1、 Rho激酶抑制劑激酶抑制劑 與糖尿病心肌病與糖尿病心肌病 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科 李擁軍李擁軍 Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑的藥理作用3. Rho激酶抑制劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. Rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內(nèi)內(nèi) 容容RhoA/ROCKRho為小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白為小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白, ,是是Ras超家族成超家族成員之一。員之一。Rho激酶激酶( (ROCK)屬于絲氨酸屬于絲氨酸/ /蘇氨酸蛋白激蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是最早發(fā)現(xiàn)的酶家族成員，是最早發(fā)現(xiàn)的RhoA下游效應(yīng)

2、器。下游效應(yīng)器。ROCK有兩個(gè)亞基有兩個(gè)亞基：兩者在氨基酸序列上有兩者在氨基酸序列上有65%65%的同源性的同源性, , 其中催化結(jié)構(gòu)域的同源性高達(dá)其中催化結(jié)構(gòu)域的同源性高達(dá)92%92%。 RhoA/ROCK Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑的藥理作用3. Rho激酶抑制劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. Rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內(nèi)內(nèi) 容容ROCK抑制抑制劑劑目前廣泛應(yīng)用的目前廣泛應(yīng)用的ROCK抑制劑主要有抑制劑主要有fasudil和和Y-27632兩大家族。兩大家族。它們它們是非亞基選擇性的抑制劑，既能抑制是非亞

3、基選擇性的抑制劑，既能抑制ROCK1，也可抑制也可抑制ROCK2。主要作用于主要作用于ROCK催化結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)上，從而抑制上，從而抑制ROCK的活性。的活性。較大劑量時(shí)亦可抑制其他絲蘇氨酸激酶如較大劑量時(shí)亦可抑制其他絲蘇氨酸激酶如PKA或或PKC。ROCK抑制抑制劑劑Fasudil 19951995年在日本上市，臨床上用于治療蛛年在日本上市，臨床上用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后腦血管痙攣。是目前唯一可應(yīng)網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后腦血管痙攣。是目前唯一可應(yīng)用于臨床的用于臨床的ROCK抑制劑。抑制劑。Hydroxyfasudil是是fasudil的羥化活性代謝產(chǎn)物，的羥化活性代謝產(chǎn)

4、物，其對(duì)其對(duì)ROCK具有更高的選擇性。具有更高的選擇性。Fasudil的主要不良反應(yīng)為肝功能損害的主要不良反應(yīng)為肝功能損害(7.64%), 顱顱內(nèi)出血內(nèi)出血(1.63%)和低血壓和低血壓(0.59%)。但有研究者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用但有研究者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用fasudil治療腦卒中與安慰劑治療腦卒中與安慰劑比較，沒有嚴(yán)重的不良事件發(fā)生。比較，沒有嚴(yán)重的不良事件發(fā)生。ROCK抑制抑制劑劑Y-27632是在細(xì)胞生物學(xué)和是在細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)研究中廣泛應(yīng)藥理學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的用的ROCK抑制劑。抑制劑。Statins除調(diào)脂作用外，還可通過抑制類異戊二烯除調(diào)脂作用外，還可通過抑制類異戊二烯的生成而影響的生成而影響Rho蛋

5、白的膜定位功能蛋白的膜定位功能, , 阻斷阻斷RhoA/ROCK通路，所以它具有摸擬通路，所以它具有摸擬ROCK抑制抑制劑的效應(yīng)劑的效應(yīng)。Statins呈現(xiàn)的多效性很多源于它對(duì)呈現(xiàn)的多效性很多源于它對(duì)RhoA/ROCK通路的抑制作用。通路的抑制作用。ROCK抑制抑制劑劑ROCK抑制劑的藥理作用：抑制劑的藥理作用：（1 1）抑制鈣敏化效應(yīng)，擴(kuò)張血管，改善血管功能）抑制鈣敏化效應(yīng)，擴(kuò)張血管，改善血管功能 失調(diào)。失調(diào)。 （2 2）抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和粘附，減輕炎性反應(yīng)。）抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和粘附，減輕炎性反應(yīng)。（3 3）減少氧化應(yīng)激，增加）減少氧化應(yīng)激，增加eNOS的表達(dá)，促進(jìn)的表達(dá)，促進(jìn)NO生成。

6、生成。（4 4）抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖，減輕組織重構(gòu)。）抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖，減輕組織重構(gòu)。（5 5）抑制肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合和一些基因的）抑制肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合和一些基因的表達(dá)。表達(dá)。 Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑的藥理作用3. Rho激酶抑制劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. Rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內(nèi)內(nèi) 容容ROCK抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病(1) ROCK抑制劑與動(dòng)脈粥樣硬化抑制劑與動(dòng)脈粥樣硬化ROCK抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾?。? 2）ROCK抑制劑與冠心病抑制劑與冠心病

7、Masumoto等發(fā)現(xiàn)，對(duì)等發(fā)現(xiàn)，對(duì)冠脈痙攣性心絞痛患者，冠冠脈痙攣性心絞痛患者，冠脈內(nèi)給予脈內(nèi)給予Fasudil 可明顯減輕可明顯減輕Ach誘發(fā)的冠狀動(dòng)脈誘發(fā)的冠狀動(dòng)脈收縮，防止胸痛發(fā)作，而對(duì)血壓沒有明顯影響。收縮，防止胸痛發(fā)作，而對(duì)血壓沒有明顯影響。ROCK抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病 Otsuka等人在為穩(wěn)定型心絞痛患者行等人在為穩(wěn)定型心絞痛患者行冠脈造影時(shí)，冠脈造影時(shí)，首先首先冠脈內(nèi)給予硝酸甘油冠脈內(nèi)給予硝酸甘油200gg，而后給予，而后給予fasudil 30mg靜脈輸注，靜脈輸注，分別分別測(cè)量管腔狹窄處直測(cè)量管腔狹窄處直徑，發(fā)現(xiàn)徑，發(fā)現(xiàn)fasudil明顯擴(kuò)張狹窄處的管徑，其

8、效果明顯擴(kuò)張狹窄處的管徑，其效果優(yōu)于硝酸甘油。優(yōu)于硝酸甘油。ROCK抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病在日本進(jìn)行的一個(gè)多中心在日本進(jìn)行的一個(gè)多中心期臨床試驗(yàn)評(píng)估了期臨床試驗(yàn)評(píng)估了口服口服fasudil對(duì)于勞力型心絞痛患者的療效。結(jié)對(duì)于勞力型心絞痛患者的療效。結(jié)果顯示長(zhǎng)期服用果顯示長(zhǎng)期服用fasudil可以改善患者的運(yùn)動(dòng)耐可以改善患者的運(yùn)動(dòng)耐力，且存在量效關(guān)系。同時(shí)患者對(duì)藥物的耐受力，且存在量效關(guān)系。同時(shí)患者對(duì)藥物的耐受性良好，未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良事件。性良好，未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良事件。新近，新近，Kikuchi等人已將血循環(huán)中中性粒細(xì)胞等人已將血循環(huán)中中性粒細(xì)胞上上ROCK的活性作為心絞痛診斷和病情

9、評(píng)估的的活性作為心絞痛診斷和病情評(píng)估的指標(biāo)。指標(biāo)。ROCK抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾?。ǎǎ㏑OCK抑制劑與高血壓病抑制劑與高血壓病在高血壓大鼠模型中，短期給予在高血壓大鼠模型中，短期給予Y-27632，能夠以劑量依賴的方式顯著地降低血壓，能夠以劑量依賴的方式顯著地降低血壓，這提示這提示ROCK的激活包含在高血壓的發(fā)病的激活包含在高血壓的發(fā)病機(jī)制中。機(jī)制中。研究發(fā)現(xiàn)將研究發(fā)現(xiàn)將fasudil應(yīng)用于高血壓病的患者，應(yīng)用于高血壓病的患者，可以增加患者的前臂血流量，降低前臂血可以增加患者的前臂血流量，降低前臂血管阻力，而對(duì)正常人血管則沒有擴(kuò)張作用。管阻力，而對(duì)正常人血管則沒有擴(kuò)張作用。RO

10、CK抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病（）（）ROCK抑制劑與肺動(dòng)脈高壓抑制劑與肺動(dòng)脈高壓(PAH)研究證實(shí)：研究證實(shí)：ROCK介導(dǎo)的介導(dǎo)的ECs功能失調(diào)功能失調(diào)、VSMCs 的的過度收縮和增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等過度收縮和增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等都參與了都參與了PAH的形成。的形成。Fukumoto等人給等人給9 9例嚴(yán)重例嚴(yán)重PAH患者靜點(diǎn)患者靜點(diǎn)fasudil (30mg for 30min)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)fasudil能能夠降低肺動(dòng)脈壓力，增加心臟指數(shù)，夠降低肺動(dòng)脈壓力，增加心臟指數(shù)，明顯降明顯降低肺血管阻力，且未引起低血壓等付作用。低肺血管阻力，且未引起低血壓等付作用。ROCK抑制劑

11、與心血管疾病抑制劑與心血管疾病 小結(jié)：小結(jié)：大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明：大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明：ROCK抑制抑制劑在防治心血管疾病方面具有巨大的潛力，劑在防治心血管疾病方面具有巨大的潛力，已成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。已成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。有更多的研究正在證實(shí)有更多的研究正在證實(shí)ROCK抑制劑的用途抑制劑的用途及其安全性。及其安全性。ROCK抑制劑的高選擇性將會(huì)減少其相關(guān)的抑制劑的高選擇性將會(huì)減少其相關(guān)的毒付作用。目前正在研發(fā)亞基選擇性毒付作用。目前正在研發(fā)亞基選擇性ROCK抑制劑。抑制劑。 Rho激酶的結(jié)構(gòu)和功能激酶的結(jié)構(gòu)和功能 Rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑的藥理作用3. Rho激酶抑制

12、劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. Rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內(nèi)內(nèi) 容容ROCK與糖尿病并發(fā)癥與糖尿病并發(fā)癥 ROCK與糖尿病心肌病與糖尿病心肌病RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在激酶信號(hào)通路在2 2型糖尿病大鼠心肌纖維型糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用化中的作用研究背景研究背景糖尿病心肌病是糖尿病一種獨(dú)特的心臟并發(fā)糖尿病心肌病是糖尿病一種獨(dú)特的心臟并發(fā)癥。這與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率癥。這與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)。和高病死率密切相關(guān)。心肌舒張功能障礙是其最早出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)心肌舒張功能障礙是其最早出現(xiàn)的臨床表現(xiàn), ,最終可發(fā)展為心力衰竭

13、。最終可發(fā)展為心力衰竭。心肌纖維化是其主要的病理改變之一，心肌纖維化是其主要的病理改變之一，在糖在糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。的作用。對(duì)糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的治療措施，對(duì)糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的治療措施，更好地了解其發(fā)病機(jī)制并發(fā)展新的治療藥物更好地了解其發(fā)病機(jī)制并發(fā)展新的治療藥物是非常必要的。是非常必要的。國(guó)內(nèi)對(duì)糖尿病心肌病的研究主要應(yīng)用國(guó)內(nèi)對(duì)糖尿病心肌病的研究主要應(yīng)用1 1型糖型糖尿病模型，對(duì)尿病模型，對(duì)2 2型糖尿病模型的研究較少。型糖尿病模型的研究較少。研究?jī)?nèi)容集中在形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞因子水平研究?jī)?nèi)容集中在形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞

14、因子水平上，對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究很少。上，對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究很少。研究背景研究背景研究目的研究目的目前，目前，RhoA/ROCK通路在糖尿病心肌纖維化通路在糖尿病心肌纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，發(fā)病機(jī)制中的作用國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，ROCK的的下游信號(hào)分子尚不完全肯定。下游信號(hào)分子尚不完全肯定。研究目的：在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平，探討研究目的：在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平，探討RhoA/ROCK、JNK和和TGF1/Smad通路在糖通路在糖尿病心肌纖維化中的作用以及相互關(guān)系。尿病心肌纖維化中的作用以及相互關(guān)系。有可能為糖尿病心肌病確定有效的預(yù)防和治療有可能為糖尿病心肌病確定有效的預(yù)防

15、和治療靶點(diǎn)。靶點(diǎn)。 第一部分第一部分RhoA/ROCK通路在高糖誘導(dǎo)通路在高糖誘導(dǎo)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成中的作用原合成中的作用體外研究體外研究細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 5.5mM葡萄糖葡萄糖 NG組組 25mM葡萄糖葡萄糖 HG組組 5.5mM葡萄糖葡萄糖+ +19.5mM甘露醇甘露醇 OSM組組 5.5mM葡萄糖葡萄糖+ +Fas 50uM NG+Fas組組 5.5mM葡萄糖葡萄糖+ +Fas 100uM NG+Fas組組 25mM葡萄糖葡萄糖+ +Fas 50uM HG+Fas組組 25mM葡萄糖葡萄糖+ +Fas 100uM HG+Fas組組CF prolif

16、eration was evaluated using MTT assay. The data are means SD. n=6; P0.01 vs NG group. *P0.05, *P0.01 vs HG group. 結(jié)結(jié) 果果The mRNA expression of type-I procollagen, ROCK1 and JNK was evaluated by RT-PCR. n=3; The mRNA expression of type-I procollagen was significantly upregulated in HG group. 結(jié)結(jié) 果果Immu

17、nocytochemical staining for type-I procollagen. . Magnification is 400. 結(jié)結(jié) 果果Accumulation of type-I collagen in media was determined by ELISA. The data are means SD. n=6; P0.01 vs NG group. *P0.05, *P0.01 vs HG group.結(jié)結(jié) 果果 結(jié)結(jié) 果果 The phosphorylation of MYPT1 was measured by western blot analyses. n=3

18、; P0.01 vs NG group. *P0.01 vs. HG group. 結(jié)結(jié) 果果JNK activity and c-jun protein expression were measured by Western blot analyses. n=3; P0.01 vs NG group. *P0.01 vs HG group. 結(jié)結(jié) 果果 The protein expression of TGF1 and the phosphorylation of Smad2/3 was measured by Western blot analyses. n=3; P0.01 vs NG

19、 group. *P0.01 vs HG group. 結(jié)結(jié) 論論 結(jié)結(jié) 論論高糖激活了高糖激活了RhoA/ROCK通路，介導(dǎo)了心肌成通路，介導(dǎo)了心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。ROCK特異性抑制特異性抑制劑法舒地爾有效地抑制了高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)劑法舒地爾有效地抑制了高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。胞增殖和膠原合成。高糖環(huán)境中，高糖環(huán)境中，JNK和和Smad2/3是是ROCK的下游的下游信號(hào)分子，信號(hào)分子，RhoA/ROCK通路介導(dǎo)的胞質(zhì)信號(hào)通路介導(dǎo)的胞質(zhì)信號(hào)部分地通過部分地通過JNK和和Smad2/3轉(zhuǎn)入核內(nèi)，從而調(diào)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，從而調(diào)控著相關(guān)的基因表達(dá)?？刂嚓P(guān)的基因

20、表達(dá)。第二部分第二部分RhoA/ROCK通路在通路在2 2型糖尿病型糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用及法舒大鼠心肌纖維化中的作用及法舒地爾對(duì)心肌的保護(hù)效應(yīng)地爾對(duì)心肌的保護(hù)效應(yīng)在體研究在體研究2 2型糖尿病大鼠型糖尿病大鼠普通飼料喂養(yǎng)普通飼料喂養(yǎng)10mg/kg i.p.Fasudil治療大鼠治療大鼠糖尿病大鼠糖尿病大鼠對(duì)照組大鼠對(duì)照組大鼠對(duì)照組大鼠對(duì)照組大鼠SD大鼠大鼠 高脂飼料喂養(yǎng)高脂飼料喂養(yǎng)6w末末STZ30mg/kg i.p.10w末血糖嵌夾末血糖嵌夾24w末結(jié)束試驗(yàn)?zāi)┙Y(jié)束試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)結(jié) 果果結(jié)結(jié) 果果結(jié)結(jié) 果果Masson staining, Magnification, 400結(jié)結(jié) 果果TEM, Magnification, 6000 結(jié)結(jié) 果果SABC staining for type-I collagen (A) and typ