1、CRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)基因系統(tǒng)基因修飾技術(shù)修飾技術(shù)1 CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大學(xué)（年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對(duì)一種細(xì)菌）在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。u2

2、013以后，研究者們?cè)诎ㄒ院?，研究者們?cè)诎╯cience和和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。的基因修飾。1 CRISPR-Cas概述概述CRISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。CRISPR-Cas主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：識(shí)別識(shí)別切割切割1 CRISPR-Cas概述

3、概述1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個(gè)特殊的是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族, 廣泛分布于廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列的重復(fù)序列(repeats) 組成組成, 重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被重復(fù)序列之間被 2672 bp 間隔序列間隔序列(spacer)隔開。隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（就是通過

4、這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對(duì)入侵的

5、病毒和核酸進(jìn)行通過對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性特異性的識(shí)別，利用的識(shí)別，利用Cas蛋白進(jìn)蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源DNA特異性免特異性免疫疫, 而這種特異性是由間隔序列（而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對(duì)自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌防御噬菌體攻擊中，針對(duì)自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了進(jìn)化了C

6、RISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由由CRISPR 間隔序列的動(dòng)態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔間隔序列的動(dòng)態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔序列（序列（spacer）來實(shí)現(xiàn)的。）來實(shí)現(xiàn)的。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求 在人類基因組中，平均每在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)就出現(xiàn)一個(gè)NGG PAM。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求3 CRISPR-Cas系

7、統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來達(dá)到基因的定向模板替換的相應(yīng)基因來達(dá)到基因的定向修飾。修飾。3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾 201

8、3年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對(duì)斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。內(nèi)源性核酸酶對(duì)斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾Cas9sg-RNA 2013年年2月月15日在日在science上發(fā)表的上

9、發(fā)表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文一文中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的spacers的的crRNA實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有可能獲得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)?？赡塬@得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)。4 CRISPR-Ca

10、s系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上發(fā)表的上發(fā)表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者一文中，作者利用利用TALENs和和CRISPRs對(duì)同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為對(duì)同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來說，而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比比TALENs更更容

11、易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替換只需要替換20個(gè)核苷酸就行。個(gè)核苷酸就行。4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析u 只需合成一個(gè)只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。蛋白不具特異性。u 編碼編碼sgRNA的序列不超過的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZFNs更簡(jiǎn)單方便。更簡(jiǎn)單方便。u 較短的較短的sgRNA序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)的序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)的TALENs編編碼載體帶來的并發(fā)癥。碼載

12、體帶來的并發(fā)癥。技術(shù)優(yōu)勢(shì)1987年，當(dāng)時(shí)有一個(gè)科研小組觀察到，在細(xì)菌編碼的一個(gè)基因末端有一段非常奇怪的重復(fù)序列。越來越多的生物學(xué)家們開始從事微生物基因組的解析工作，這時(shí)他們也都發(fā)現(xiàn)了這種奇怪的現(xiàn)象在大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌（archaea）中都能夠觀察到這種現(xiàn)象，于是科學(xué)家們給這種序列取了一個(gè)名字，叫作CRISPR，即成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。在2005年，有3個(gè)生物信息學(xué)課題組報(bào)道稱，這些 CRISPR序列里的空格DNA總是能夠與噬菌體的 DNA序列互補(bǔ)、匹配

13、美國(guó)馬里蘭州美國(guó)國(guó)家癌癥生物技術(shù)信息中心的Eugene Koonin等人提出了一個(gè)新想法，即細(xì)菌和古細(xì)菌能夠吸收噬菌體的DNA，然后將其留作己用，并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA，與入侵的外源DNA結(jié)合，這有點(diǎn)類似于真核生物采用的RNA干擾（RNA interference, RNAi）機(jī)制。Danisco公司的研究人員 Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath等人在2007年發(fā)現(xiàn)，他們只要對(duì)嗜熱鏈球菌進(jìn)行一番遺傳學(xué)改造，插入或者去掉幾個(gè)與噬菌體序列互補(bǔ)的空格DNA片段，就可以改變細(xì)菌對(duì)噬菌體的免疫力。發(fā)現(xiàn)歷史Doudna和Emmanuelle Charpentier則分別把

14、工作往前推進(jìn)了一步,依賴Cas9蛋白的CRISPR系統(tǒng)要比其它 CRISPR系統(tǒng)更簡(jiǎn)單。Doudna和Charpentier的課題組都必須證明，他們能夠非常精確地控制Cas9蛋白的切割位點(diǎn)，確保不會(huì)發(fā)生脫靶的情況。Doudna的博士后Martin Jinek提出了將tracrRNA和空格 RNA組合起來，形成一個(gè)所謂的“向?qū)NA分子（single-guide RNA）”的想法，并且他們課題組已經(jīng)在去年成功地構(gòu)建出了好幾個(gè)這種向?qū)NA，而且將其與Cas9蛋白混合在一起，成功地對(duì)特定的DNA位點(diǎn)進(jìn)行了切割（Science , 17 August 2012, p. 816）。十年前，科學(xué)家們開發(fā)出了鋅指核酸酶（zinc finger nucleases），該蛋白擁有兩個(gè)人工組合在一起的結(jié)構(gòu)域，它可以依靠其中的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domains）結(jié)合到基因組中特定的位點(diǎn)上，然后再依靠其中的酶切結(jié)構(gòu)域?qū)⒃撐稽c(diǎn)的DNA鏈切斷。該技術(shù)誕生之后也掀起了一股熱潮，甚至有人成立了公司，專門以該技術(shù)為平臺(tái)開發(fā)艾滋病治療手段（Science , 23 December 2005，p. 1894）。鋅指核酸酶最近又出現(xiàn)了另外一種基因組改造工具，那就是TALEN人工核