子的基礎的基礎免疫光化學傳感器響應免疫光化學傳感器響應免疫光化學傳感器響應特點：與熱力學平衡有關免疫光化學傳感器響應特點：與熱力學平衡有關免疫光化學傳感器響應免疫光化學傳感器響應抗原抗體抗原抗體檢測檢測無需標記：抗原無需標記：抗原-抗體結合前后會引起體系熒光抗體結合前后會引起體系熒光強度或偏振程度的變化而直接被檢測。強度或偏振程度的變化而直接被檢測。需標記：無光學性質變化，進行熒光標記。需標記：無光學性質變化，進行熒光標記?；蚧蚪档涂乖档涂乖? -抗體結合力提高光化學傳感器的可逆性抗體結合力提高光化學傳感器的可逆性措施措施1.1.減少主體溶劑

11、極性降低抗體抗原之間的疏水減少主體溶劑極性降低抗體抗原之間的疏水相互作用從而降低抗原與抗體結合力相互作用從而降低抗原與抗體結合力(消極，因消極，因為：結合力發(fā)、靈敏度下降為：結合力發(fā)、靈敏度下降)2.2.通過改變測量溫度降低結合力的方法通過改變測量溫度降低結合力的方法(消極消極)3.3.通過緩釋技術，或競爭結合原理可以作成可逆通過緩釋技術，或競爭結合原理可以作成可逆響應的光化學傳感器響應的光化學傳感器(積極積極)第七章第七章 生物修飾傳感器生物修飾傳感器第一節(jié)第一節(jié) 識別原理識別原理第二節(jié)第二節(jié) 基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)第三節(jié) 基于化學修飾

12、傳感器的酶催化傳感器基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)第四節(jié) 基于簡單免疫體系的光化學傳感器基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)第五節(jié) 基于競爭免疫體系的光化學傳感器基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)第六節(jié) 核酸生物修飾傳感器核酸生物修飾傳感器第二節(jié)第二節(jié) 基于普通光學波導傳感器基于普通光學波導傳感器 的酶催化傳感器的酶催化傳感器概念：當酶催化反應直接產生或消耗可供光學檢測的概念：當酶催化反應直接產生或消耗可供光學檢測的物質時，可將相應的酶固定于普通光學波導傳感器物質時，可將相應的酶固定于普通光學波導傳感器的探頭上，構成酶催化傳感器。的探頭上，構成酶催化傳感器。第二節(jié)第二節(jié) 基于普通光學

13、波導傳感器基于普通光學波導傳感器 的酶催化傳感器的酶催化傳感器類型類型(根據檢測信號分根據檢測信號分)紫外吸收紫外吸收熒光熒光(NADH體系體系 )化學發(fā)光化學發(fā)光(Luminol)探測光纖探測光纖信號光纖信號光纖尼龍網尼龍網堿性磷酸脂酶堿性磷酸脂酶+ONO-O-+OO-OOHPH404nm樣品樣品HOH+酶酶鎢燈鎢燈例：基于堿性磷酸酯酶的普通光化學傳感器例：基于堿性磷酸酯酶的普通光化學傳感器基于基于紫外吸收紫外吸收信號檢測的酶催化傳感器信號檢測的酶催化傳感器對對- -硝基苯基磷酸鹽硝基苯基磷酸鹽對對- -硝基酚硝基酚濾光片濾光片404.7nmPMT公共端公共端Anal. Chem. 1985

14、,57,565基于熒光信號檢測的酶催化傳感器基于熒光信號檢測的酶催化傳感器基本上是與輔酶基本上是與輔酶 I( 煙酰胺煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸，腺嘌呤二核苷酸， NAD) 參加的反參加的反應聯(lián)系在一起應聯(lián)系在一起NAD結構式結構式關于輔酶關于輔酶 I I分子生物學意義：是參與生命體中能量代謝過程的重要物分子生物學意義：是參與生命體中能量代謝過程的重要物質，在反應中主要起遞氫作用。質，在反應中主要起遞氫作用。輔酶輔酶I類型類型還原型還原型(NADH)：熒光較強：熒光較強 l lEx = 360nm, l lEM = 460nm氧化型氧化型(NAD)：無熒光：無熒光分析對象固定化酶催化反應文獻乳酸、丙

15、酮酸鹵酸脫氫酶乳酸+NAD丙酮+NADH7，8葡萄糖葡萄糖脫氫酶葡萄糖+ NAD葡萄糖酸內酯+NADH9膽酸羥基類固醇脫氫酶3-羥基膽酸+NAD膽酸酮+DADH10乙醇醇脫氫酶乙醇+ NAD乙醛+NADH7，11蘋果酸、草酸鹽蘋果酸脫氫酶蘋果酸+ NAD草酸鹽+NADH12甘油-3-磷酸葡糖-6-磷酸-脫氫酶甘油-3-磷酸+ NAD6-磷酸葡萄糖酸內酯+NADH123-羥基-丁酸3-羥基-丁酸脫氫酶3-羥基-丁酸+ NAD乙酰乙酸+NADH12輔酶I醇脫氫酶乙醇+ NAD乙醛+NADH12睪酮雄（甾）酮羥基類固醇脫氫酶睪酮雄（甾）酮+ NAD類固醇+NADH12表表7-3 7-3 檢測檢測NA

16、DHNADH熒光的脫氫酶催化傳感器熒光的脫氫酶催化傳感器與與NADHNADH生成反應耦合生成反應耦合NOO-OONOO-ONADHNAD +心肌黃酶心肌黃酶n與與NADH反應產生更強熒光產物反應產生更強熒光產物刃天青刃天青(無無熒光熒光)9-羥基異吩羥基異吩噁噁唑唑 (強熒光強熒光)靈敏度提高靈敏度提高2倍倍2. 與與NADH反應產生紫外可見吸收反應產生紫外可見吸收NADHNAD +噻唑藍噻唑藍紫色甲紫色甲臜臜 強吸收強吸收l lmax=558nm 心肌黃酶心肌黃酶硫胺素硫胺素 + H H2 2O O2 2HRP基于其它熒光體系的酶催化傳感器基于其它熒光體系的酶催化傳感器基于辣根過氧化酶基于辣

17、根過氧化酶(HRP)(HRP)催化硫胺催化硫胺素的素的H H2 2O O2 2熒光傳感器：熒光傳感器：HRP結構示意圖結構示意圖意義：是繼酶催化意義：是繼酶催化NADH熒光傳感器之后另一種非常有意義的酶催熒光傳感器之后另一種非常有意義的酶催化熒光傳感器化熒光傳感器n檢測檢測H H2 2O O2 2本身；本身；n可檢測在酶催化反應中生成可檢測在酶催化反應中生成H H2 2O O2 2的生物活性物質的生物活性物質( (底物底物) )硫胺熒硫胺熒(強熒光強熒光) + 二硫化硫胺素二硫化硫胺素(無熒光無熒光)基于化學或生物發(fā)光信號檢測的酶催化傳感器基于化學或生物發(fā)光信號檢測的酶催化傳感器該傳感器的顯著

18、特點：體系只需要通過光學波導器件收集信號光，該傳感器的顯著特點：體系只需要通過光學波導器件收集信號光，可直接將生物催化層修飾在光電檢測器上。可直接將生物催化層修飾在光電檢測器上。基于化學或生物基于化學或生物發(fā)光的酶催化反發(fā)光的酶催化反應體系應體系n魯米諾魯米諾(Luminol)+H(Luminol)+H2 2O O2 2化學發(fā)光體系化學發(fā)光體系( (最經典最經典) )nATP-ATP-熒光素熒光素-O-O2 2- -熒光素酶生物發(fā)光體系熒光素酶生物發(fā)光體系nNADH-NADH-黃素單核苷酸黃素單核苷酸(FMN)-(FMN)-氧化還原酶氧化還原酶-O-O2 2- -熒光素熒光素酶生物分化發(fā)光體系

19、酶生物分化發(fā)光體系魯米諾魯米諾(Luminol)+H(Luminol)+H2 2O O2 2化學發(fā)光體系化學發(fā)光體系許多氧化酶催化的反應伴隨有許多氧化酶催化的反應伴隨有H H2 2O O2 2產生，產生，將氧化酶與過氧化酶固定將氧化酶與過氧化酶固定在一起可建立靈敏的化學發(fā)光酶催化傳感器，用于檢測底物，在一起可建立靈敏的化學發(fā)光酶催化傳感器，用于檢測底物，如：如：尿酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、膽固醇、胺類、丙酮酸等。尿酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、膽固醇、胺類、丙酮酸等。ATP-ATP-熒光素熒光素-O-O2 2- -熒光素酶生物發(fā)光體系熒光素酶生物發(fā)光體系ATP + ATP + 熒光素熒光素 + O

20、+ O2 2 AMP + AMP + 氧化熒光素氧化熒光素 + PPi + CO+ PPi + CO2 2熒光素酶熒光素酶 hn n (l lmax= =560 nm560 nm)應用：應用：n檢測檢測ATPATP， DL=10DL=10-10-10 molL molL-1-1n其它有其它有ATPATP參與的代謝過程所涉及的反應物參與的代謝過程所涉及的反應物由由BlumBlum等人提出等人提出( (Anal. Chim. Acta, 1989, 227, 387) NADH-NADH-黃素單核苷酸黃素單核苷酸(FMN)-(FMN)-氧化還原酶氧化還原酶-O-O2 2- -熒光素酶熒光素酶生物催

21、化發(fā)光體系生物催化發(fā)光體系NADH + H+ + FMNNAD + FMNH2氧化還原酶氧化還原酶FMNH2 + RCHO + O2FMN + RCOOH + H2O熒光素酶熒光素酶hn n(l lmax = 490nm)應用應用n測定輔酶測定輔酶I(NADH)： C. Haggerty et. al., Anal. Biochem., 88, 162 (1978)n檢測其它底物：與相應底物脫氫酶耦合后，參與遞氫檢測其它底物：與相應底物脫氫酶耦合后，參與遞氫作用的輔酶作用的輔酶I起指示物質的作用起指示物質的作用L.J. Blum et. al., Anal. Lett., 21, 717(19

22、88)第七章第七章 生物修飾傳感器生物修飾傳感器第一節(jié)第一節(jié) 識別原理識別原理第二節(jié)第二節(jié) 基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)第三節(jié) 基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)第四節(jié) 基于簡單免疫體系的光化學傳感器基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)第五節(jié) 基于競爭免疫體系的光化學傳感器基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)第六節(jié) 核酸生物修飾傳感器核酸生物修飾傳感器第三節(jié)第三節(jié) 基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器技術產生背景技術產生背景 有些酶催化的反應不產生或不消耗可直接光學檢測的有些酶催化

23、的反應不產生或不消耗可直接光學檢測的物質，但涉及質子的產生與消耗、氧氣的產生與消耗、物質，但涉及質子的產生與消耗、氧氣的產生與消耗、酸性或堿性氣體酸性或堿性氣體(CO2或或NH3)產生與消耗。這些物質很容產生與消耗。這些物質很容易被化學修飾光化學傳感器所檢測，故可采用相應化學修易被化學修飾光化學傳感器所檢測，故可采用相應化學修飾光化學傳感器作內傳感器構建酶催化傳感器。飾光化學傳感器作內傳感器構建酶催化傳感器。常用的內傳感器種類常用的內傳感器種類n氧光化學傳感器為內傳感器；氧光化學傳感器為內傳感器；nCO2光化學傳感器為內傳感器；光化學傳感器為內傳感器；nNH3光化學傳感器為內傳感器。光化學傳感

24、器為內傳感器。氧光化學傳感器氧光化學傳感器為基礎光極的酶催化傳感器為基礎光極的酶催化傳感器傳感器的結構與原理：傳感器的結構與原理：以測量葡萄糖為例以測量葡萄糖為例葡萄糖葡萄糖樣品樣品光學波導光學波導O2 敏感熒光試劑敏感熒光試劑葡萄糖葡萄糖葡萄糖酸葡萄糖酸氧化酶氧化酶葡萄糖酸葡萄糖酸O2O2O2氣透膜氣透膜生物催化層生物催化層探測光探測光激發(fā)激發(fā)信號光信號光發(fā)射發(fā)射尼龍網尼龍網+圖圖7-5 7-5 氧光化學傳感器為基礎光極的葡萄糖生物傳感器氧光化學傳感器為基礎光極的葡萄糖生物傳感器內內傳傳感感器器氧氧光光學學傳傳感感器器傳感器的特性傳感器的特性n樣品中葡萄的濃度越大，傳感器的熒光強度信號樣品中

25、葡萄的濃度越大，傳感器的熒光強度信號越大；越大；n檢測范圍檢測范圍0.1 20 mmol/L；n響應時間幾分鐘之內。響應時間幾分鐘之內。氨氣酶光極氨氣酶光極傳感器為基礎傳感器的酶傳感器為基礎傳感器的酶催化傳感器催化傳感器傳感器的結構與原理：傳感器的結構與原理：以測量尿素為例以測量尿素為例NH2CONH2(尿素尿素) + H2O2NH3 + CO2脲酶脲酶底物底物樣品樣品光學波導光學波導底物底物NH3脫氨酶脫氨酶NH3氣透膜氣透膜生物催化層生物催化層探測光探測光信號光信號光圖圖7-6 7-6 以氨氣酶光極為基礎傳感器的酶催化傳感器以氨氣酶光極為基礎傳感器的酶催化傳感器內內傳傳感感器器氨氨氣氣敏敏

26、光光極極NH3酶支持膜酶支持膜HINDH+IND-+NH4+H+化學修飾層化學修飾層厚度(m)傳感器的特性傳感器的特性n尿素的濃度越大，產生的尿素的濃度越大，產生的NH3氣氣越多，使內感器越多，使內感器的吸收或熒光信號變化越明顯；的吸收或熒光信號變化越明顯；n檢測范圍檢測范圍510-5 110-2 mol/L ，DL= 510-5 mol/L；n響應時間約響應時間約7分鐘。分鐘。第七章第七章 生物修飾傳感器生物修飾傳感器第一節(jié)第一節(jié) 識別原理識別原理第二節(jié)第二節(jié) 基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)第三節(jié) 基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器基于化學修飾傳

27、感器的酶催化傳感器第四節(jié)第四節(jié) 基于簡單免疫體系的光化學傳感器基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)第五節(jié) 基于競爭免疫體系的光化學傳感器基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)第六節(jié) 核酸生物修飾傳感器核酸生物修飾傳感器第四節(jié)第四節(jié) 基于簡單免疫體系的光化學傳感器基于簡單免疫體系的光化學傳感器1. 體系體系:一一對應的免疫體系；一一對應的免疫體系；適用范圍適用范圍2. 抗原抗體要有熒光活性：抗原抗體要有熒光活性：n有內源熒光的抗體（或抗原）：許多抗體或抗原的有內源熒光的抗體（或抗原）：許多抗體或抗原的多肽鏈含有熒光活性的氨基酸殘基礎，如：苯丙氨多肽鏈含有熒光活性的氨基酸殘基礎，如：苯丙氨酸、酪氨酸

28、和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。n熒光標記后的抗體（或抗原）熒光標記后的抗體（或抗原）對標記物的要求：對標記物的要求： (1) 穩(wěn)定；穩(wěn)定；(2)熒光發(fā)射光譜與背景熒光有明顯差別；熒光發(fā)射光譜與背景熒光有明顯差別；(3)高熒光量子產率；高熒光量子產率；(4)大的大的Stokes位移；位移；(5)有合適的與抗原或抗體連接的法；有合適的與抗原或抗體連接的法；(6)不影響抗原不影響抗原-抗體結合反應?？贵w結合反應。 主要基于抗原主要基于抗原-抗體作用前后熒光強度的變化：抗體作用前后熒光強度的變化：n非輻射熒光能量轉移：熒光熄滅非輻射熒光能量轉移：熒光熄滅 例：半抗原例：半抗原2,4-二硝基苯二硝基苯(

29、DNP)DNP-賴氨酸賴氨酸 + 抗體抗體 DNP-賴氨酸賴氨酸 /抗體抗體 (有熒光活性有熒光活性) (無熒光活性無熒光活性)簡單免疫熒光分析原理簡單免疫熒光分析原理n輻射熒光能量轉移：熒光增強輻射熒光能量轉移：熒光增強例：二甲氨基萘例：二甲氨基萘-5-磺?；酋?DANS)DANS-賴氨酸賴氨酸 + 抗體抗體 DANS-賴氨酸賴氨酸 /抗體抗體 (有熒光活性有熒光活性) (強熒光活性強熒光活性)熒光強度增加熒光強度增加25-30倍倍n抗原抗體結合前后微環(huán)境變化引起熒光增強度變化抗原抗體結合前后微環(huán)境變化引起熒光增強度變化構建基于簡單免疫體系的光化學傳感器構建基于簡單免疫體系的光化學傳感器1.

30、 采用熒光標記物的簡單免疫體系構造光化學傳感采用熒光標記物的簡單免疫體系構造光化學傳感F.V. Bright et al., Anal. Chem., 62, 1065(1990)光纖光纖端部端部HSA：人血清白蛋白人血清白蛋白Fab：抗人血清白蛋白抗抗人血清白蛋白抗體碎片體碎片熒光試劑熒光試劑：丹酰氯：丹酰氯Fab 與與HSA結合后使熒光標記物的結合后使熒光標記物的微環(huán)境改變，熒光增強微環(huán)境改變，熒光增強KSCN溶液能將溶液能將Fab 與與HSA分開，從而使傳感器再生。分開，從而使傳感器再生。2. 酶聯(lián)免疫光化學傳感酶聯(lián)免疫光化學傳感T. Vo-Dinh et al., Appl. Spec

31、trosc., 40,696(1986)非熒光物質：與磷酸根相結合的非熒光物質：與磷酸根相結合的4-甲基傘形酮甲基傘形酮與抗體結合的酶：堿性磷酸酯酶與抗體結合的酶：堿性磷酸酯酶酶催化分解產物：酶催化分解產物： 4-甲基傘形酮酶，強熒光活性甲基傘形酮酶，強熒光活性EEEEEEEE激發(fā)激發(fā)發(fā)射發(fā)射酶催化反應酶催化反應固定在池壁上的待測抗原固定在池壁上的待測抗原非熒光酶底物非熒光酶底物E酶聯(lián)抗體酶聯(lián)抗體酶催化產生的熒光活性物質酶催化產生的熒光活性物質激發(fā)態(tài)的熒光活性物質激發(fā)態(tài)的熒光活性物質圖圖7-9 7-9 酶聯(lián)免疫熒光傳感器原理示意圖酶聯(lián)免疫熒光傳感器原理示意圖定量分析的依據：定量分析的依據：樣品

32、中抗原濃度越大，結合酶聯(lián)抗體就越多，催化樣品中抗原濃度越大，結合酶聯(lián)抗體就越多，催化水解產生的游離水解產生的游離4-甲基傘形酮越多，強熒光強度越強甲基傘形酮越多，強熒光強度越強。第七章第七章 生物修飾傳感器生物修飾傳感器第一節(jié)第一節(jié) 識別原理識別原理第二節(jié)第二節(jié) 基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器基于普通光學波導傳感器的酶催化傳感器第三節(jié)第三節(jié) 基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器基于化學修飾傳感器的酶催化傳感器第四節(jié)第四節(jié) 基于簡單免疫體系的光化學傳感器基于簡單免疫體系的光化學傳感器第五節(jié)第五節(jié) 基于競爭免疫體系的光化學傳感器基于競爭免疫體系的光化學傳感器第六節(jié)第六節(jié) 核酸生物修飾傳感器核酸生

33、物修飾傳感器第五節(jié)第五節(jié) 基于競爭免疫體系的光化學傳感器基于競爭免疫體系的光化學傳感器原理：原理：Optode-Ag + Ab* + Ab Optode-Ag-Ab* + Optode-Ag-Ab Optode-Ab + Ag* + Ag Optode-Ab-Ag* + Optode-Ab-Ag 或或樣品中待測樣品中待測Ag (或或Ab)越多，結合到光極探頭上的標記越多，結合到光極探頭上的標記物抗原物抗原Ag*(或標記抗體或標記抗體Ab*)越少，傳感器的熒光強度越越少，傳感器的熒光強度越低。低。有可逆響應的葡萄糖免疫光化學傳感器有可逆響應的葡萄糖免疫光化學傳感器J.S. Schultz et al., Diabetes Care, 5, 245 (1982)n第一個真正有可逆響應的免疫光化學傳感器。第一個真正有可逆響應的免疫光化學傳感器。n所有基于熒光標記競爭的免疫體系均可以按此設計思想所有基于熒光標記競爭的免疫體系均可以按此設計思想制成有可逆響應的光化學傳感器。