1、四個階段：一、以導致遺傳病的基因突變位點為靶標，以DNA分子雜交為核心二、以PCR技術為核心三、以生物芯片為核心四、以DNA測序技術為核心廣義：分子標志物包括基因組DNA、各種RNA、蛋白質和各種代謝物臨床分子生物學檢驗靶標主要以核酸（DNA和RNA）為主基因組DNA是臨床分子生物學檢驗中最常用的分子靶標病原生物基因1.菌種鑒定：PCR-M序和PCR-DNA探針雜交；縮短檢測時間2 .確定病毒感染和病毒載量：明確感染源，判斷病情，監(jiān)測療效3 .病毒分析：基因型變異產(chǎn)生不同臨床癥狀4 .細菌耐藥監(jiān)測和分子流行病學調查：隨機擴增多態(tài)性DNA；指導選擇治療方案，控制病原菌的感染傳播基因變異1.致病基

2、因的分子缺陷2.線粒體基因突3.腫瘤相關基因單基因病1.致病基因結構發(fā)生了改變，影響了編碼產(chǎn)物量和質的改變，如血紅蛋白病、血友病、Duchenne肌營養(yǎng)不良等。2.致病基因中核苷酸三聯(lián)體重復序列發(fā)生高度擴展，如脆性X綜合征、亨廷頓病、強直性肌營養(yǎng)不良等?；蚨鄳B(tài)性用于：1.基因定位和疾病相關性分析2.疾病診斷和遺傳咨詢3.多基因病的研究4.器官移植配型和個體識別循環(huán)游離核酸檢測（包括游離DNA和游離RNA）用于：產(chǎn)前診斷、惡性腫瘤早期診斷、病例檢測臨床分子生物學檢驗技術以分子雜交技術、PCR技術和DNA測序技術、芯片技術、雙向電泳技術、生物信息學技術為主要技術分子生物學檢驗技術可用于微生物感染

3、的確診、感染性病原體的分型、耐藥監(jiān)測。分子生物學檢驗技術有利于臨床上對遺傳性疾病的早期預防、早期診斷、早期治療。重要國際生物信息中心：1.美國國立生物技術信息中心（NCBI）2.歐洲生物信息學研究所（EBI）3.日本國立遺傳研究所（DDBJ）一級核酸數(shù)據(jù)庫有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白質序列數(shù)據(jù)庫有SWISS-PROT、PIR、UNIPROT等。蛋白質X射線晶體三維結構數(shù)據(jù)庫有PDB等。蛋白質數(shù)據(jù)庫常用的有SWISS-PROT、PIR、PDB數(shù)據(jù)庫。二級數(shù)據(jù)庫非常多，如人類基因組圖譜庫GDB、轉錄因子和結合位點庫TRANSFAC、蛋白質結構家族庫SCOP等。*乙型肝炎病毒核酸的檢測

4、常用技術：1.普通PCR技術2.熒光定量PCR技術3.支鏈DNA技術4.核酸雜交技術5.雜交捕獲系統(tǒng)6.基因芯片技術*HBV基因分型的方法：1,PCR-RFLP2.PCR-RBD3.ELISA4.基因芯片人乳頭瘤病毒基因組結構：HPVDNA為一雙鏈閉環(huán)分子，基因組可分三個區(qū)段：早期區(qū)（E）、晚期區(qū)（L）、長控制區(qū)或上游調節(jié)區(qū)或非編碼區(qū)。*HPVDNA檢測及基因分型：1.核酸雜交技術（主要包括核酸印跡、原位雜交、雜交捕獲等技術。目前常采用HCII技術、核酸分子雜交與PCR相結合的方法。具有較強的特異性，并可分型）2.PCR技術*（采用型特異性引物進行HPV快速分型，現(xiàn)已成為HPV感染最常用的檢測

5、方法之一。目前常用通用引物-PCR（GP-PCR）和實時定量PCR。1.GP-PCR,依據(jù)不同HPV亞型有共同保守序列的特點來設計通用引物，可廣譜擴增HPVDNA，具有較高的敏感性，可檢測出10-400拷貝的HPV病毒含量。在GP-PCR的基礎上，建立了巢式PCR和巢式多重PCR檢測HPVDNA。提高了檢測敏感性和多重感染率。2.實時定量PCR法，該法可實現(xiàn)HPVDNA定量和快速檢測。現(xiàn)在市售產(chǎn)品可以檢測E6和E7的mRNA；進行HPV16、18、31、33與45分型。檢測靈敏度高，但設備昂貴，操作繁瑣，不適于宮頸癌的大規(guī)模篩查。）3.基因芯片技術（基因芯片可對HPV進行分型和多重感染診斷，適

6、于高通量HPV篩查）4.流式熒光液芯技術5.飛行時間質譜技術臨床意義：（一）宮頸疾病風險預測（二）療效評估及術后跟蹤（三）預防控制和疫苗研發(fā)*HIV-1基因組中，gagpol、env為結構基因，編碼病毒核心蛋白（gag）多聚酶（pol）、和外膜蛋白（env）。vpr、rev、vif、tat、vpu/vpx、nef等6個基因為調控基因，編碼調控蛋白和輔助蛋白。核酸序列依賴擴增（NASBA）是一種等溫擴增RNA的技術，能直接擴增單鏈RNA特異序列，通過合成cDNA，在等溫條件下進行體外序列特異性核酸擴增。NASBA需要AMV逆轉錄酶、核糖核酸酶H、噬菌體T7RNA聚合酶共同作用完成。NASBA分非

7、循環(huán)相（模板RNA與引物I互補）和循環(huán)相（轉錄的反義RNA與引物n互補兩個階段流行性感冒病毒核酸檢測：主要有RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、基因芯片、逆轉錄-環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）等。結核分枝桿菌核酸的檢測:1.PCR2.Real-timePCR3.PCR-RFLP4線性探針雜交法.（LPA）5.鏈替代擴增技術（SDA）6.擴增結核分枝桿菌直接試驗（AMTDT）7.基因芯片技術8.GeneXpert全自動結合檢測平臺結核分枝桿菌的耐藥性檢測:（1）DNA測序（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）PCR-RDB（5）基因芯片技術淋病奈瑟菌核酸的檢測：1.PCR2實時

8、熒光定量PCR技術3.連接酶鏈反應4連替代擴增技術（SDA）淋病奈瑟菌的主要耐藥基因：（1）gyrA和parC基因（2）penA、ponA基因（3）porB基因（4）Mtr系統(tǒng)調控基因（5）erm基因淋病奈瑟菌耐藥檢測的分子生物學技術:（1）DNA測序（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）基因芯片技術*醫(yī)院細菌感染的常用分子生物學檢驗技術：1.脈沖場凝膠電泳（PFGE）被認為是菌株分子分型的“金標準”2.PCR-RFLP3.擴增限制性片段長度多態(tài)性分析（AFLP）4.重復序列PCR5.隨機擴增多態(tài)性DNA技術6.多位點測序分型白假絲酵母菌的分子生物學檢驗：1.PCR普通PCR、實時

9、PCR、巢式PCR和多重PCR等2.PCR-S點雜交3.DNA指紋技術，包括RFLP、隨即擴增多態(tài)性分析（RADP）、電泳核型分析等4.AP-PCR5.DNA序列分析6.基因芯片技術新型隱球菌的分子生物學檢驗：1.PCR2.斑點雜交3.PCR-RFLP沙眼衣原體的分子生物學檢驗：1.PCR2.連接酶鏈反應3.DNA序列分析肺炎衣原體的分子生物學檢驗：PCR、實時熒光定量PCR技術、巢式PCR和競爭性PCR肺炎支原體的分子生物學檢驗：1.PCR2.核酸雜交，探針有特異性DNA片段探針、人工合成的寡核苷酸探針、全DNA探針。常用斑點雜交。3.PCR-RFLP梅毒螺旋體的分子生物學檢驗：1.PCR2

10、.核酸雜交3.PCR-RFLP分子生物學檢驗可早期診斷患者的梅毒感染，及時治療，防止病情惡化與蔓延。另外是耐藥基因分析和流行病學研究的首選方法。弓形蟲DNA主要有三種形式：染色體DNA、線粒體DNA、和胞質DNA利用分子生物學技術已檢出弓形蟲的主要基因有B1基因、P22基因（SAG2）、P30基因（SAG1）、P43（SAG3）和棒狀體蛋白1（ROP1）等。分生檢測：1.PCR主要側重檢測B1基因和P30基因。2.斑點雜交a珠蛋白合成障礙性貧血的分子生物學檢驗1.PCR2.SouthernER跡雜交3.AS-PCR4.SSCP5.gap-PCRB珠蛋白生成障礙性貧血的分子生物學檢驗：PCR-R

11、DB、PCR-RFLP、基因芯片、PCR-ASO、AS-PCR編輯版 word血友病B的分子生物學檢驗：直接檢測法有Southern印跡雜交、DNA測序、基因芯片和毛細管電泳；間接檢測方法有RFLP、SSCP變性梯度凝膠電泳（DGGE）、雙脫氧指紋圖譜、變性高效液相色譜（DHPLC）。脆性X綜合征的分子生物學檢驗：（一）Southern印跡雜交（二）PCR（三）微衛(wèi)星序列分析通過分子診斷FMR-1基因突變開展患者判定、攜帶者篩查、產(chǎn)前診斷和群體篩查等。腫瘤相關的基因：原癌基因、抑癌基因、細胞周期調節(jié)基因、細胞凋亡基因以及維持細胞基因組穩(wěn)定性基因等。細胞周期調節(jié)基因：周期蛋白（cyclins）、

12、周期蛋白依賴性激酶（CDKs）、CDK抑制因子（CKIs）及細胞周期檢查點等其他蛋白細胞凋亡相關基因可分三類：促細胞凋亡基因、抑制細胞凋亡基因、細胞凋亡過程中表達的基因。p53是研究的較為充分的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系明確的抑癌基因，絕大多數(shù)腫瘤都伴有p53基因的突變。乳腺癌（17號染色體長臂上）的發(fā)生、發(fā)展緊密聯(lián)系的基因有BRCA1、BRCA2、TP53、c-erbB2、c-Myc、P53、Bcl-2、BAX、iASPP、ATM、MDM-2以及PTEN等乳腺癌的分子生物學檢驗：1.雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）檢測（免疫組織化學）2.c-erbB-2/HER2檢測（免疫組化、熒光原位雜交

13、）3.PS2檢測4.Ki67檢測5.乳腺癌復發(fā)基因檢測（DNA微集陣列技術、多基因RT-PCR定量檢測技術）（70基因檢測方法、21基因檢測方法）遺傳性結直腸癌相關基因：結腸腺瘤性息肉病（APC）基因、DNA錯配修復（MMR）基因、微衛(wèi)星異常微衛(wèi)星異常主要表現(xiàn)為：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）;微衛(wèi)星雜合性丟失（LOH）。結直腸癌的分子生物學檢驗：1.HNPCC的篩查2.微衛(wèi)星異常檢測3.APC基因突變檢測4.DCC基因突變檢測5.DNA甲基化的檢測6.結直腸癌個體化治療的相關檢測白血病相關基因突變：C-KIT、FLT3、NPM（核仁磷酸蛋白）、N-RAS、NOTCH1白血病相關基因表達異常：WT1

14、、HOX11、白血病融合基因。（WT1可作為不伴特異分子異常的AML微小殘留白血?。∕RD）的理想檢測指標）白血病的分子生物學檢驗：FISH、PCR、RT-PCR、實時定量PCR（FISH適于多種臨床標本，但靈敏度不及PCR,主要用于初診和復發(fā)的檢測。）線粒體12SrRNA基因的A1555G和C1494T突變是導致氨基糖甘類抗生素耳毒性的主要分子致病基礎。tRNASer（UCN）T7511c等突變則與非綜合征型耳聾相關；而tRNALeu（UUR）A3243G等突變可導致綜合征型耳聾。耳聾相關的mtDNA突變的檢測：1.PCR-RFLP2.DHPLC3.DNA測序4基因芯片LHON（Leber遺

15、傳性視神經(jīng)病變）相關的mtDNA突變位點的檢測方法有PCR-RFLP、PCR-SSCPDHPLC、DNA測序、熒光定量PCR、AS-PCR、及基因芯片等tRNALeu（UUR）A3243G仍是目前國際上唯一公認的線粒體糖尿病致病突變線粒體糖尿病的分子生物學方法：PCR-DHPLC、PCR-RFLP、PCR-U序、熒光定量PCR、基因芯片等。染色體結構異常類型有缺失、重復、倒位、等臂染色體、環(huán)狀染色體、易位等類型。染色體疾病常用的分子生物學檢驗技術：FISH、MLPA、CGH、無損傷產(chǎn)前染色體病分子生物學檢驗技術藥物相關基因分類：藥物作用靶點相關基因、藥物代謝酶基因（CYP450、N-乙?；D移

16、酶）、藥物副反應相關基因植入前遺傳學診斷（PGD）:PCR及其相關技術、多色熒光原位雜交技術、全基因組擴增及基因芯片等相繼應用于PGD。PGD最早適用于包括性別診斷、某些單基因遺傳病、染色體結構與數(shù)目異常等植入前遺傳學診斷（PGD）常用的分子生物學技術：單細胞PCR技術、熒光原位雜交、植入前遺傳學單倍型分析（PGH）技術、非整倍體篩選（PGS）分子生物學技術在HLA分型中的應用（DNA分型技術）：1.RFLP與PCR-RFLP技術2.PCR-SSCPK術3.測序技術4.PCR-SSO支術5.PCR-SSPK術6基因芯片技術7.流式細胞儀技術8.氨基酸殘基配型標準分型技術測序技術（是最可靠、最直

17、接、最準確的HLA分型方法）法醫(yī)物證學主要內容包括：個體識別、親子鑒定、性別鑒定、種族和種屬認定。核酸標志物存在多種不同的形式，包括基因突變位點、基因多態(tài)性位點、等位基因、mRNA、mircoRNA、線粒體DNA、病原生物基因組DNA、DNA甲基化位點和循環(huán)核酸等。熒光原位雜交技術（FISH）的原理：將標記的核酸探針變性后，利用探針與被檢樣本上已變性的靶核酸序列在退火溫度下復性，進行分子雜交，對大的靶序列（>1kb）采用直接標記的熒光探針，對于小的靶核酸序列以及弱雜交信號通過生物素或地高辛標記核酸探針，在用熒光標記的配體（如抗體）進行雜交信號放大，最后用熒光顯微鏡觀察熒光信號，在不改變被

18、檢標本（即維持其原位）的情況下對靶核酸序列進行定位、定性與半定量分析。（用于FISH的探針可以是DNA或RNA,核酸探針的標記方法可用缺口翻譯法、隨機引物法、PCR法或體外轉錄法）FISH是一種非放射性原位雜交，其原理是將標記了熒光的探針與固定在載玻片上細胞染色體或染色質的特異部位進行原位雜交，然后用熒光顯微鏡在不同波長的激發(fā)光下觀察，判斷特定染色體的數(shù)目或其存在或缺失的情況。具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。熒光原位雜交技術的方法特點：1.簡便、穩(wěn)定、直觀、省時2.檢測結果的局限性FISH檢測的一般過程標本玻片的制備；標本預處理；探針和標本的變性；原位雜交；雜交后的洗滌和復染；FIS

19、H信號分析。多重連接依賴性探針擴增（MLPA）:利用多重PCR擴增反應檢測與探針雜交和連接反應的組合，可在同一反應管內同時檢測被檢樣本4050個不同的DNA或RNA序列的拷貝數(shù)變化。MLPA技術的原理：樣本的每個被檢測位點包括兩個特異的寡核甘酸片段探針，一個由化學合成（5'端探針，如圖1A和2A）,另一個通常經(jīng)M13噬菌體衍生法制備（也可由化學合成法合成，探針設計略有不同）的探針（3'端探針，1B和2B）,5'端探針包括探針5'端一段通用引物序列X和一段探針的3'端與靶序列雜交的特異性序列，而3'端探針包括始于探針5'端的一段與靶序列雜交特異性序列、中間的填充序