1、胺基酸之比色定量化學(xué)乙級(jí)技術(shù)士訓(xùn)練教材(1)術(shù)科測(cè)驗(yàn)第一題第二站臺(tái)北市立松山工農(nóng)化工科 謝榮忠製作四.實(shí)驗(yàn)步驟(-3)五.實(shí)驗(yàn)報(bào)告六.評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)四.實(shí)驗(yàn)步驟(-2)一.一.試題簡(jiǎn)介試題簡(jiǎn)介二.二.相關(guān)知識(shí)相關(guān)知識(shí)三.三.實(shí)驗(yàn)器材與藥品實(shí)驗(yàn)器材與藥品四.四.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟(-1)(-1)內(nèi)容大綱內(nèi)容大綱（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ┩瓿蓵r(shí)間（三）操作說明一、試題簡(jiǎn)介1. 學(xué)習(xí)定量試樣中的胺基酸。2. 學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的比色方法。3. 學(xué)習(xí)化學(xué)分析技術(shù)的操作與安全要領(lǐng)。（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜r(shí)三十分（二）完成時(shí)間二氫茚三酮(Ninhydrin)與胺基酸反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生有色物質(zhì)利用此物質(zhì)含量與胺基酸濃度成正比的關(guān)係比色定

2、量試樣中的胺基酸含量。（三）操作說明(一) 呈色反應(yīng)(二) 比色定量(三) 建立檢量線(四) 未知試樣中胺基酸之定量二、相關(guān)知識(shí)在醋酸-醋酸鈉的緩衝溶液存在下，甘胺酸的酒精溶液與二氫茚三酮(Ninhydrin)可生成紫色的化合物。( (一一) )呈色反應(yīng)呈色反應(yīng)1.以純的甘胺酸配製標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.以分光光度計(jì)測(cè)量呈色後的標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)570nm的吸收度。( (二二) )比色定量比色定量-1-13.比耳定律比耳定律(1)透光率(Transmittance)T (I/Io)100%(2)吸收度(Absorbance) Alog(I/Io)(3)比耳定律：一定波長(zhǎng)的光通過發(fā)色物質(zhì)時(shí)，吸收度與濃度及光徑

3、長(zhǎng)度成正比。IoI光徑(b) Aabca：吸光係數(shù)b：光徑c：濃度( (二二) )比色定量比色定量-2-21.以吸收度為橫座標(biāo)，甘胺酸含量(g)為縱座標(biāo)，於方格紙上作圖。 2.利用電子計(jì)算機(jī)的線性迴歸功能計(jì)算檢量線的截距(A)與斜率(B)。( (三三) )建立檢量線建立檢量線-1-13.檢量線方程式 甘胺酸含量(g) = 截距(A) + 斜率(B) 吸收度 ( (三三) )建立檢量線建立檢量線-2-21. 取甘胺酸適當(dāng)量，同標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法呈色。2. 以分光光度計(jì)於相同的吸收波長(zhǎng)下，測(cè)量未知試樣的吸收度。3. 將未知試樣的吸收度代入檢量線方程式，或以作圖法求取甘胺酸的濃度。( (四四) ) 未知

4、試樣的定量未知試樣的定量( (一一) )器材：器材：分光光度計(jì)、水浴、試管架、球形吸量管、刻度吸量管、玻璃珠、量瓶、天平、燒杯。( (二二) )藥品：藥品：甘胺酸、醋酸鈉三水合物、冰醋酸、二氫茚三酮、50%酒精、甘胺酸試樣。三三、 實(shí)驗(yàn)器材與藥品實(shí)驗(yàn)器材與藥品-1-1(三)試劑配製法1.二氫茚三酮：3%(W/V)95%酒精溶液，此試劑於4時(shí)穩(wěn)定時(shí)間約為一個(gè)月，但於室溫則穩(wěn)定性下降，若顏色轉(zhuǎn)綠，則須重新配製。2.甘胺酸試樣：約300500ppm。三、三、 實(shí)驗(yàn)器材與藥品實(shí)驗(yàn)器材與藥品-2-2四、實(shí)驗(yàn)步驟-1( (一一) ) 甘胺酸儲(chǔ)備溶液之配製甘胺酸儲(chǔ)備溶液之配製( (二二) ) 甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

5、之配製甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液之配製(三) 檢量溶液之配製(四) 檢量曲線之製作(五) 未知試樣之定量( (一一) )甘胺酸儲(chǔ)備溶液之配製甘胺酸儲(chǔ)備溶液之配製秤取約秤取約0.10.1克之甘胺酸，溶於去離子水後，稀釋為克之甘胺酸，溶於去離子水後，稀釋為100mL100mL。先以粗秤天平先以粗秤天平秤取約秤取約0.10g0.10g按下分析天平開關(guān)按下分析天平開關(guān)1.精秤-1出現(xiàn)出現(xiàn)0.0000g0.0000g時(shí)時(shí)可開始秤重可開始秤重將稱粗秤過將稱粗秤過的秤量瓶放的秤量瓶放置於托盤上置於托盤上顯示稱量瓶與顯示稱量瓶與試藥的總重試藥的總重1.精秤-2按下按下TARETARE鍵扣除鍵扣除盤上物的重量盤上物的重量將

6、秤量瓶?jī)?nèi)的藥品將秤量瓶?jī)?nèi)的藥品倒入空燒杯內(nèi)倒入空燒杯內(nèi)空秤量瓶放回盤上，顯示的空秤量瓶放回盤上，顯示的重量即燒杯內(nèi)的藥品重重量即燒杯內(nèi)的藥品重1.精秤-3加水溶解加水溶解固體試藥固體試藥將燒杯內(nèi)的溶液將燒杯內(nèi)的溶液倒入量瓶?jī)?nèi)倒入量瓶?jī)?nèi)2.配成配成100mL-1潤(rùn)洗燒杯，將潤(rùn)潤(rùn)洗燒杯，將潤(rùn)洗液移入量瓶?jī)?nèi)洗液移入量瓶?jī)?nèi)以洗瓶補(bǔ)充以洗瓶補(bǔ)充去離子水去離子水以吸管加水以吸管加水至刻度至刻度2.配成配成100mL-2使液面的半月使液面的半月型下緣與量瓶型下緣與量瓶的刻度線切齊的刻度線切齊搖動(dòng)搖動(dòng)2020下使下使混合均勻混合均勻2.配成配成100mL-31.1.取取25mL25mL稀釋至稀釋至250mL2

7、50mL為標(biāo)準(zhǔn)溶液。為標(biāo)準(zhǔn)溶液。 ( (二二) )甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液之配製甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液之配製將儲(chǔ)備液倒將儲(chǔ)備液倒入燒杯中入燒杯中轉(zhuǎn)動(dòng)燒杯潤(rùn)洗，廢液轉(zhuǎn)動(dòng)燒杯潤(rùn)洗，廢液倒入廢液杯內(nèi)倒入廢液杯內(nèi)1.稀釋-1以吸量管以吸量管吸取溶液吸取溶液水平轉(zhuǎn)動(dòng)吸水平轉(zhuǎn)動(dòng)吸量管潤(rùn)洗量管潤(rùn)洗將潤(rùn)洗液移入將潤(rùn)洗液移入廢液杯內(nèi)廢液杯內(nèi)1.稀釋-2以吸量管以吸量管精確吸取精確吸取溶液溶液將儲(chǔ)備將儲(chǔ)備液移入液移入另一量另一量瓶?jī)?nèi)瓶?jī)?nèi)以洗瓶補(bǔ)充水以洗瓶補(bǔ)充水至刻度下方約至刻度下方約2 2公分處公分處1.稀釋-3翻轉(zhuǎn)搖動(dòng)約翻轉(zhuǎn)搖動(dòng)約2020次次使混合均勻使混合均勻以滴管補(bǔ)充以滴管補(bǔ)充水至刻度水至刻度1.稀釋-42. 醋酸緩衝溶液(

8、2M，pH5.2) ：秤取19克之醋酸鈉(CH3COONa3H2O) ，溶於50mL去離子水後，加3.6mL冰醋酸，以去離子水稀釋至100mL備用。(1)稱重以上皿天平秤以上皿天平秤取約取約19g19g2.配製緩衝溶液-1(2)配成緩衝溶液加50mL去離子水溶解固體2.配製緩衝溶液-2以刻度吸量管吸取3.6mL冰醋酸加入燒杯中以量筒量取50mL去離子水加入燒杯中2.配製緩衝溶液-3(一)甘胺酸儲(chǔ)備溶液之配製(二)甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液之配製( (三三) )檢量溶液之配製檢量溶液之配製(四)檢量曲線之製作(五)未知試樣之定量四、實(shí)驗(yàn)步驟-21.取取7根試管分別編號(hào)根試管分別編號(hào)1至至7 。 取甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)

9、取甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)液液0.2，0.3，0.5，0.7，0.8及及1.0mL，分別，分別加入加入1至至6號(hào)之試管內(nèi)，第號(hào)之試管內(nèi)，第7號(hào)試管作為空號(hào)試管作為空白試驗(yàn)。白試驗(yàn)。 ( (三三) ) 檢量溶液之配製檢量溶液之配製1.精取標(biāo)準(zhǔn)溶液-1取7支試管，編號(hào)，取一燒杯以標(biāo)準(zhǔn)液潤(rùn)洗1.精取標(biāo)準(zhǔn)溶液-2捨棄潤(rùn)洗液取1mL刻度吸量管以標(biāo)準(zhǔn)液潤(rùn)洗1.精取標(biāo)準(zhǔn)溶液-3吸取0.2mL標(biāo)準(zhǔn)液加入第一支試管2.取適當(dāng)體積之去離子水，加入各試管內(nèi)，使取適當(dāng)體積之去離子水，加入各試管內(nèi)，使其總體積為其總體積為1mL。2.調(diào)整體積為1mL-12.調(diào)整體積為1mL2.調(diào)整體積為1mL-2以刻度吸量管吸入去離子水使試管內(nèi)溶液的

10、總體積為1mL3.取取0.5mL之醋酸緩衝液及之醋酸緩衝液及0.5mL之二氫茚三酮試之二氫茚三酮試劑於各試管中充分混合後蓋上小玻璃珠。劑於各試管中充分混合後蓋上小玻璃珠。3.加呈色劑-13.加呈色劑-23.加呈色劑-23.加呈色劑-2倒緩衝溶液入燒杯中以0.5mL球形吸量管吸取緩衝溶液3.加呈色劑-3加緩衝溶液入每一支試管內(nèi)以0.5mL球形吸量管吸取呈色劑3.加呈色劑-4加呈色劑入每支 試管內(nèi)每支試管蓋上玻璃珠3.加呈色劑-5小心搖均勻4.4.將各試管置於試管架內(nèi)，並放入沸水浴中，將各試管置於試管架內(nèi)，並放入沸水浴中，加熱至沸騰，並繼續(xù)維持加熱至沸騰，並繼續(xù)維持1515分鐘。分鐘。4.煮沸-1

11、恆溫水槽4.煮沸-2將試管置入恆溫槽中加熱煮沸15分鐘5.取出試管置於冷水浴中冷卻後，加入取出試管置於冷水浴中冷卻後，加入10mL的的50%酒精，充分混合酒精，充分混合。5.加入酒精-1冷水浴中冷卻5.加入酒精-2以10mL球形吸量管吸取酒精加入每支試管中5.加入酒精-3以玻棒攪動(dòng)使混合均勻靜置30分鐘(一)甘胺酸儲(chǔ)備溶液之配製(二)甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液之配製(三)檢量溶液之配製( (四四) )檢量曲線之製作檢量曲線之製作( (五五) )未知試樣之定量未知試樣之定量四、實(shí)驗(yàn)步驟-31.1.於於570nm570nm波長(zhǎng)測(cè)定各溶液之吸收度。波長(zhǎng)測(cè)定各溶液之吸收度。( (四四) )檢量曲線之製作檢量曲線之

12、製作打開電源，預(yù)打開電源，預(yù)熱熱3030分鐘分鐘將濾光鏡選擇桿將濾光鏡選擇桿調(diào)到正確位置調(diào)到正確位置1)1)儀器歸零儀器歸零1.測(cè)吸收度-1調(diào)整波長(zhǎng)選調(diào)整波長(zhǎng)選擇鈕至擇鈕至570nm570nm打開比色槽蓋打開比色槽蓋子，取出比色子，取出比色管，蓋上蓋子管，蓋上蓋子轉(zhuǎn)動(dòng)歸零鈕使轉(zhuǎn)動(dòng)歸零鈕使透光率為透光率為0.00.05700.0TRANSMITTANCE取一支乾淨(jìng)的取一支乾淨(jìng)的比色管，加入比色管，加入去離子水去離子水2)2)調(diào)靈敏度調(diào)靈敏度以拭鏡紙將比以拭鏡紙將比色管表面拭淨(jìng)色管表面拭淨(jìng)將比色管置入比將比色管置入比色槽內(nèi)，注意刻色槽內(nèi)，注意刻度線對(duì)齊度線對(duì)齊轉(zhuǎn)動(dòng)靈敏度鈕至轉(zhuǎn)動(dòng)靈敏度鈕至透光率為透

13、光率為100%100%另取一支乾淨(jìng)的比色另取一支乾淨(jìng)的比色管，加入第一瓶檢量管，加入第一瓶檢量溶液，潤(rùn)洗比色管溶液，潤(rùn)洗比色管潤(rùn)洗液倒?jié)櫹匆旱谷霃U液杯入廢液杯3)3)測(cè)吸收度測(cè)吸收度將比色管將比色管置入比色置入比色槽內(nèi)槽內(nèi)加入檢量加入檢量溶液至上溶液至上方記號(hào)處方記號(hào)處以拭鏡以拭鏡紙將比紙將比色管擦色管擦拭乾淨(jìng)拭乾淨(jìng)ABSORBANCE按按MODEMODE鍵使功能顯示為鍵使功能顯示為ABSORBANCE(ABSORBANCE(吸收度吸收度) )顯示吸收顯示吸收度的值度的值2. 以最小平方法計(jì)算甘胺酸量與吸收度之關(guān)以最小平方法計(jì)算甘胺酸量與吸收度之關(guān)係及相關(guān)係數(shù)。係及相關(guān)係數(shù)。2.線性回歸1.1

14、.取取甘甘胺酸試樣溶液適當(dāng)量依同法求出胺酸試樣溶液適當(dāng)量依同法求出570nm波長(zhǎng)之吸收度後計(jì)算試樣中之甘波長(zhǎng)之吸收度後計(jì)算試樣中之甘胺酸濃度胺酸濃度(mg/L) 。( (五五) ) 未知試樣之定量未知試樣之定量(一)甘胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液之配製： 甘胺酸之秤取量：_101.8_mg，標(biāo)準(zhǔn)甘胺酸溶液之濃度：_101.8_ mg/L。寫出計(jì)算式：)mL/g8 .101(L/mg8 .101mL250mL25L1mL1000mL1001mg8 .101標(biāo)準(zhǔn)甘胺酸溶液之濃度 五、 實(shí)驗(yàn)報(bào)告-1稀釋倍數(shù)(二)檢量曲線之製作1. 將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)填入試管號(hào)碼123456空白甘胺酸量(g)20.36 30.54 50.9

15、071.2681.44101.80吸收度0.161 0.238 0.3950.5510.6290.7900.003淨(jìng)吸收度0.158 0.235 0.3920.5480.6260.7870.000註：甘胺量之計(jì)算，以第1瓶為例： 101.8 g/mL 0.20mL = 20.36 g2.檢量曲線之製作：以最小平方法計(jì)算甘胺酸量與吸收度之關(guān)係及相關(guān)係數(shù)甘胺酸量(g) _129.70_吸收度(-0.0205)_ R0.9998五、 實(shí)驗(yàn)報(bào)告-2標(biāo)準(zhǔn)液濃度AB(三)試樣之定量(編號(hào)： )取甘胺酸試液10mL，稀釋至50mL，即稀釋倍數(shù)5試管號(hào)碼稀釋試液體積吸收度淨(jìng)吸收度甘胺酸( ug )原試樣濃度平均值80.500.3270.32442.04420.4424.691.000.6640.66185.75428.8mL/g6 .4242/ )8 .4284 .420(mL/g8 .4285mL00. 11g75.85g75.850205. 0661. 070.1299#mL/g