1、定量PCR技術(shù)與產(chǎn)品2004.8.13背景知識(shí) I5353SGSGSGSGSGExcitationEmission 的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 使用方便 -不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物 沒(méi)有序列特異性 -可以用于不同的模板 便宜 靈敏 的缺點(diǎn)的缺點(diǎn) 特異性差，會(huì)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合 RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標(biāo)記探針（雙標(biāo)記探針（Taqman Probe） 基基 因因 有有 限限 公公 司司Gene Company LimitedGene Company Limited 基基 因因 有有 限限 公公 司司Gene Company LimitedGene Company

2、Limited的應(yīng)用的應(yīng)用 定量起始模板濃度 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP分析 基基 因因 有有 限限 公公 司司Gene Company LimitedGene Company Limited 的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測(cè) 與Molecular Beacons 相比設(shè)計(jì)相 對(duì)簡(jiǎn)單 的缺點(diǎn)的缺點(diǎn) 價(jià)格較高 只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析 RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)分子信標(biāo)（Molecular Beacon Probe） 基基 因因 有有 限限 公公 司司Gene Company LimitedGe

3、ne Company Limited的應(yīng)用的應(yīng)用定量起始模板濃度 基因型分析 鑒定產(chǎn)物 單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè) 基基 因因 有有 限限 公公 司司Gene Company LimitedGene Company Limited的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 用于SNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一 熒光背景低 的缺點(diǎn)的缺點(diǎn) 設(shè)計(jì)困難 無(wú)終點(diǎn)分析功能 只能用于一個(gè)特定的目標(biāo) 價(jià)格較高 Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（熒光共振能量傳遞（FRET Probe） 基基 因因 有有 限

4、限 公公 司司Gene Company LimitedGene Company Limited相關(guān)知識(shí)什么是MGB探針MGB：確保了探針的高度特異性：確保了探針的高度特異性Superbase：保證了探針與引物：保證了探針與引物結(jié)合的穩(wěn)定性結(jié)合的穩(wěn)定性MGB探針的優(yōu)點(diǎn) 提高提高TmTm 探針更短探針更短 提高配對(duì)與非配對(duì)模板間提高配對(duì)與非配對(duì)模板間TmTm的差異的差異 提高信噪比提高信噪比 淬滅基團(tuán)為無(wú)熒光基團(tuán)淬滅基團(tuán)為無(wú)熒光基團(tuán), , 與與reporterreporter基團(tuán)空間距離基團(tuán)空間距離 更近更近, ,有更好的淬滅效果有更好的淬滅效果 使雜交的穩(wěn)定性增加使雜交的穩(wěn)定性增加如何防止模板污

5、染模板污染primerprimer特異性條帶非特異性條帶污染UUUU模板UNG酶+primerprimerdAdTdGdCU特異性條帶UUUUUUUUUUUUUUUU相關(guān)廠家 Artus: 成套試劑盒 QIAGEN-Operon: 合成定量引物，探針 Biosearch: 合成定量引物，探針 QIAGEN: 預(yù)合成的探針引物 QIAGEN: 定量PCR試劑盒，（探針?lè)?，染料法?Epicentre: 定量PCR試劑盒， （染料法） Clontech: 定量PCR試劑盒，(探針?lè)? Abgene: 定量PCR試劑盒，（探針?lè)?，染料法）Artus探針合成 QIAGEN OPERON BioSear

6、ch 客戶給出序列，我們合成，不提供設(shè)計(jì)服務(wù)。預(yù)合成的探針引物 QIAGEN - MGB探針23.53RMB/run試劑盒 QIAGEN: 定量PCR試劑盒，（探針?lè)?，染料法?Epicentre: 定量PCR試劑盒， （染料法） Clontech: 定量PCR試劑盒，(探針?lè)? Abgene: 定量PCR試劑盒，（探針?lè)?，染料法）QIAGEN QuantiTect SYBR Green PCR/RT-PCR Kit 29.86 RMB / run QuantiTect Probe PCR /RT-PCR Kit 37.45 RMB / run 不包含UNG酶/ 包含ROX/ 熱啟動(dòng)酶，（化學(xué)

7、修飾型）/含 dUTP 優(yōu)點(diǎn)： 特異性好，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，無(wú)需優(yōu)化QIAGEN QuantiTect Multiplex PCR Kit多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。 節(jié)約成本- 節(jié)省試劑，節(jié)省樣本，節(jié)省時(shí)間。 提高精度- 避免加樣誤差和反應(yīng)間誤差。 無(wú)需優(yōu)化無(wú)需優(yōu)化 試劑和操作步驟都經(jīng)過(guò)了預(yù)先優(yōu)化 高靈敏度高靈敏度 可檢測(cè)到10copy的目標(biāo)序列 定量準(zhǔn)確可靠定量準(zhǔn)確可靠 目標(biāo)基因和參照基因在一個(gè)反映體系中擴(kuò)增，消除了加樣誤差和反應(yīng)間誤差導(dǎo)致的結(jié)果誤差 操作簡(jiǎn)單操作簡(jiǎn)單 預(yù)制好的master mixes可以和各種定量PCR以配套使用 QI

8、AGEN QuantiTect Multiplex PCR KitQuantiTect Multiplex PCR Kit可以在一個(gè)反應(yīng)中對(duì)最多四個(gè)基因進(jìn)行定量分析，采用專利的MP因子，可以增加模板附近的引物的局部濃度。QIAGEN QuantiTect Multiplex PCR Kit應(yīng)用： 基因表達(dá)研究 基因型分析- GMO. 微生物鑒定 芯片，RNAi后期驗(yàn)證試劑盒里面帶有ROX,最多作3個(gè)基因204543（200） - RMB8,855 204545 （1000） - RMB35,395Cost: 35.4-44.3RMB/Run -如果一次做如果一次做3個(gè)個(gè)基因基因, 則每個(gè)基因只

9、需則每個(gè)基因只需11.8-14.8RMB QIAGEN QuantiTect Multiplex PCR Kit競(jìng)爭(zhēng)競(jìng)爭(zhēng) Homemade :效果差,需要許多的優(yōu)化工作. Stratagene :brilliant multiplex qPCR master mix專為 Mx3000，MX4000設(shè)計(jì)QIAGEN QuantiTect Multiplex PCR KitAbgene ABsolute QPCR SYBR Green Mix 27.06-28.34 RMB / run ABsolute QPCR Mix 19.4-23.0 RMB / run 不包含UNG酶/ 熱啟動(dòng)酶優(yōu)點(diǎn)：包裝

10、靈活，可以選擇是否要ROX和dUTP可以預(yù)先分裝在PCR管里，使用更簡(jiǎn)單，且不易污染Epicentre FailSafe Real-Time PCR PreMix Selection Kit FailSafe Real-Time PCR System 200 Rxns - Plus 2 PreMixes 28.75/run 包含ROX/不含有dUTP/不包含UNG酶 優(yōu)點(diǎn)： 確保對(duì)不同的反應(yīng)都有最好的試驗(yàn)結(jié)果 弱點(diǎn)： 先做預(yù)試驗(yàn)，選出合適的PreMixes，在進(jìn)行正式試驗(yàn)，操作比較麻煩。premix里面包含了ROX和PCR enhancerClontech BD QZyme Assay BD

11、QTaq DNA Polymerase MixClontech BD QZyme Assay- 638137 200rxns 2750RMB 50X BD QZyme Gene-Specific Primers (5 & 3) 100X BD QZyme Substrate BD QTaq DNA Polymerase Mix - 639651 200rxns 2625 RMB Total -26.9 RMB / run優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高，重復(fù)性好, 動(dòng)力學(xué)范圍寬 One-step/ two step RT-PCR都可以配套 所有的Assays都經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證其效果 可以用于multiple

12、x Q-PCR為什么適合multiplex Q-PCR 每個(gè)基因只有兩條特異性的oligo,底物的序列是一樣的相關(guān)產(chǎn)品UDG Epicentre - HK-UNG Thermolabile Uracil N-Glycosylase 100 U 1392RMB NEB - E. coli Uracil-DNA Glycosylase (UDG) M0280V 200 units 310 RMB 市場(chǎng)情況market leader - ABI48% share of detection chemistry market 53% share of enzyme master mix marketSu

13、pplier Market Share for Fluorescently Labeled Oligonucleotide Detection ChemistriesApplied Biosystems48%Bio-Synthesis1%Proligo1%Invitrogen9%Qiagen Operon8%MWG Biotech6%Other7%Sigma-Genosys6%Integrated DNATechnologies4%BiosearchTechnologies4%Epoch2%Eurogentec4%Source: BioInformatics, The Market for R

14、eal-Time PCR Reagents & Instrumentation, 2003Satisfaction with Top Three SuppliersApplied Biosystems60%Invitrogen74%Qiagen77%RocheAppliedScience19%Sigma5%Stratagene7%Qiagen5%Invitrogen4%Abgene4%Bio-Rad2%Finnzymes1%AppliedBiosystems53%Supplier Market Share for qPCR Master Mixes & KitsTop 5 Ma

15、ster Mixes & Kits1.TaqMan Universal PCR Master Mix (ABI)2.SYBR Green PCR Master Mixes (ABI)3.SYBR Green PCR Core Reagents Kit (ABI)4.TaqMan PCR Core Reagents Kit (ABI)5.LightCycler-FastStart DNA Master (Roche)Satisfaction with Top Two SuppliersApplied Biosystems82%Roche Applied Science78%Source:

16、 BioInformatics, The Market for Real-Time PCR Reagents & Instrumentation, 2003SYBR GreenCustomer Use of Detection ChemistriesFluorescentprobes or primersonly36%Both SYBR Greenand fluorescentprobes or primers33%SYBR Green only31%Source: BioInformatics, The Market for Real-Time PCR Reagents &

17、Instrumentation, 200360% of rxns are done w/ fluorescent probes/primers40% of rxns are done w/ SYBR GreenTop 5 Amplification Enzymes1.AmpliTaq GOLD DNA Polymerase (ABI)2.FastStart Taq DNA Polymerase (Roche Applied Science)3.HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen)4.Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen)

18、5.Taq DNA Polymerase (Any Vendor)國(guó)內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手 ABI Invitrogene MJ Research BIO-Rad SigmaABI SYBR Green PCR Core Reagents 13.625-20/run（北京市場(chǎng)折后價(jià)） TaqMan Universal PCR Master Mix 熱啟動(dòng)酶（化學(xué)修飾型）/包含UNG酶/包含ROX/ 含 dUTP 優(yōu)點(diǎn): 包含UNG酶，價(jià)格也不貴，品牌知名度高，儀器用戶眾多 弱點(diǎn): 酶的特異性稍差I(lǐng)nvitrogene Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG 20.45-22.54 RMB Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG 20.128-25.327 RMB / run 熱啟動(dòng)酶（抗體調(diào)節(jié)型）/包含UNG酶/包含ROX/ 含 dUTP 優(yōu)點(diǎn)： 包含U