1、名詞解釋及問(wèn)答總體1 .生物催化利用生物催化劑（微生物、酶等）改變或通常是加快化學(xué)反應(yīng)速度，獲得生物產(chǎn)品的過(guò) 程。典型的生物催化反應(yīng)系統(tǒng)：系統(tǒng)構(gòu)成三要素：反應(yīng)物、催化劑和反應(yīng)介質(zhì)2 .雙水相萃取系統(tǒng)某些親水性高分子聚合物的水溶液超過(guò)一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)。利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質(zhì)， 待分離組分在兩相中分配系數(shù)有所差異可達(dá)到分離的目的。3 .濁點(diǎn)系統(tǒng)當(dāng)一種非離子表面活性劑的水相膠束溶液溫度達(dá)到其濁點(diǎn)以上，或者在存在某些添加劑的情況下，會(huì)導(dǎo)致相分離，形成一個(gè)表面活性劑稀少相（水包油乳液）和一個(gè)表面活性劑富集相（油包水乳液），后

2、者又稱凝聚相，其中包含許多大的水泡， 可容納細(xì)胞或溶解的酶分子。 這樣的系統(tǒng)被稱為濁點(diǎn)系統(tǒng)，它曾被用于分離技術(shù)中，即濁點(diǎn)萃取。4 .離子液體離子液體實(shí)質(zhì)上是一些凝固點(diǎn)較低的鹽。離子液體作為一類極性溶劑，能溶解許多有機(jī)化合物。與普通有機(jī)溶劑最大的區(qū)別在于：離子液體不會(huì)揮發(fā)（沒(méi)有蒸氣壓），對(duì)環(huán)境比較友好，用于工業(yè)生產(chǎn)也相對(duì)比較安全；它們與許多有機(jī)溶劑互不相溶，可以形成有機(jī)溶劑-離子液體兩相系統(tǒng)或者有機(jī)溶劑-水-離子液體三相系統(tǒng)，從而為溶劑工程 在生物催化反應(yīng)中的應(yīng)用提供了新的可能。一般而言，離子液體通常有三種方式被應(yīng)用于生物催化過(guò)程：作為單一的溶劑； 作為共溶劑添加于水相系統(tǒng)中；與水形成兩相系統(tǒng)。

3、5 .逆膠束系統(tǒng)逆膠束系統(tǒng)是含有表面活性劑與少量水的有機(jī)溶劑系統(tǒng)。表面活性劑分子由疏水性尾部和親水性頭部?jī)刹糠纸M成， 在含水有機(jī)溶劑中， 它們的疏水性基團(tuán)與有機(jī)溶劑接觸，而親水性頭部形成極性內(nèi)核，從而組成許多個(gè)逆膠束，水分子聚集在逆膠束內(nèi)核中形成微水池”,里面容納了酶分子，這樣酶被限制在含水的微環(huán)境中，而底物和產(chǎn)物可以自由進(jìn)出膠束。6 .logP規(guī)則logP是衡量物質(zhì)疏水性強(qiáng)弱的一個(gè)特征參數(shù)，logP值越大，溶劑的疏水性越強(qiáng)，其奪取酶分子必需水的能力越弱。P=C正辛醇/C水.7 .未培養(yǎng)微生物表示的是活的但不可培養(yǎng)微生物的概念，將菌種轉(zhuǎn)到不含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鹽水中，經(jīng)常長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存，細(xì)菌會(huì)進(jìn)入一

4、種數(shù)量不減、有代謝活力、但在正常試驗(yàn)室培養(yǎng)條件下不能生長(zhǎng)產(chǎn)生菌落的狀態(tài)，把這種狀態(tài)的微生物成為未培養(yǎng)微生物。一8 .酶必需水指維持酶空間構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)所需的最低水量。9 .微乳液微乳液一般是由表面活性劑、助表面活性劑、油與水等組分在適當(dāng)比例下組成的無(wú)色、透明（或半透明卜低粘度的熱力學(xué)體系。10 .膜反應(yīng)器膜反應(yīng)器是膜過(guò)程和反應(yīng)過(guò)程相結(jié)合的新技術(shù)。同時(shí)具備了反應(yīng)和分離的步驟。具有一系列優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)和分離組合成單一的單元過(guò)程，降低分離等過(guò)程的費(fèi)用；對(duì)于可逆反應(yīng)，突破熱力學(xué)平衡限制，通過(guò)膜擴(kuò)散過(guò)程移走產(chǎn)物，使轉(zhuǎn)化率達(dá)到100% ;調(diào)節(jié)反應(yīng)過(guò)程參數(shù)，緩和反應(yīng)條件，提高目的產(chǎn)物的選擇性和產(chǎn)率，減少副反應(yīng)。

5、11 .易錯(cuò)PCR技術(shù)是指通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件來(lái)調(diào)整 PCR反應(yīng)中的突變頻率， 降低聚合酶固有的突變序 列的傾向性，提高突變譜的多樣性，使得錯(cuò)誤堿基隨機(jī)地以一定的頻率摻入到擴(kuò)增的基因中， 從而得到隨機(jī)突變的 DNA群體，最后用合適的載體克隆突變基因。12基因重排技術(shù) DNAshuffling從兩條以上的正突變基因出發(fā)，經(jīng)過(guò)酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變 13基因家族重排技術(shù) DNAfamilyshuffling從基因家族的若干基因出發(fā)，經(jīng)過(guò)酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變問(wèn)答題1 .簡(jiǎn)述影印平板培養(yǎng)法原理及其應(yīng)用。影印平板培養(yǎng)法，是一

6、種能達(dá)到在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接 種培養(yǎng)方法。把長(zhǎng)有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱印章上，使其沾上來(lái)自平板上的菌落。 然后可把這一 印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板 上。待這些平板培養(yǎng)后，對(duì)各平板相同位置上的菌落作對(duì)比后，就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途?。影印法目前已廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選以及抗藥性菌株篩選等研究工作中。通過(guò)影印培養(yǎng)法，就可以從在非選擇性條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌群體中，分離出各種類型的突變菌種。2 . 簡(jiǎn)述酶分子的理性設(shè)計(jì)。指在了解酶分子結(jié)構(gòu)，空間特點(diǎn)等的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過(guò)改變外界條件或者定向突變某一 位點(diǎn)，從而增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性或提高酶

7、活力大小。具體包括以下內(nèi)容：（1）分子模建:根據(jù)已知的目標(biāo)酶一級(jí)結(jié)構(gòu)序列，構(gòu)建蛋白質(zhì)的分子圖像；（2）理性設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)： 通過(guò)對(duì)酶結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系的理性分析，確定需突變的氨基酸殘基；（3）酶的突變與表達(dá)： 通過(guò)基因工程手段，對(duì)酶基因 DNA進(jìn)行定點(diǎn)突變。選擇合適的表達(dá)載體與宿主，對(duì)突變酶進(jìn)行高效 表達(dá)對(duì)突變酶的性質(zhì)進(jìn)行分析，指導(dǎo)新一輪理性設(shè)計(jì)理性設(shè)計(jì)改造的優(yōu)勢(shì)及其局限性目標(biāo)明確，工作量較小。目前，研究確定了影響酶穩(wěn)定性 （熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性等性質(zhì)）的許多結(jié)構(gòu)特征，理性設(shè)計(jì)在改善酶穩(wěn)定性方面具有較高的成功可能性。對(duì)其它基本性質(zhì)（如活性、底物特異性、對(duì)映選擇性 ）和結(jié)構(gòu)之間的

8、關(guān)系的理解還非常不充分，其結(jié)構(gòu)影響參數(shù)難 以清楚地界定，成功范例較少。有理設(shè)計(jì)改造將來(lái)的進(jìn)步主要依賴酶結(jié)構(gòu)-功能方面的重大認(rèn)識(shí)突破，其次在于結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面結(jié)構(gòu)鑒定的進(jìn)展，和生物信息學(xué)方面模建程序的完善。 3. 簡(jiǎn)述非水相生物催化的優(yōu)點(diǎn)。（1）能提高非極性（水難溶）底物的溶解度；（2）使熱力學(xué)平衡向有利于合成的方向偏移；（3）改變酶對(duì)底物的專一性，包括位置和立體專一性；（4）能抑制依賴于水的某些不利反應(yīng) （如酸酎和鹵化物的水解，酚 /醍的聚合等）；（5）由于酶不溶于有機(jī)溶劑而無(wú)須固定化，或簡(jiǎn)單吸附于無(wú)孔表面（如玻璃珠）即可；(6)可通過(guò)過(guò)濾或離心等簡(jiǎn)單方法回收酶，反復(fù)利用；(7)從低沸點(diǎn)溶劑中可

9、以較容易地分離產(chǎn)物；(8)酶的穩(wěn)定性提高；(9)消除了微生物的污染；(10)酶可能被直接應(yīng)用于化工過(guò)程。4 .簡(jiǎn)述微水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)和水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)的區(qū)另微水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)，是指用與水不互溶的有機(jī)溶劑取代所有的溶劑水(>98%),形成固相酶分散在有機(jī)溶劑中的非均相反應(yīng)體系。處于這種體系中的酶， 其表面必須有殘余的結(jié)構(gòu)水，才能保證其催化活性。一般有機(jī)溶劑中含有小于2%的微量水。一般而言，酶在微水有機(jī)溶劑體系中穩(wěn)定性較好，但催化活力要比水相中低得多，部分原因是因?yàn)槊冈谟袡C(jī)相 不溶，許多酶分子聚結(jié)成團(tuán)，影響了顆粒內(nèi)部酶分子的催化效率。水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)， 是一種水和有機(jī)溶劑互溶的單相均

10、相反應(yīng)體系，酶在此系統(tǒng)中是游離狀態(tài)的存在于均相的反應(yīng)體系中，所以在此系統(tǒng)中酶的空間構(gòu)象受水分影響比微水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)小，一般來(lái)講，該系統(tǒng)中與水互溶有機(jī)溶劑的量可達(dá)總體積的10%20%(體積分?jǐn)?shù))，在一些特殊的情況下，甚至可高達(dá)90%以上。有些酶(如酯酶和蛋白酶)在水-有機(jī)溶劑均相系統(tǒng)中的反應(yīng)選擇性會(huì)增加；往往需要添加有機(jī)助溶劑等進(jìn)行此系統(tǒng)的制備。5 .請(qǐng)回答下圖中(a) - (f)分別代表酶在有機(jī)溶劑中的哪一種使用方式。(a)水與水溶性溶劑的均相混合物(b)水-有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)懸浮于溶劑中的酶粉(d)懸浮于溶劑中的載體固定化酶(e)酶溶于由水、有機(jī)溶劑和表面活性劑組成的微乳狀液可溶于有機(jī)溶劑

11、的共價(jià)修飾酶(或者用過(guò)不同化學(xué)鍵合形成的酶)6 .簡(jiǎn)述酶及細(xì)胞固定化方法。A載體結(jié)合法(a)共價(jià)結(jié)合法(b)離子結(jié)合法 物理吸附法(d)生化特異結(jié)合法B.自身交聯(lián) 法C.包埋法(a)格子型(b)微膠囊D.復(fù)合法，將上述兩種方法組合使用的固定化方法。例如 吸附+交聯(lián)，吸附+包埋，包埋+交聯(lián)固定化酶便于操作、易于分離、反復(fù)利用。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：便于分離，固定化酶易與反應(yīng)液分離，產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留，簡(jiǎn)化了產(chǎn)品提純工藝；重復(fù)利用，固 定化酶可較長(zhǎng)時(shí)間地反復(fù)、分批操作或裝柱連續(xù)反應(yīng)，有利于工藝的連續(xù)化、自動(dòng)化和管道 化；穩(wěn)定性高，固定化酶的穩(wěn)定性一般會(huì)有較大提高。7 . 簡(jiǎn)述酶分子修飾

12、的原理。酶分子修飾通過(guò)對(duì)蛋白酶主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造，改造的目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴(kuò)大酶的應(yīng)用已達(dá)到較高的經(jīng)濟(jì)效益。酶的化學(xué)修飾，通過(guò)對(duì)酶蛋白分子的主鏈進(jìn)行切割"、剪切”以及在側(cè)鏈上進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)達(dá)到改造酶分子的目的。 這種應(yīng)用化學(xué)方法對(duì)酶分子施行種種竽術(shù)”的技術(shù)稱為酶化學(xué)修飾。酶分子的化學(xué)修飾簡(jiǎn)單，容易見效。修飾劑的要求：一般情況下，要求修飾劑具有較 大分子量、有良好的水溶性和生物相容性，修飾后酶的半衰期長(zhǎng)。反應(yīng)條件的選擇：反應(yīng)要在酶穩(wěn)定的環(huán)境下進(jìn)行，避免破壞酶的活性集團(tuán)。 控制酶分子與修飾劑的分子比例，反應(yīng)溫度，時(shí)長(zhǎng)。

13、確保酶的高結(jié)合率和高回收率。金屬離子置換修飾；大分子結(jié)合修飾（共價(jià)/非共價(jià);多結(jié)合水不溶分子）；側(cè)鏈基團(tuán)修飾（多結(jié)合水溶解性小分子）；肽鏈有限水解修飾；氨基 酸置換修飾；酶分子的物理修飾。酶分子物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下,特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、 極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。酶的基因工程修飾，酶的基因工程主要利用基因工程解決酶的大量生產(chǎn)和天然酶分子的 改造。在酶的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上利用基因工程將兩種或兩種以上的酶的不同結(jié)構(gòu)片段構(gòu)成新的酶， 使酶具有多種生產(chǎn)需要的功能特點(diǎn)。8 .簡(jiǎn)述酶分子定向進(jìn)化原理及策略人為創(chuàng)造特殊的條件， 模擬自然進(jìn)化

14、機(jī)制， 在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變；從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為改造的）出發(fā)，經(jīng)過(guò)基因的突變和重組，構(gòu)建人工突變酶 庫(kù)，采用高效的篩選或選擇方法，最終獲得具有某些優(yōu)良特性的進(jìn)化酶。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變/正向重組+定向選擇/篩選現(xiàn)有酶的分子改造包括理性設(shè)計(jì)：在深入了解酶的結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)制等信息的基礎(chǔ)上，對(duì)酶的突變位點(diǎn)進(jìn)行精確設(shè)計(jì)，采用基因工程手段對(duì)天然酶的序列進(jìn)行改造，獲得具有所需性能的新酶。定向進(jìn)化通過(guò)隨機(jī)突變、DNA重組等手段對(duì)酶的基因序列進(jìn)行改造，并對(duì)獲得的突變酶庫(kù)進(jìn)行定向篩選獲得性能優(yōu)異的突變酶。定向進(jìn)化策略具體包括：高突變菌株；易錯(cuò) PCR; DNA改組；外顯子改組；雜

15、合酶； PCR體外隨機(jī)引發(fā)重組；交錯(cuò)延伸法；隨機(jī)定向突變等。9 .簡(jiǎn)述非水介質(zhì)中影響酶活性的因素有哪些？并解釋溶劑極性對(duì)酶活性的影響？非水溶劑中酶的選擇性取決于底物的去溶劑化能力。非水溶劑對(duì)酶穩(wěn)定性有影響，有機(jī)溶劑能夠增加酶構(gòu)象的剛性，尤其是在低水含量的疏水性有機(jī)溶劑中提高酶的穩(wěn)定性。在所有含溶劑的生物催化系統(tǒng)中，溶劑的性質(zhì)會(huì)在很大程度上影響酶的活性、選擇性和穩(wěn)定性。其中起關(guān)鍵作用的是溶劑的極性。降低介質(zhì)的介電常數(shù)將導(dǎo)致酶分子中帶電殘基之間靜電作用力的增加。這可能會(huì)降低酶分子的柔性，進(jìn)而降低酶催化的活力。遵循logP規(guī)則。10 .簡(jiǎn)述有機(jī)溶劑中微量水對(duì)酶催化活性的影響？酶都溶于水，只有在一定量

16、的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，水是不可缺少的成分之一。有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少對(duì)酶的空間構(gòu)象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無(wú)水的條件下，酶的空間構(gòu) 象被破壞，酶將變性失活。故此，酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構(gòu)象。維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水 12脂肪酶催化的界面活化原理+ 3 CH。一C-RCR-OH+ 3 CHpH 下- CH -OHI CH -OH生物柴油：常見的類型為脂肪酸甲酯生物催化

17、反應(yīng)系統(tǒng)的組成系統(tǒng)構(gòu)成三要素：反應(yīng)物、催化劑和反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)象工程（ConformationalEngineering）睡在溶液中的空間構(gòu)象是柔性可變的：環(huán)境 結(jié)構(gòu) 功能！通過(guò)改變反應(yīng)環(huán)境（溶液T質(zhì)）即有可能調(diào)節(jié)酶的空間構(gòu)象，優(yōu)化強(qiáng)化酶的催化性能。 非水相生物催化技術(shù)近20年來(lái)酶工程領(lǐng)域最大的突破長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直錯(cuò)誤地認(rèn)為酶只能在水溶液中使用；若與有機(jī)溶劑接觸，就會(huì)變性失活。由于大多數(shù)有機(jī)化合物在水中很難溶解，有些還不穩(wěn)定，因此化學(xué)合成大多使用有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，從而忽略了對(duì)生物催化劑的開發(fā)和應(yīng)用。1984 年，A.M.Klibanov 在 Science 上發(fā)表“EnzymaticCatal

18、ysisinOrganicMediaat100”,使原來(lái)認(rèn)為生物催化必須在水溶液中進(jìn)行的酶學(xué)概念發(fā)生了革命性的變化。酶可以在含有各種有機(jī)溶劑和微量水分的非水介質(zhì)系統(tǒng)中發(fā)揮催化作用，并且所表現(xiàn)出的催化性能（如活力、選擇性、穩(wěn)定性）與在常規(guī)水溶液介質(zhì)中的性能截然不同，從而極大地?cái)U(kuò)展了生物催化劑的應(yīng)用范圍。介質(zhì)工程在設(shè)計(jì)、優(yōu)化工業(yè)生物催化的反應(yīng)介質(zhì)系統(tǒng)時(shí)，我們不應(yīng)簡(jiǎn)單地從一個(gè)極端（100%水）走向另一個(gè)極端（100%有機(jī)溶劑），必須根據(jù)反應(yīng)底物/產(chǎn)物和生物催化劑的特性，具體情況具體分析。通過(guò)非水相介質(zhì)系統(tǒng)的多樣性變化，也可以在很大程度上調(diào)控酶的催化性能，達(dá)到“蛋白質(zhì)工程”所欲達(dá)到的類似效果，因此才提

19、出了 “溶劑工程”、“介質(zhì)工程”或“微環(huán)境工程”等概念。有機(jī)介質(zhì)中生物催化的優(yōu)點(diǎn)有利于疏水性底物的反應(yīng)可提高酶的熱穩(wěn)定性能催化水中不能進(jìn)行的反應(yīng)可改變反應(yīng)平衡移動(dòng)方向可調(diào)控酶的底物專一性可防止由水引起的副反應(yīng)可擴(kuò)大反應(yīng)pH值的適應(yīng)性酶易于實(shí)現(xiàn)固定化酶和產(chǎn)物易于回收可避免微生物污染有機(jī)介質(zhì)中使用酶的不同方式(a) 水與水溶性溶劑的均相混合物(b) 水 -有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)(c) 懸浮于溶劑中的酶粉(d) 懸浮于溶劑中的載體固定化酶(e) 酶被增溶于由水、有機(jī)溶劑和表面活性劑組成的微乳狀液(f) 可溶于有機(jī)溶劑的共價(jià)修飾酶典型的生物催化介質(zhì)系統(tǒng)種類水或緩沖溶液系統(tǒng)；水 - 有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)水 - 有

20、機(jī)溶劑兩相系統(tǒng);乳狀液或微乳液系統(tǒng)微水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng);超臨界流體系統(tǒng)離子液體介質(zhì)系統(tǒng)無(wú)溶劑反應(yīng)系統(tǒng)雙水相系統(tǒng);濁點(diǎn)系統(tǒng)單一的水或緩沖溶液系統(tǒng)由于酶的構(gòu)象與其離子化狀態(tài)密切相關(guān)，因此酶的體外實(shí)驗(yàn)研究通常在一定濃度的緩沖溶液體系中進(jìn)行，這樣可保證酶在最佳pH 附近發(fā)揮最大的活力。均相水 - 有機(jī)溶劑系統(tǒng)增加親脂性底物溶解度的一個(gè)最簡(jiǎn)單辦法是向反應(yīng)混合物中加入與水互溶的有機(jī)溶劑，通常被稱為有機(jī)助溶劑(organiccosolvent) 。常用的助溶劑有二甲亞碉 (DMSO卜二甲基甲酰胺(DMF)、四氫味喃(THF)、二氧六環(huán) (dioxane) 、丙酮和低級(jí)醇等。一般來(lái)講，該系統(tǒng)中與水互溶有機(jī)溶劑

21、的量可達(dá)總體積的10%-20%(體積分?jǐn)?shù)) ，有的甚至高達(dá) 90%.水 - 有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)水 - 有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)是指由水相和非極性有機(jī)溶劑相( 烴、醚、酯等) 組成的非均相反應(yīng)系統(tǒng) ; 兩相的體積比可以在很寬的范圍內(nèi)變動(dòng)。底物和產(chǎn)物則主要溶于有機(jī)相中; 酶溶解于水相中，這樣可使酶與有機(jī)溶劑在空間上相分離，以保證酶處在有利的水環(huán)境中，而不直接與有機(jī)溶劑相接觸。水 - 有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)水 - 有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)已成功地用于強(qiáng)疏水性底物( 如甾體、 脂類、 烯烴類和環(huán)氧化合物)的生物轉(zhuǎn)化。例如，在兩相體系中已成功地實(shí)現(xiàn)微生物催化的烯烴不對(duì)稱環(huán)氧化：珊瑚諾卡氏菌(Nocardiacorallina)

22、 生物轉(zhuǎn)化烯烴產(chǎn)生的環(huán)氧化物被及時(shí)轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中，使得產(chǎn)物環(huán)氧化物對(duì)微生物的毒性降低到最低程度。巨大芽孢桿菌環(huán)氧水解酶催化的縮水甘油苯基醚的對(duì)映選擇性開環(huán)水解反應(yīng)也適合于在兩相系統(tǒng)中進(jìn)行，由于不穩(wěn)定的環(huán)氧底物大部分溶解在異辛烷中，因此不但可以減少其自發(fā)水解，而且可以減輕其對(duì)酶的抑制，從而便于大幅度增加有機(jī)相中底物和產(chǎn)物的濃度，有助于提高生物催化的效率乳狀液或微乳液系統(tǒng)反相膠束體系能夠較好地模擬酶的天然狀態(tài)，在逆膠束系統(tǒng)中，大多數(shù)酶能夠保持催化活性和穩(wěn)定性，甚至表現(xiàn)出“超活性”(superactivity) 。自1974年Wells發(fā)現(xiàn)磷脂酶A2在卵磷脂-乙醛-水逆膠束系統(tǒng)中具有催化卵磷脂水解活

23、性以來(lái)，膠束酶學(xué)(micelleenzymology) 的研究和應(yīng)用在國(guó)內(nèi)外引起廣泛的關(guān)注。逆膠束系統(tǒng)是含有表面活性劑與少量水的有機(jī)溶劑系統(tǒng)。表面活性劑分子由疏水性尾部和親水性頭部?jī)刹糠纸M成，在含水有機(jī)溶劑中，它們的疏水性基團(tuán)與有機(jī)溶劑接觸，而親水性頭部形成極性內(nèi)核，從而組成許多個(gè)逆膠束，水分子聚集在逆膠束內(nèi)核中形成 “微水池” ，里面容納了酶分子，這樣酶被限制在含水的微環(huán)境中，而底物和產(chǎn)物可以自由進(jìn)出膠束。逆膠束系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)組成的靈活性：大量不同類型的表面活性劑、有機(jī)溶劑甚至是不同極性的物質(zhì)，都可用于構(gòu)建適宜于酶反應(yīng)的逆膠束系統(tǒng)；熱力學(xué)穩(wěn)定性和光學(xué)透明性：逆膠束是自發(fā)形成的，因而不需要機(jī)械混合，

24、有利于規(guī)模放大；逆膠束有非常高的比界面積：遠(yuǎn)高于有機(jī)溶劑-水兩相系統(tǒng)，使底物和產(chǎn)物在相間的轉(zhuǎn)移變得極為有利；逆膠束的相特性隨溫度而變化：這一特性可以簡(jiǎn)化產(chǎn)物和酶的分離純化。例如馬肝醇脫氫酶在AOT或C12E5逆膠束系統(tǒng)中催化4-甲基環(huán)己酮還原生成 4-甲基環(huán)己醇，反應(yīng)后通過(guò)溫度誘導(dǎo)可使產(chǎn)物回收到有機(jī)相中，而酶、 輔酶在水相中，并可多次循環(huán)反復(fù)使用，每一次循環(huán)酶活性損失很小。逆膠束中的酶催化反應(yīng)可用于油脂水解、輔酶再生、消旋體拆分、肽和氨基酸合成和高分子材料合成。色氨酸合成可采用色氨酸酶催化吲哚和絲氨酸縮合而成，由于吲哚在水中溶解度很低、且對(duì)酶有抑制作用。Eggers 運(yùn)用 Brij-Aligu

25、at336- 環(huán)己醇為逆相膠束系統(tǒng)，建立了膜反應(yīng)器中逆膠束酶法合成色氨酸的生產(chǎn)工藝。乳狀液系統(tǒng)在脂肪酶催化拆分酮基布洛芬酯的水解反應(yīng)中, 使用添加劑，可使脂肪酶活性和選擇性提高 1-2 個(gè)數(shù)量級(jí)！反膠束的形成反膠束(又稱“逆膠束”)，是表面活性劑兩性分子在非極性有機(jī)溶劑中超過(guò)CMC寸自發(fā)形成的聚集體. 表面活性劑分子在界面上定向排列, 碳?xì)滏溕煜蛴袡C(jī)相, 極性頭或荷電頭部及抗衡離子則向內(nèi)排列, 形成極性核。反膠束酶系統(tǒng)的形成親水酶會(huì)溶入逆膠束的核心水團(tuán)中, 不與有機(jī)溶劑直接接觸; 表面活性酶會(huì)緊附于逆膠束的內(nèi)表層; 而疏水酶則位于表面活性劑的疏水尾基區(qū)域.酶分子的溶入過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的. 由于表

26、面活性劑膠團(tuán)的屏蔽作用, 溶于逆膠束中的酶不與有機(jī)溶劑直接接觸, 因而可以有效保持酶的活性；與水相介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)相比,許多水不溶性底物由于在逆膠束聚集體附近和酶分子附近濃度的增加, 從而促使酶催化反應(yīng)速度加快。溫度、 pH 值對(duì)反膠束酶系統(tǒng)的影響在較低的溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高酯轉(zhuǎn)化率升高；溫度超過(guò)40后，轉(zhuǎn)化率隨溫度上升而降低。一方面可能是反膠束結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；另一方面是溫度升高改變了酶的活性構(gòu)象，酶活降低。pH 值不僅決定酶的催化構(gòu)象和其在反膠束體系中的溶解能力等，而且其變化也可能引起酶分子與反膠束膜之間相互作用的改變。與大部分酶相似，脂肪酶最佳發(fā)揮功效的pH約為7.表活濃度對(duì)逆膠束酶反應(yīng)系

27、統(tǒng)的影響在逆膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)中, 通過(guò)改變表面活性劑的濃度, 可實(shí)現(xiàn)對(duì)逆膠束微聚體物理化學(xué)性質(zhì)的調(diào)控, 改變逆膠束體系中酶的溶入量及其活性.逆膠束微聚體的大小取決于增溶水量的多少和表面活性劑的濃度. 如下圖 .當(dāng)表面活性劑濃度很小時(shí), 逆膠束聚集體數(shù)量較少, 系統(tǒng)中的水趨向于普通水性質(zhì), 溶入其中的酶活性相對(duì)較低;而當(dāng)表面活性劑濃度過(guò)大時(shí), 則可能因表面活性劑聚合而引起酶失活現(xiàn)象.因此, 控制表面活性劑的濃度, 使逆膠束微聚體濃度處于適量的范圍, 是優(yōu)化逆膠束微屬性的重要因素之一.反膠束酶催化的應(yīng)用脂肪酶催化合成生物柴油纖維素酶催化的反應(yīng)天然抗氧化劑水解脂肪酶合成生物柴油脂肪酶是一種作用于油水界

28、面上的水解酶，其底物油脂在水中不易分散，需借助于有機(jī)溶劑才能溶解，而酶直接暴露于有機(jī)溶劑中容易實(shí)活，反膠束介質(zhì)提高了脂肪酶的催化活性。劉偉東等采用丁二酸二酯磺酸鈉（AOT反膠束作為酶的催化介質(zhì)，催化大豆色拉油合成生物柴油，并考察了各種因素對(duì)酯轉(zhuǎn)化率的影響。生物柴油：常見的類型為脂肪酸甲酯纖維素酶催化的反應(yīng)王偉偉等采用生物表面活性劑鼠李糖脂制備反膠束體系，與CTAB,SDS,Tween-80作對(duì)比，考察其在該體系中竣甲基纖維素酶對(duì)CMCW過(guò)程特征。結(jié)果表明，無(wú)論是最大增溶水量、還是單位纖維素酶用量下濃度均為1cmc下的產(chǎn)量都表明，生物表面活性劑在構(gòu)建逆膠束體系及增強(qiáng)逆膠束穩(wěn)定性能上具有特殊的潛力

29、。膽甾醇酯酶對(duì)維生素E 醋酸酯的水解袁悅等以卵磷脂、聚乙二醇對(duì)辛基苯基醒為表面活性劑，以溶有維生E醋酸酯（VEA）的不同有機(jī)溶劑為油相制備不同反膠束溶液, 將膽甾醇酯酶溶入制得的反膠束體系使維生素E醋酸酯水解，采用HPLCt測(cè)定水解產(chǎn)物 VE的生成量。實(shí)驗(yàn)證明，卵磷脂 / 膽固醇 / 環(huán)已烷反膠束體系是膽甾醇酯酶催化水解維生素E 醋酸酯的最佳反應(yīng)介質(zhì)。展望酶催化是本世界最具吸引力的課題之一，因?yàn)槊妇哂懈咝В焖伲?用量少等特點(diǎn)。但是，由于酶分子本身對(duì)于有機(jī)溶劑的敏感性，往往制約了酶促反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)展。反膠束體系的出現(xiàn)恰好解決了這個(gè)問(wèn)題，可以讓酶分子在類似于生物體內(nèi)的微水有機(jī)體系中更加好的發(fā)揮其

30、生物活性。但是， 反膠束催化理論的研究畢竟時(shí)間較短，技術(shù)尚未十分成熟，且由于其體系中非均相，多要素的因素，深入研究其作用機(jī)制比較困難。另外，目前，應(yīng)用于反膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)的表面活性劑種類較為有限， 且其在反膠束催化中的機(jī)制依然缺乏深入的探究，這也直接導(dǎo)致反膠束技術(shù)在工業(yè)上的應(yīng)用。 不過(guò)，隨著未來(lái)研究領(lǐng)域的深入， 新理論的建 立與完善，新研究?jī)x器的開發(fā)，新型表面活性劑的面世，這些問(wèn)題都可以得到解決。微水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng).東外皮系統(tǒng) 100%有機(jī)溶劑均相的有機(jī)溶劑體系是指用與水不互溶的有機(jī)溶劑取代所有的溶劑水（98%）,形成固相酶分散在有機(jī)溶劑中的非均相反應(yīng)體系。處于這種體系中的酶， 其表面必須有殘

31、余的結(jié)構(gòu)水，才能保證其催化活性。 一般有機(jī)溶劑中含有小于2%勺微量水。常用的與水不互溶的有機(jī)溶劑有燃類、醛、芳香族化合物、鹵代燃等，它們的疏水指數(shù)（logP）較大。攪拌的作用固相酶在結(jié)構(gòu)上仍是柔性的，酶分子內(nèi)部的柔性足以保證酶和底物結(jié)合時(shí)酶能產(chǎn)生微小 的構(gòu)象變化，形成酶和底物結(jié)合的中間復(fù)合體。酶分子的比表面積約為（13） x106m2-kg-1 ,與活性炭相當(dāng)，酶分子體積的1/32/3是空的，充滿了溶劑，因此足夠的攪拌將保證底物能與酶表面或內(nèi)部的活性中心結(jié)合，并起催化反應(yīng)。一般而言，酶在微水有機(jī)溶劑體系中穩(wěn)定性較好，但催化活力要比水相中低得多，部分原因是因?yàn)槊冈谟袡C(jī)相不溶， 許多酶分子聚結(jié)成團(tuán)

32、，影響了顆粒內(nèi)部酶分子的催化效率。因此，如何保持固態(tài)酶粉在有機(jī)相中的高度分散狀態(tài)，成為激活有機(jī)相酶活力的一項(xiàng)重要課題。酶制劑酶用量(mg/ml)蛋白含量(科 gprotein/mg)初速度(M/min)比活(M.min-1.科 g-1)硬脂酸包被 酶2.00.96353.091.8DG電被酶2.00.79294.493.2硅藻土吸附 酶2.00.2549.649.6NaCl凍干酶10.00.1110.60.9K2SO襁干酶10.00.1130.62.7KCl凍干酶10.00.1119.81.8微晶酶4.00.1673.611.7自由酶2.02.7518.81.7超臨界流體系統(tǒng)除了親脂性有機(jī)溶劑

33、外，超臨界流體（supercriticalfluids） ,如二氧化碳、氟里昂（CF3H）,烷燒類（甲烷、乙烯、丙烷）或無(wú)機(jī)化合物（SF6, N2O悻，都可以作為酶催化親 脂性底物的溶劑，酶在這些溶劑中就像在親脂性有機(jī)溶劑中一樣穩(wěn)定。超臨界流體的粘度介于氣體與液體之間，其擴(kuò)散性比一般溶劑高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。超臨界氣體在臨界點(diǎn)附近的溫度或壓力有一點(diǎn)微小的變化都會(huì)導(dǎo)致底物和產(chǎn)物溶解度的極大 變化，因而很容易調(diào)控超臨界流體中酶催化反應(yīng)的特性，如反應(yīng)速率和選擇性。超臨界流體對(duì)多數(shù)酶都能適用，酶催化的酯化、轉(zhuǎn)酯、醇解、水解、羥化和脫氫等反應(yīng) 都可在此體系中進(jìn)行， 但研究得最多的是水解酶的催化反應(yīng)。這種溶劑

34、體系最大的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)毒、低粘度、產(chǎn)物易于分離。該體系的缺點(diǎn)是需要有能耐受幾十個(gè)兆帕的高壓容器，并且減壓時(shí)易于使酶失活。 此外,有些超臨界流體如二氧化碳可能會(huì)與酶分子表面的活潑基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)而引起酶活性的 喪失離子液體介質(zhì)系統(tǒng)在最近的10年中，離子液體(IonicLiquids,ILs)作為一種新型的反應(yīng)介質(zhì)，被用于各種類型的反應(yīng)，并常常產(chǎn)生顯著的效果，從而引起人們的廣泛注意。離子液體實(shí)質(zhì)上是一些凝固點(diǎn)較低的鹽，例如1-烷基-3-甲基咪陛與PF6或BF4形成的鹽。離子液體作為一類極性溶劑，能溶解許多有機(jī)化合物。與普通有機(jī)溶劑最大的區(qū)別在于：離子液體不會(huì)揮發(fā)(沒(méi)有蒸氣壓)，對(duì)環(huán)境比較友好，用于工業(yè)生產(chǎn)

35、也相對(duì)比較安全；它們與許多有機(jī)溶劑互不相溶，可以形成有機(jī)溶劑-離子液體兩相系統(tǒng)或者有機(jī)溶劑-水-離子液體三相系統(tǒng)，從而為溶劑工程在生物催化反應(yīng)中的應(yīng)用提供了新的可能。一般而言，離子液體通常有三種方式被應(yīng)用于生物催化過(guò)程：作為單一的溶劑；作為共溶劑添加于水相系統(tǒng)中；與水形成兩相系統(tǒng)。生物催化劑離子液體反應(yīng)體系發(fā)表年份大腸桿菌堿性磷酸酯 酶H3NEtNO3對(duì)硝基苯酚磷酸酯水 解1984雞蛋清溶菌酶H3NEtNO3蛋白質(zhì)復(fù)性2000紅球菌R312完整細(xì) 胞BMIMPF6/ 緩沖液1,3-二氟基苯的生物 轉(zhuǎn)化2000面包酵母整細(xì)胞BMIMPF6/ 緩沖液酮的還原2001嗜熱蛋白酶BMIMPF6阿斯巴甜

36、的合成2000-胰凝乳蛋白酶OMIMPF6BMIMPF6N-乙酰-L-苯丙氨酸 乙酯與1-丙醇的轉(zhuǎn) 酯化2001-半乳糖甘酶MMIMMeSO4/buff erN-乙酰氨基乳糖的合 成2002甲酸脫氫酶MMIMMeSO44-MBPyBF4輔酶NADH勺再生2002南極假絲酵母脂肪酶BMIMPF6BMIMBF4醇解、氨解等2000多種脂肪酶BMIMPF6BMIMCF3SO3BMIMBF4BMIM(CF3SO2)2N BMIMSbF6烯醇的動(dòng)力學(xué)拆分2001南極假絲酵母脂肪 酶，洋蔥假單抱菌脂 肪酶數(shù)種離子液體(R,S)-1-苯乙醇的動(dòng) 力學(xué)拆分；葡萄糖的 區(qū)域選擇性酰化2001南極假絲酵母脂肪酶B

37、MIM(CF3SO2)2N在超臨界CO2存在下2002酶促酯化1-辛醇熒光假單抱菌脂肪酶BMIMPF6手性磷化合物的拆分2002無(wú)溶劑或寡溶劑反應(yīng)系統(tǒng)在許多情況下，反應(yīng)系統(tǒng)的最佳選擇可能是根本不用溶劑（即solvent-freesystem ,無(wú)溶劑系統(tǒng)），或者只用很少量的溶劑（littlesolventsystem ,寡溶劑系統(tǒng)）。在至少有一種反應(yīng)物為液體的情況下，反應(yīng)物之間的質(zhì)量傳遞可以通過(guò)流體相進(jìn)行。例如，在用脂肪酶催化各種手性醇的對(duì)映選擇性轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中，經(jīng)常使用過(guò)量的醋酸乙烯酯或醋酸異丙烯酯作為酰基供體，同時(shí)兼作反應(yīng)介質(zhì)（無(wú)需外加溶劑），一般效果非常好，已在工業(yè)規(guī)模廣泛應(yīng)用.非水介質(zhì)系

38、統(tǒng)中的影響因素1溶劑的影響在水溶液中，水分子與維持酶的活力構(gòu)象的主要作用力（包括范德華力、鹽橋、氫鍵等）均有關(guān)系，因此去除蛋白質(zhì)分子周圍的水勢(shì)必會(huì)改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；另一方面，由于水在酶與底物的結(jié)合中起關(guān)鍵作用，因此在非水相環(huán)境中， 酶的底物專一性也將發(fā)生變化。非水溶劑對(duì)酶選擇性的影響人們普遍認(rèn)為分子催化的推動(dòng)力來(lái)自于結(jié)合能。既然酶與底物的結(jié)合能取決于酶-底物復(fù)合體的能量與溶液中酶和底物的能量之差，因此兩者的結(jié)合必然受到溶劑的影響。非水溶劑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響過(guò)去人們一直以為，酶在有機(jī)溶劑中很不穩(wěn)定。這一錯(cuò)誤觀念長(zhǎng)期阻礙了非水相酶學(xué)的發(fā)展。1984年，美國(guó)麻省理工學(xué)院（MIT）的Klibanov教授用一個(gè)非常簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)事實(shí)徹底地 改變了人們對(duì)有機(jī)溶劑中酶穩(wěn)定性的看法。有機(jī)溶劑能增加酶構(gòu)象的剛性，尤其是在低水含量的疏水性有機(jī)溶劑中，從而提高酶的熱穩(wěn)定性。由于疏水溶劑基本上不與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，因此懸浮于疏水介質(zhì)中的蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性通常要高于在親水介質(zhì)中的穩(wěn)定性。酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性與凍干前水溶液的pH鹽的濃度以及是否存在底物類似物等因素有關(guān)。非水溶劑的選擇原則在所有含溶劑的生物催化系統(tǒng)中，溶劑的性質(zhì)會(huì)在很大程度上影響酶的活性、選擇性和穩(wěn)定性。其中起關(guān)鍵作用的是溶劑的極性。降低介質(zhì)的介電常數(shù)將導(dǎo)致酶分子中帶電殘基之間靜電作用力的增加。這可能會(huì)