1、聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應及點突變的檢測方法及點突變的檢測方法上海交通大學醫(yī)學院上海交通大學醫(yī)學院劉湘帆講師劉湘帆講師 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應于于1983年由美國年由美國Cetus公司的公司的K.Mullis建立建立，并，并和定點突變的發(fā)明者和定點突變的發(fā)明者M.SmithM.Smith一起榮獲一起榮獲19931993年度諾貝爾化學獎，年度諾貝爾化學獎，為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。 特異性強特異性強 引物與模板結合的特異性及聚合酶的忠實性引物與模板結合的特異性及聚合酶的忠實性 靈敏度高靈敏度高 指數增長指數增長，從從pg (10-12)可擴增

2、至可擴增至 m mg (10-6)水平水平 簡便、快速簡便、快速 24 小時完成擴增小時完成擴增 對標本的純度要求低對標本的純度要求低 DNA 粗制品及總粗制品及總RNA均可作為擴增模板均可作為擴增模板 DNA的體外復制包括的體外復制包括3個步驟：個步驟： 變性（變性（denaturation）:94 C 95 C 退火（退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（延伸（extension）:72 C 3個步驟作為個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當完成一的一個循環(huán)，每當完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復制為二個，個循環(huán)，一個分子的模板被復制為二個，產物量以指數形式增長。產物量以指數形式增

3、長。PCR原理原理5533d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5353535353535353添加反應混合液添加反應混合液及樣本及樣本變性變性535353535353退火退火加入試管中加入試管中延伸延伸53535353繼續(xù)延伸繼續(xù)延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循環(huán)循環(huán)PCR原理原理5353535355335353第二個循環(huán)第二個循環(huán)4個拷貝個拷貝第三個循環(huán)第三個循環(huán)8個拷貝個拷貝53535353535353535353533553535353第第n個循環(huán)個循環(huán)2n個拷貝個拷貝PCR原理原理94 C(30 s)40-60 C(30 s)72 C(30-60 s/kb)MeltAn

4、nealExtendThe Polymerase Chain Reaction (PCR)1820-30X94 C(30 s)40-60 C(30 s)72 C(30-60 s/kb)MeltAnnealExtendCycle #2NIH20-30XPCR演示文件演示文件（一）PCR反應體系參與PCR反應的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。 包括基因組包括基因組DNA、RNA、質粒質粒DNA、線粒體線粒體DNA等等 模板模板DNA需較高的濃度需較高的濃度 RNA作為模板時，須先將作為模板時，須先將RNA逆轉錄為逆轉錄為cDNA，再以再以 cDNA作為作為擴增的模板

5、擴增的模板 模板量：模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng 引物決定引物決定PCR擴增產物的特異性和長度，擴增產物的特異性和長度，是化學合成的寡核苷酸片段是化學合成的寡核苷酸片段 化學合成的寡核苷酸化學合成的寡核苷酸 能與模板特異地結合能與模板特異地結合 引物決定產物的特異性和長度引物決定產物的特異性和長度 引物設計引物設計時必須遵循一些原則時必須遵循一些原則 二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負鏈序列互補鏈序列互補 長度為長度為18 25個核苷酸個核苷酸 二條引物之間避免形成引物二聚體二條引物之間避免形成引物二聚體 引物的堿

6、基組成應平衡引物的堿基組成應平衡 引物退火溫度計算：引物退火溫度計算：Tm=2（A+T）+4（C+G） 引物的引物的5端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）點、生物素等標記）引物濃度：引物濃度：0.1 0.2umol/L,濃度過高容易生成引物二聚體濃度過高容易生成引物二聚體 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧 核苷三磷酸的混合物 反應體系中各種核苷酸的濃度必須一致 濃度過高雖能加快反應速度，但非特異 性擴增也隨之增加 dNTP濃度：濃度：20 200umol/L,濃度升高增加非特異性擴增濃度升高增加非特異性擴增 從一種生活在熱泉

7、（從一種生活在熱泉（8090）中的水棲）中的水棲 噬熱菌（噬熱菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，中提取， 有很高的耐熱穩(wěn)定性有很高的耐熱穩(wěn)定性 Taq 酶的作用酶的作用: 模板指導下，以模板指導下，以dNTP為原料，在引物為原料，在引物3-OH末端末端加上脫氧單核苷酸，形成加上脫氧單核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯鍵，使磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿鏈沿53方向延伸，催化方向延伸，催化DNA合成。合成。 最適酶量：最適酶量：1-2.5U （酶量過多，導致非特異性擴增）酶量過多，導致非特異性擴增） Taq DNA聚合酶復制的保真性：聚合酶復制的保真性： Taq DNA聚合酶無聚

8、合酶無3 5外切酶活性，因外切酶活性，因而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發(fā)生而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配。堿基錯配。 Taq DNA聚合酶在每次循環(huán)中產生的移碼突聚合酶在每次循環(huán)中產生的移碼突變率為變率為1/30000，堿基替換率為，堿基替換率為1/8000，故擴，故擴增的片段越長，錯配的機率越高。增的片段越長，錯配的機率越高。 耐熱的耐熱的 DNA多聚酶：多聚酶： Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，較高具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿基錯配率的保真性，降低堿基錯配率2

9、 10倍。倍。 鎂離子濃度是一個至為關鍵的因素，對于反應鎂離子濃度是一個至為關鍵的因素，對于反應 系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直酶的活性有直接影響接影響 雖然雖然Taq 酶的活性只與游離的酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關，濃度有關， 但但PCR反應體系中反應體系中dNTP、引物、模板引物、模板DNA及及 鰲合劑的存在均可與鰲合劑的存在均可與Mg2+結合而降低游離結合而降低游離 Mg2+的濃度從而影響酶的活性。的濃度從而影響酶的活性。 當當dNTP濃度為濃度為200umol/L時，時，MgCl2的濃度為的濃度為1.5mmol/L較宜。較宜。 pH：調節(jié)

10、至酶反應所需的最適調節(jié)至酶反應所需的最適pH（ pH =7.2左右左右） 鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交與模板雜交 基質：基質：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（等（牛血清牛血清白蛋白或明膠等基質可以保護白蛋白或明膠等基質可以保護Taq 酶的活性）酶的活性）反應溫度（變性、退火、延伸）反應溫度（變性、退火、延伸）反應時間（變性、退火、延伸）反應時間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數（循環(huán)次數（PCR效率及產物量）效率及產物量） 變性溫度：變性溫度：94 94 97 97 退火溫度：低于引物退火溫度：低于引物TmTm

11、 5 5 左右左右 溫度過高：降低擴增效率；溫度過高：降低擴增效率； 溫度過低：增加非特異性擴增溫度過低：增加非特異性擴增 延伸溫度：延伸溫度：7272度，此時度，此時TaqTaq酶具有較高的酶酶具有較高的酶 促活性促活性 第一次變性應給予足夠時間（第一次變性應給予足夠時間（5 7分鐘）分鐘） 每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為一般為30秒秒 1分鐘，時間過長易導致非特分鐘，時間過長易導致非特異性擴增異性擴增 重復次數一般設為重復次數一般設為2535個循環(huán)個循環(huán) 擴增反應的平臺效應：擴增反應的平臺效應： 理論上，理論上，PCR反應產物呈指數性

12、增長，但這種反應產物呈指數性增長，但這種增長形式在擴增增長形式在擴增25-25個循環(huán)以后便放慢直至停個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應平臺，此時擴增產物量不再隨循止，達到反應平臺，此時擴增產物量不再隨循環(huán)次數的增加而呈指數增長環(huán)次數的增加而呈指數增長n指數增長期n線形增長期n平臺期循環(huán)數 # 理論值 實際值Log 產物DNAPCR過程的實時監(jiān)測 平臺出現得遲早與模板的初始量有關，模板平臺出現得遲早與模板的初始量有關，模板初始量越多，平臺出現得越早。初始量越多，平臺出現得越早。 平臺效應產生的因素：平臺效應產生的因素： 引物二聚體的產生、反應產物、各組分的消引物二聚體的產生、反應產物、各組分的消

13、耗和變性、引物和已擴增的耗和變性、引物和已擴增的DNA片段間的競片段間的競爭等爭等（一）實驗室的規(guī)范化設置實驗室的規(guī)范化設置： 試劑貯存和準備區(qū) 標本制備區(qū) 擴增反應區(qū) 產物分析區(qū) PCR技術的質量保證： 基因擴增檢驗的全過程的質量保證 室內質量控制和室間質量評價 PCR實驗系統(tǒng)中的污染源及防污染措施 防污染體系：防污染體系： 正確設置實驗室、嚴格規(guī)范實驗操作、完整正確設置實驗室、嚴格規(guī)范實驗操作、完整有效的去污染措施、反應體系中以有效的去污染措施、反應體系中以dUTP取代取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可即可破壞以往的擴增產物、人員培訓、試劑質量破壞以往的擴增

14、產物、人員培訓、試劑質量（二）（二）PCR技術的質量保證技術的質量保證 分析前因素分析前因素：標本采集、運送、穩(wěn)定化處理、貯存：標本采集、運送、穩(wěn)定化處理、貯存 分析中因素分析中因素：核酸提取、逆轉錄、擴增反應、設置：核酸提取、逆轉錄、擴增反應、設置 對照系統(tǒng)（包括陰性對照、陽性對照、內對照等）對照系統(tǒng)（包括陰性對照、陽性對照、內對照等） 分析后因素分析后因素：報告形式、反饋的信息等：報告形式、反饋的信息等 逆轉錄逆轉錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量定量PCR (quantitative PCR ) 多重多重PCR (multiplex P

15、CR) 免疫免疫PCR 差異顯示差異顯示PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR誘導定點突變誘導定點突變 原位原位PCR (in situ PCR) 以細胞內總以細胞內總RNA或或mRNA為材料進行體外為材料進行體外擴增的技術。擴增的技術。 主要用于克隆主要用于克隆 cDNA、合成合成cDNA探針，探針，檢檢測測RNA病毒、分析基因表達等病毒、分析基因表達等逆轉錄生成逆轉錄生成cDNA方式方式： 以隨機進行的以隨機進行的PCR擴增所需的下游引物作為擴增所需的下游引物作為逆轉錄反應的引物逆轉錄反應的引物 以以oligo(dT)作為引物，作為引物， mR

16、NA3末端末端polyA尾與之互補尾與之互補 以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物作為以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物作為引物，進行擴增引物，進行擴增 對對DNA或或RNA樣本的靶序列進行定量分析。樣本的靶序列進行定量分析。 主要用于基因表達的分析、病原體核酸的檢測等主要用于基因表達的分析、病原體核酸的檢測等 在定量在定量PCR反應體系中，除了常規(guī)反應體系中，除了常規(guī)PCR反應所反應所需的材料和試劑外，還必須引入內參照系統(tǒng)。需的材料和試劑外，還必須引入內參照系統(tǒng)。 內參照系統(tǒng)一般選用與待測序列結構無關的基因內參照系統(tǒng)一般選用與待測序列結構無關的基因常用的內參照基因是常用的內參照基因是 -肌球蛋

17、白基因肌球蛋白基因絕對定量絕對定量 PCR1.外參照系統(tǒng)的設置2.內參照系統(tǒng)的設置 實時定量 PCR 對核酸擴增反應進行直接和動態(tài)的監(jiān)測， 實現對靶基因的實時定量分析 熒光定量熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），），又稱實時又稱實時PCR，是目前較精是目前較精確的進行定量檢測確的進行定量檢測PCR的方法的方法 FQ-PCR通過熒光信號對通過熒光信號對PCR過程中產物量進過程中產物量進行實時監(jiān)測，行實時監(jiān)測，精確計算出精確計算出PCR的初始模板量的初始模板量熒光信號的檢測方法：熒光信號的檢測方法： 1、DNA結合染料技術結合染料技術 2、水

18、解探針技術（、水解探針技術（TaqMan probe）技術技術 3、雜交探針技術、雜交探針技術TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ5353TaqManTMExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationC

19、omplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5l lR53RQ實時定量RT-PCR檢測CEA基因拷貝數在監(jiān)測胃腸癌微轉移中的應用正常成人體內CEA基因表達胃腸癌腫瘤組織中CEA基因的表達胃腸癌患者外周血中CEA基因的表達 在同一反應體系中加入多對引物，同時擴增在同一反應體系中加入多對引物，同時擴增一份一份DNA樣本中多個不同序列的靶片段。樣本中多個不同序列的靶片段。DMD基因外顯子缺失的檢測基因外顯子缺失的檢測 一種以逆轉錄一種以逆轉錄PCR為基礎的研究基因表達為基礎的研究基因表達差異的技術。差異的技術。 DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子主要用于腫瘤和多種疾

20、病的分子遺傳學研究，是目前篩選基因表達差異最遺傳學研究，是目前篩選基因表達差異最有效的方法。有效的方法。 PCR-限制性片段長度多態(tài)性（限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP） 等位基因特異性寡核苷酸等位基因特異性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO） 單鏈構象多態(tài)性（單鏈構象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP） 變性梯度凝膠電泳（變性梯度凝膠電泳（DGGE） 融點曲線分析（融點曲線分析（melting curve analysis） PCR產物的序列分析產物的序列分析 一、 已知點

21、突變的檢測方法 1.PCR-RFLP 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內切酶的酶切位點而設計。若點突變處于某一限制性內切酶的酶切位點內，可在突變點兩側設計引物，使PCR產物含有該突變序列。用相應的內切酶對正常產物和突變產物進行水解并作電泳分離，可根據水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。Bcl I RFLP（血友?。ㄑ巡） 被檢基因經PCR擴增后轉移到膜上，分別與長度為1520bp、經標記的正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。由于20個堿基中僅一個堿基差異即可使DNA分子的Tm值下降 57.5，因此通過嚴格控制雜交條件，可使PCR產物僅與完全互補的探針雜交，根據有無雜交信號即可判斷被檢者的擴增片段中是否帶有突變點。 在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龍膜等）表面有序地陣列一系列固定于一定位置的分子（探針），當標記樣品（如用化學熒光法、化學發(fā)光法標記）與探針進行雜交后，用共聚焦熒光自動掃描等技術獲取信息，經計算機系統(tǒng)處理、分析后得到結果。s4. Southern印跡雜交印跡雜交1. 單鏈構象多態(tài)性（單鏈構象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突變DNA的PCR產物經變性后產生兩條與正常 DNA構