1、山東農業(yè)大學碩士學位論文轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響 姓名:郭文文申請學位級別:碩士專業(yè):土壤學指導教師:諸葛玉平;李建勇20100612山東農業(yè)大學碩士學位論文摘 要隨著科學技術的發(fā)展,轉基因技術已經(jīng)涉及到我們生活的方方面面, 轉基因植物的普遍種植對土壤理化性質及生物學特性的影響也逐漸引起 人們的重視。本試驗采用室內模擬和盆栽試驗相結合的方法,分別以轉抗線蟲基 因、轉耐貯基因番茄和普通番茄為試材,研究了轉基因番茄栽培過程及 其秸稈等殘體分解對土壤微生物量碳、土壤微生物數(shù)量、土壤酶活性以 及土壤養(yǎng)分含量等的影響,并初步研究了轉耐貯基因對番茄的養(yǎng)分吸收 的影響。主要研究結果如下:1

2、.轉基因番茄秸稈殘留物對土壤生物學性質具有一定的影響。添加 低量(2%轉抗線蟲基因番茄秸稈,在降解前期顯著提高了土壤脲酶活 性,后期顯著提高了土壤微生物量碳含量,對細菌和放線菌數(shù)量均無顯 著影響,對真菌數(shù)量僅在第二個取樣時期有顯著提高的作用;添加高量 (4%轉抗線蟲基因番茄秸稈,初期顯著提高脲酶活性,末期則顯著降 低其活性,僅在前期對細菌、真菌、放線菌的數(shù)量具有顯著性影響。在 兩種秸稈添加量下,對蔗糖酶活性均無顯著影響。2.與普通番茄相比,種植轉耐貯基因番茄對土壤脲酶活性無顯著影 響,初期顯著提高了土壤堿性磷酸酶活性,中期顯著降低了土壤過氧化 氫酶活性。轉耐貯基因番茄顯著降低了土壤真菌數(shù)量,其

3、中苗期降低幅 度最大,與普通相比降低了 31.82%,某些取樣時期顯著地降低了土壤細 菌數(shù)量,而對土壤中放線菌的數(shù)量無一致性影響規(guī)律。3.在高施肥量條件下,轉耐貯基因番茄在初期提高了土壤速效鉀含 量,其余時期均降低土壤速效鉀含量,對土壤銨態(tài)氮含量無顯著影響, 在番茄生長初期和末期降低了土壤速效磷含量;在中量施肥條件下,轉 耐貯基因番茄在初期顯著提高了土壤銨態(tài)氮、速效磷和速效鉀含量;在 低量施肥條件下,轉耐貯基因番茄在盛花期顯著降低了土壤銨態(tài)氮、速 效磷以及速效鉀含量;不施肥時,種植轉耐貯基因番茄對土壤硝態(tài)氮含 量無顯著影響,土壤速效磷和速效鉀含量在初期均顯著降低,在末期均 顯著升高。1轉基因番

4、茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響4.轉耐貯基因番茄在不同的肥力水平下對養(yǎng)分有不同的吸收特征。 與普通番茄相比,施肥量高時,整個生長期內番茄植株對全氮的吸收無 明顯差異,末期顯著降低了對磷的吸收,提高了對鉀的吸收。中量施肥 時,對磷和鉀的吸收均無顯著影響,僅在結果初期顯著降低了全氮含量。 低量和不施肥條件下,對全氮的含量均無顯著影響,而對磷和鉀的吸收 均在前期顯著提高,盛果期顯著降低。關鍵詞:轉基因作物;番茄;秸稈;土壤微生物量碳;土壤酶活性;土 壤微生物;養(yǎng)分吸收2山東農業(yè)大學碩士學位論文Effect of Transgenic Tomato on Soil Biological Chara

5、cteristics and Nutrients AbsorptionAbstractWith development of science and technology, transgenic technology has been involved in many aspects of our lives. Effects of transgenic crops on soil physical, chemical and biological properties have gradually drawn peoples attention.In this paper, lab simu

6、lated experiment and pot experiment were conducted, with tomato with nematode-resistance gene, shelf stable tomato and ordinary tomato as materials, to systematically study the effects of transgenic tomato and their straw decomposition on soil microbial biomass carbon, number of soil microbe, soil e

7、nzymatic activity, as well as the content of soil nutrients. And effect of tomato with stockpile gene to nutrient absorption were studied tentatively. The main results are as follows:1. Residues of transgenic tomato straw had some effects on soil biological properties. When adding low amount of toma

8、to straw with nematode-resistance gene (2%, at early stage, soil urease activity was significantly higher than that in ordinary treatments, and at late stage, soil microbial biomass carbon was significantly higher than that in ordinary treatments. During the whole time, there were no significant dif

9、ferences in the number of bacteria and actinomycete between the two treatments, and in the second sampling time, soil fungal number was significant higher in nematode resistance treatments than that in ordinary treatments. When adding high amount of tomato straw with nematode-resistance gene (4%, so

10、il urease activity in nematode resistance treatments was significantly increased at early stage, while the activity was significantly decreased at late stage. Only at early stage, were there significant effects on the numbers of bacteria, fungus and actinomycete in nematode resistance treatments. Wh

11、ether applied low or3轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響high amount of straw, there was no significant effects on soil invertase activity.2. Compared to ordinary tomato, transgenic treatment had no significant effect on soil urease activity. At early stage, soil alkaline phosphatase activity was significantly inc

12、reased in transgenic treatments, and at middle stage, soil hydrogen peroxidase activity was significantly decreased. In the whole cultivation period, transgenic treatments reduced the number of fungi significantly, and at seeding stage, the number of fungi reduced most and reduced 31.82% compared wi

13、th ordinary treatments. Transgenic treatments reduced the number of bacteria in some sampling times. There was no significant difference in soil actinomycetic number between the two treatments.3. With high level of fertilizer, transgenic tomato increased the content of soil available K significantly

14、 at early stage, while in the other sampling time the content of soil available K decreased significantly. Transgenic tomato had no significant effect on the content of soil ammoniacal nitrogen with high level of fertilizer, and reduced the content of soil available P in the first and last periods;

15、With middle level of fertilizer, transgenic tomato increased the content of soil ammoniacal nitrogen, soil available P and soil available K significantly; With low level of fertilizer, transgenic tomato reduced the content of soil ammoniacal nitrogen, soil available P and soil available K significan

16、tly at full-bloom stage; With no fertilizer, transgenic tomato had no significant effect on the content of soil nitrate nitrogen, and the content of soil available P and soil available K were reduced significantly at first stage but were increased significantly at last stage.4. Transgenic tomato had

17、 different nutrient absorption properties wuth different fertilization levels. Compared to ordinary tomato, with high level of fertilizer, there was no significant effect on the content of plant total N in transgenic tomato in the whole cultivation period. Transgenic tomato reduced the absorption of

18、 total P but increased the absorption of total K significantly at4山東農業(yè)大學碩士學位論文last stage. With middle level of fertilizer, in the whole cultivation period, there were no significant effects on the absorption of total P and total K. At young fruit period, transgenic tomato reduced the content of plan

19、t total N significantly; With low level of fertilizer and no fertilizer, transgenic tomato had no significant effect on the content of plant total N. The content of plant P and total K were increased significantly in transgenic tomato at first stage but reduced at full fruit period.Key Words: Transg

20、enic crops; Tomato; Straw; Soil microbial biomass carbon; Soil enzyme activity; edaphon; nutrient absorption5符號或縮略詞說明縮寫 英文 中文說明 APA Alkaline phosphatase activity 堿性磷酸酶活性 HPA Hydrogen peroxidase avtivity 過氧化氫酶活性 IA Invertaseactivity蔗糖酶活性 UA Ureaseavtivity 脲酶活性 h hour 小時g Gram 克kg Kilogram 千克mg Millig

21、ram 毫克cm Centimeter 厘米mm Millimeter 毫米L Liter 升ml Milliliter毫升Avail. Available 有效的OM Organicmatter 有機質SMBC Soil microbial biomass carbon土壤微生物量碳 K potassium 鉀N nitrogen 氮P phosphorous 磷關于學位論文原創(chuàng)性和使用授權的聲明本人所呈交的學位論文, 是在導師指導下, 獨立進行科學研究所 取得的成果。 對在論文研究期間給予指導、 幫助和做出重要貢獻的個 人或集體,均在文中明確說明。本聲明的法律責任由本人承擔。 本人完全了解

22、山東農業(yè)大學有關保留和使用學位論文的規(guī)定, 同 意學校保留和按要求向國家有關部門或機構送交論文紙質本和電子 版, 允許論文被查閱和借閱。 本人授權山東農業(yè)大學可以將本學位論 文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索, 可以采用影印、 縮印 或其他復制手段保存論文和匯編本學位論文, 同時授權中國科學技術 信息研究所將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫 ,并向 社會公眾提供信息服務。保密論文在解密后應遵守此規(guī)定。論文作者簽名:導 師 簽 名:日 期:轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響1引言轉基因植物是指人們應用重組 DNA 技術, 將外源基因導入植物細胞, 并在其中整合、 表達和傳代,

23、 從而創(chuàng)造出的新型植物 (錢海豐, 等, 2001 。 轉基因技術始于 20世紀 70年代,到 80年代許多基本的操作技術、目的 基因的構建模式等都基本完成,因而水到渠成,誕生了轉基因植物。轉 基因植物的出現(xiàn)是現(xiàn)代分子生物學和植物組織培養(yǎng)技術發(fā)展的結果。隨 著社會的進步以及科學技術的發(fā)展,轉基因生物的生產和應用范圍日益 擴大。轉基因生物已從科學家的實驗室走進了我們的生活,從轉基因棉 花到轉基因大豆,從轉耐貯基因番茄到轉基因禽流感疫苗,都與我們息 息相關(韓梅, 2007 。隨著轉基因作物的商品化和在生產上的大面積種 植,轉基因作物在自然環(huán)境釋放后的潛在生態(tài)風險問題也日益引起人們 的重視(王忠華

24、,等, 2002 。轉基因作物對土壤安全的影響是不容忽視 的,它關系到農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,進而關系到人類的生存。土壤是農業(yè) 生產的基礎,是生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)和能量轉化過程的重要場所,土壤 質量的好壞直接影響到植物的產量和品質,隨著轉基因植物的大規(guī)模種 植,其是否會對土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全產生影響已經(jīng)成為當前研究的新熱 點(錢迎倩, 1999;孫彩霞,等, 2002;王洪興,等, 2002;鄂志國, 等, 2004;張美俊,等, 2005 。1.1轉基因作物的發(fā)展現(xiàn)狀轉基因技術的出現(xiàn)是農業(yè)歷史上的一次重大改革,隨著科學技術的 發(fā)展,轉基因技術在農業(yè)生產中得到了越來越廣泛的應用。 1983年世界 第一例

25、轉基因植物(煙草問世, 1986年轉基因作物(抗蟲和抗除草劑 棉花 進入田間試驗, 1994年第一個轉基因植物產品 延熟番茄 “Flavr Savr” 獲得美國食品與藥物管理局(FDA 批準進入市場(徐征, 2004 。 轉基因作物商業(yè)化種植始于 1996年,當年全世界的種植面積僅為 174萬 hm 2(鄭宇,等, 2003 ,而到 2007年,世界轉基因作物的耕作面積已高6山東農業(yè)大學碩士學位論文達 1.143億 hm2(劉治先,等, 2008 ,短短的十年其普及速度之快是驚 人的,其原因在于轉基因作物具有重要的社會和經(jīng)濟效益。目前,種植 轉基因作物面積較大的 10個國家依次是:美國、 阿根

26、廷、 巴西、 加拿大、 印度、中國、巴拉圭、南非、烏拉圭和菲律賓(劉治先,等, 2008 。世 界轉基因作物包括小麥、水稻、玉米、棉花、油菜、大豆等重要的糧油 和纖維作物,以及蔬菜、水果、牧草和花卉。 2007年世界種植面積最大 的 4種農作物,分別是大豆 5860萬 hm2,占世界作物總面積的 51%;玉 米 3520萬 hm2,占 31%;棉花為 1500萬 hm2,占 13%;油菜則為 550萬 hm2,占 5%。我國作為世界上人口最多的發(fā)展中國家,解決好自身農業(yè)發(fā)展問題 不僅關系到國計民生,同時對世界和平與進步也是一大貢獻。入世后, 我國政府出臺一系列的政策和措施,加強了對農業(yè)植物新品

27、種權的保護。 1996年 12月,農業(yè)部制定的農業(yè)生物基因工程安全管理實施辦法對 轉基因生物技術從試驗研究、中間試驗、環(huán)境釋放和商品化生產各階段 應遵循的原則給予了明確的規(guī)定,并實行申報、審批制度(王玉秋,等, 2003 。我國自 1997年 3月以來,共受理轉基因生物安全評價申請 703項, 批準 517項,申請單位涉及國內科研教學單位 41家,國外公司 2家。批 準環(huán)境釋放的有棉花、大豆、煙草、番茄、甜椒、馬鈴薯、水稻、黃瓜、 楊樹、玉米 10種植物和 4種微生物(楊崇良,等, 2002 ,并批準 6種 轉基因作物進行商品化生產,包括華中農業(yè)大學的轉耐貯基因番茄,北 京大學的轉查爾酮合成酶

28、基因矮牽牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、中國 農科院的抗蟲棉花和美國孟山都公司的保鈴棉(陳章良, 1999 。轉基因作物的應用引起了農業(yè)生產方式的巨大變革和經(jīng)濟效益的大 7轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響幅度提高,并為人類解決人口膨脹、環(huán)境惡化、資源匱乏和效益衰減等 問題提供了一條新的思路和途徑(葉慶富, 2003 。由于導入的目的基因 千變萬化,轉基因作物給人類帶來的好處也多種多樣。轉基因植物目的 基因能在后代中穩(wěn)定遺傳、抗除草劑基因和抗蟲害基因減少了農藥的用 量、轉基因作物為人類帶來客觀的經(jīng)濟效益、利用轉基因作物生產稀有 蛋白等產品、減少化工業(yè)所造成的污染(席景會,等, 2002 。

29、如抗蟲轉 基因棉花不僅可以抵抗棉鈴蟲等害蟲的危害,提高棉花產量,而且因大 量減少了農藥施用量,保護了人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境。中國科學院農 業(yè)政策研究中心研究表明,一般 Bt (轉抗蟲基因棉花比傳統(tǒng)棉花品種 平均增產 9.6%,殺蟲劑使用量降低 60%,不僅減少了環(huán)境污染和對人類 健康的危害,而且還增加了農民的收入。轉基因植物在清除重金屬污染 物方面也有一定的作用。例如,高表達谷骯甘肪合成酶的油菜可以在體 內積累鎘,高表達鋅轉運蛋白的擬南芥菜可以大量積累鋅,因而這些轉 基因植物將有望用于抵抗諸如鎘、鋅等重金屬離子的毒害,并有效清除 環(huán)境中的重金屬污染物(徐征, 2004 。1.2轉基因作物生態(tài)環(huán)

30、境風險評價的意義轉基因作物的產生使得基因交流的范圍無限擴大, 可從細菌、 病毒、 動物、人類、植物甚至人工合成的基因導入作物,人們就有了這樣的疑 慮:轉基因作物的外源基因釋放到環(huán)境中后是否產生嚴重的環(huán)境影響, 這一疑慮使人們憂心忡忡,而消除這種擔心,就要對轉基因作物進行環(huán) 境影響評價。通過環(huán)境影響評價來判斷轉基因作物的田間釋放或者大規(guī) 模商業(yè)化生產對環(huán)境沒有影響,則這些轉基因作物可放心大膽地應用于 農業(yè)生產,如果存在某些問題,則要加以注意,以避免對人類生存與環(huán) 境產生危害(葛大兵, 2004 。1.3轉基因作物生態(tài)環(huán)境風險評價現(xiàn)狀轉基因生物安全,是指防范農業(yè)轉基因生物對人類、動植物、微生 物和

31、生態(tài)環(huán)境構成的危險或潛在風險(陳永紅,等, 2003 。目前存在的 潛在風險主要有:(1轉基因作物可能變?yōu)榫哂星趾π缘摹俺夒s草” ; (2轉基因作物的基因漂移問題; (3害蟲對轉基因作物的抗性; (48山東農業(yè)大學碩士學位論文轉基因作物對非靶標生物的影響(趙和,等, 2003 ; (5轉基因作物對 天敵的影響; (6轉基因作物對土壤生態(tài)安全的影響。美國雜草科學委員會將雜草定義為“對人類行為或利益有害或有干 擾的任何植物” 。 雜草的通性是適應性和可逆性強、 種子休眠、 無限生長、 連續(xù)開花和結籽以及種子擴散 (賈士榮, 2004 , 由于雜草具有以上特征, 所以常常給世界農業(yè)生產造成巨大損失

32、(張永軍,等, 2002 。轉基因作 物是如何導致“超級雜草”的出現(xiàn),一般認為有兩種情況:一是轉基因 作物本身成為“超級雜草” ,二是發(fā)生基因污染,即轉基因作物中的某些 基因漂移到其它植物中而導致其變成“超級雜草” (陸群峰,等, 2009 。 它能入侵和改變其他植物棲息地,而許多性狀的改變都可能增加轉基因 植物雜草化趨勢,例如種子休眠期的改變、種子萌發(fā)率的提高、對有害 生物和逆境的耐受性,以及植株具有的生長優(yōu)勢,都有可能提高轉基因 植物生存和繁殖能力,從而可能導致轉基因植物理論上的雜草化。 目前,對作物雜草化比較一致的觀點是,雜草化是多個基因共同作 用的結果,一個基因的變化不可能導致作物變成

33、雜草。如果一種作物本 身沒有雜草特性,增加一個或幾個基因后雜草化的可能性不大;若該作 物已經(jīng)存在雜草特性, 再增加基因就會進一步提高其雜草化的可能 (Fitter et al.,1990;Boudry et al.,1993 。在農業(yè)生態(tài)環(huán)境條件下,造成植物種類減 少的主要原因是各種強度較大的農業(yè)措施和人類活動的干預,遺傳因素 只起很微小的作用(Bartsch &Schuphan,2002 。Crawley 等在 12種不同的生態(tài)環(huán)境下,對轉基因油菜、玉米、甜菜 和馬鈴薯及其傳統(tǒng)對照品種的命運進行了連續(xù)年的監(jiān)測試驗,沒有一例 轉基因作物比對照活得更長、侵害性更大(Crawley et

34、al.,2000 。 Swea 等 的研究也表明,轉抗除草劑基因作物在自然界條件下與普通作物沒有區(qū) 別。上述試驗涉及的外源基因是抗除草劑和抗蟲的,它們在自然生態(tài)環(huán) 境下缺乏相應的選擇壓力,不可能增強作物的生長競爭力。若轉入的是 抗逆境基因如抗旱、抗有害生物等,在一些特殊的生態(tài)環(huán)境下其生長勢、9轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響競爭力應有所增強。轉基因技術對環(huán)境具有潛在的影響,特別是對生態(tài)環(huán)境帶來了前所 未有的風險。某種轉基因作物作為一個新的物種出現(xiàn),如果其帶來的外 來基因在栽培過程中“漂移” ,就有可能進入野生植物種群,使其遺傳性 狀改變,進而對其他生物產生不利影響,破壞自然環(huán)境的生態(tài)

35、平衡,同 時轉基因作物也可能會對人類健康帶來危害(徐征, 2004 ?；蚱剖?指來自一個或多個居群基因庫的基因轉移到某一居群基因庫中的過程 (ELLSTRAND N C et al.,2003 ?；蚱频闹饕緩桨?(1通過轉 基因植物的種子或組織擴散到新的生境中,并生存下來。一般通過自然 媒介(風力、水流或動物或者人類的活動進行傳播; (2通過花粉向 同種或近緣種的非轉基因植物轉移。主要通過自然媒介如風力和動物進 行傳播(盧寶榮, 2006;樊龍江,等, 2001 。如抗除草劑的基因通過花粉漂移轉到可配的雜草上,使雜草獲得除 草劑抗性,特別在同一地區(qū)推廣抗不同除草劑作物時,若多種除草

36、劑抗 性基因都轉到同一雜草上將使所有的除草劑失效(楊崇良,等, 2002 。 目前資料表明這種基因流動是存在的,但是風險不大,受多種環(huán)境因素 制約,有效的隔離帶可控制基因流動,而且隨著安全性標記基因系統(tǒng)及 終止子技術 (terminator technology的建立和完善(趙艷, 2002 ,有關這 種威脅的擔憂會越來越少。張寶紅等 (2000利用轉 Bt 基因抗蟲棉花和轉 tfdA 基因抗除草劑棉花進行基因流動研究表明,引入到棉花體內的外源 基因均可以向周圍環(huán)境漂流,其最高漂流頻率為 10.48%,最遠距離可達 50 m。有效防止外源基因向周圍環(huán)境擴散的方法是,設置適當?shù)母綦x帶, 隔離帶的

37、距離以 50-100 m為好,可將基因漂流頻率降低為 0,并能保證 其中的外源基因不向外擴散。轉基因通過傳粉在空間上逃逸的程度是由 不同方向的不同距離上轉基因花粉與非轉基因作物雜交的頻率來確定 的,隨著距離的增加,雜交的頻率降低。在轉基因作物周圍留出一定距 離的生殖隔離區(qū)作為緩沖帶, 可顯著降低由基因漂移引起的生態(tài)危險 (王10山東農業(yè)大學碩士學位論文勁,等, 2006;魏偉,等, 1999 。依據(jù)不同作物品種之間基因漂移頻率 的研究結果來制定相應的轉基因水稻生物安全監(jiān)測和管理措施。在自然界,植物之間的基因交流經(jīng)常發(fā)生,通過種內和種間雜交產 生新的基因型或植物類型(陳佩度, 2001 。世界上

38、 13種主要農作物中, 有 12種曾與野生種發(fā)生過天然雜交,其中 2種作物與野生近緣植物的雜 交在某些雜草物種的進化中起到了作用(Wolfenbarger &Phifer , 2000 。 玉米是目前轉基因作物商品化的第二大作物,玉米可以與其近緣植物雜 交,已證明玉米的基因漂移到了雜草墨西哥類蜀黍中,然而,由于玉米 的近緣植物只分布在北美洲墨西哥一帶,所以發(fā)生全球性基因漂移漂流 幾乎為零(Darmency , 1997 。水稻是世界上重要的糧食作物,有 2個栽 培種、 20個野生種。栽培種與野生種之間雜交率因材料差異很大,晚熟 類型品種常與數(shù)個野生種花期同步,使野生群體的異交率高達 5

39、2% (Langevin et al.,1990 。華南及云貴高原分布著豐富的水稻野生近緣種, 在我國推廣轉基因水稻應慎重。植物間的基因漂流,特別是種內品種間的基因漂流,是必然要發(fā)生 的,問題的關鍵是基因漂流后對生態(tài)環(huán)境能不能引起實質性的改變(宋 小玲, 2002 。通過多年實驗證明,在與近緣物種的雜交能力以及雜交后 代的表現(xiàn)方面,轉基因甜菜與非轉基因甜菜相比較沒有差異(Bartsch & Schuphan,2002 。當然,基因漂流的風險分析需要考慮到不同基因、不同 物種或品種在不同國家或地區(qū)來逐例進行?？剐允且粋€種群對一種殺蟲劑敏感度的降低,這種降低是以遺傳為 基礎的?？剐允沟梅N群

40、中等位基因的頻率發(fā)生變化,所以可以定義為一 種進化現(xiàn)象(Tabashnik B E,1994 。在轉基因作物廣泛推廣后,會逐步提 高靶標昆蟲的抗性。害蟲對 Bt 毒蛋白產生抗性的機制包括行為躲避、生 理生化機制及遺傳機制(魏偉,等, 1999 。1985年, McGaughey (1985首次發(fā)現(xiàn)了倉庫谷物害蟲印度谷螟對 藥劑的抗性可以在幾代內產生。其中一個品系在用 Bt 處理的飼料上飼養(yǎng)11轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響2代,抗性增加近 30倍, 5代之后抗性達到 100倍。其抗性隨后呈穩(wěn)定 狀態(tài)不再增加,當選擇作用中斷后,抗性保持穩(wěn)定。經(jīng)過若干代連續(xù)選 擇,紅鈴蟲對毒蛋白 Cr

41、ylAc 制劑的抗性可提高 100倍以上(Liu et al.,2001 。 因此有人擔心在轉基因抗蟲作物廣泛推廣后, 靶標昆蟲的抗性 會逐步提高, 作物抗蟲性降低, 最終難以控制靶標害蟲。 趙建周等 (1998 人用棉葉片逐代汰選棉鈴蟲初孵幼蟲 6, 11, 17代后,對單一 Bt 毒素蛋 白 CrylAc 的抗性指數(shù)分別提高 1.5, 4.0和 7.1倍,比用 Bt 粉劑汰選的抗 性發(fā)展速度明顯加快。 Andow 等(1998認為,即使在實驗室模擬條件 下玉米螟抗性提高也罕見,在大田中尚未發(fā)現(xiàn)抗 Bt 的玉米螟品系。 昆蟲具有很強的適應性,產生對轉基因作物抗性增強的群體是必然 趨勢。但通過

42、采取高劑量、庇護所和多種抗蟲基因結合等策略,與化學 殺蟲劑相比,昆蟲對轉基因抗蟲作物的抗性發(fā)展比較緩慢(萬小羽, 2007 。生態(tài)學家認為,轉基因作物是非自然進化的物種,它們都具有很強 的“選擇優(yōu)勢” ,可以取代原來棲息地上的物種,最終導致區(qū)域生態(tài)的結 構變化,繼而引起一些連鎖反應,進而影響以原來植物為食的植食性昆 蟲、天敵、昆蟲捕食者(如蜘蛛、瓢蟲、鳥類等的分布和生長發(fā)育。 在生存競爭中,轉基因作物可能會給己有的動植物帶來很大的災難(張 秀娟, 2002 。目前,對非靶標生物及生物多樣性影響的研究主要集中在 抗蟲轉基因作物上。對非靶標生物的直接影響是指轉基因作物的毒性。 Bt 蛋白專一性地

43、針對某些昆蟲如鱗翅目昆蟲,而不是專一性地針對某一種昆蟲,因此對 同一類昆蟲仍可產生影響。 如 Bt 玉米的花粉對大斑蝶幼蟲的影響。 在 1999年 5月 Losey 等(1999在 Nature 上發(fā)表轉 Bt 基因抗蟲玉米引起大斑蝶 死亡的報道,從而引發(fā)了 Bt 玉米環(huán)境風險的爭論。許多人提出質疑,大 斑蝶雖然以取食馬利筋為主,但馬利筋卻生長在玉米田的邊緣地帶,因 此認為 Losey 等的試驗并不能反映田間情況。隨后,在田間環(huán)境下的多12山東農業(yè)大學碩士學位論文個研究證明,大斑蝶及其他一些非靶標鱗翅目昆蟲在玉米地周圍取食不 到大量 Bt 的玉米花粉, Bt 玉米對它們的影響即使存在也很小 (

44、Wraight et al.,2000; Pleasants et al.,2001 。有研究表明,抗蟲基因除直接殺死靶標害 蟲,進而導致靶標害蟲的專性寄生性天敵在數(shù)量上有所減少外,對非靶 標害蟲、害蟲的天敵以及節(jié)肢動物的生物多樣性均沒有顯著影響(劉志 誠,等, 2002;傅強,等, 2003;白耀宇,等, 2005;陳文濱,等, 2007; 劉雨芳,等, 2005;姜永厚,等, 2005 。 Schuler 等 (2003報道,在抗 Bt 的菜蛾體內, Bt 毒素的有無對寄生蜂的寄生行為和生存沒有影響。 評估轉基因抗蟲作物的應用對非靶標昆蟲的影響應與使用化學殺蟲 劑比較。美國每年因使用殺蟲劑

45、而殺死的鳥和昆蟲分別達數(shù)百和數(shù)十億 (Pimentel &Raven,2000 。 由此可見, 轉基因抗蟲作物的大規(guī)模生產對其 它昆蟲的多樣性保持不會產生很大的影響。轉基因作物對農田生態(tài)系統(tǒng)中天敵的影響是其生態(tài)風險評價的重要 內容之一。農田生態(tài)系統(tǒng)中作物一害蟲一天敵三營養(yǎng)層通過營養(yǎng)流和化 學信息流的互作而協(xié)同共存,轉基因作物是否會通過第二營養(yǎng)層的靶標 或非靶標害蟲而對天敵產生影響?絕大多數(shù)的研究表明轉基因作物對天 敵昆蟲無明顯的負作用。在田間,轉基因植物各組織器官都表達 Bt 殺蟲 蛋白,植食性昆蟲取食這些組織便攝取了 Bt 殺蟲蛋白,捕食性昆蟲又通 過捕食植食性獵物而間接地與 Bt

46、殺蟲蛋白接觸并有可能在體內富積(吳 研, 等, 2007 。 劉志誠等 (2003 在室內評價了擬水狼蛛對取食轉 cryIAb 基因水稻的稻縱卷葉螟幼蟲和褐飛虱若蟲的捕食量及功能反應,認為轉 cryIAb 基因水稻對擬水狼蛛捕食作用無明顯的負作用。陳小娟等(2003 報道轉 Bt 抗蟲基因水稻生育期內稻田蜘蛛和田間水生生物的種類和數(shù)量 沒有發(fā)生顯著變化。轉 cryIAb/sck雙基因抗蟲水稻對稻田寄生蜂的物種 豐富度、多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)和優(yōu)勢集中性指數(shù)的總體情況與時間 動態(tài)以及個體總數(shù)無明顯負面影響,但在生長中期轉基因水稻可降低稻 田寄生蜂的個體數(shù)量(劉雨芳,等, 2006 。以 Bt 棉

47、田的棉蚜飼喂龜紋13轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影響瓢蟲時,龜紋瓢蟲的生長發(fā)育、存活以及繁殖等基本沒有受到影響(張 桂芬,等, 2004 。用轉基因抗蟲棉花粉處理(花粉密度約 1000粒 /cm2和 10000粒 /cm2 的遼東棟葉片分別飼養(yǎng)蟻蠶至 3齡末, 結果顯示, 與非 轉基因棉花粉處理相比, 1-3齡期柞蠶的死亡率、發(fā)育歷期、以及食物利 用率、食物轉化率、相對代謝速率、相對取食量和近似消化率等營養(yǎng)指 標均無顯著差別(李文樂,等, 2003 。轉 Bt 玉米、 Bt 棉花和 Bt 馬鈴薯 通過第二營養(yǎng)層的靶標或非靶標害蟲并未對天敵生存、生長發(fā)育與繁殖 產生不良影響。也有研究證

48、明轉基因作物對天敵具有明顯的負作用。普通草嶺取食 了 Bt 玉米上的獵物時幼蟲死亡率有明顯增加(Hilbeck A et al.,1998 。用 轉 GNA 基因馬鈴薯上的桃蚜飼喂大麗二斑瓢蟲成蟲后,雌蟲壽命下降 50%,繁殖力下降 38%,卵的孵化率明顯下降(Birch ANE et al.,1999 。 姜永厚等(2004在室內對轉基因水稻“克螟稻 1”中的 CryIAb 毒蛋白 經(jīng)食物鏈傳遞在捕食性天敵擬水狼蛛體內的積累情況進行了研究,表明 CryIAb 可以沿水稻一害蟲一天敵食物鏈傳遞,飼喂取食過“克螟稻 1” 二化螟或稻眼蝶幼蟲的擬水狼蛛體內都含有一定濃度的 cryIAb ,其中,

49、擬水狼蛛體內的含量以飼喂取食“克螟稻 1”稻眼蝶幼蟲的含量最高,約 為飼喂取食“克螟稻 1”二化螟幼蟲的 60倍。土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)和能量轉化過程的重要場所,轉基因植 物釋放的外源基因是通過其表達蛋白殘留在土壤中的。表達蛋白進入土 壤的途徑有 2條:一是通過轉基因作物在生長過程中或收割后遺留在田 間的植株殘體及花粉向土壤中釋放,這是外源蛋白進入土壤的主要途徑。 研究發(fā)現(xiàn),收獲前轉 Bt 基因棉花殘體的 1 g新鮮組織中含有 34.0 µg Cry A 蛋白 , 把 Bt 棉花基質均勻地埋入土壤后,檢測到土壤中 Cry A 蛋白的最高濃度為 1.6 µg/g(干土 (S

50、IMS S R, 1997 。 MON863玉米在其 生長期花粉中的 Cry3Bb1表達水平較高, 1 g鮮重花粉平均含有 77.189.214山東農業(yè)大學碩士學位論文µgCry3Bb1蛋白,因此其攜帶的外源蛋白就有可能進入土壤。二是通過 轉基因植物根系分泌物進入土壤。例如,通過無菌土培和水培試驗表明, 轉 Bt 基因玉米、馬鈴薯和水稻能通過根系分泌物的形式分泌一定數(shù)量的 Bt 蛋白。轉基因毒素在殺傷目標生物的同時,也會對非目標生物產生影響。 因此,轉基因作物外源基因在環(huán)境中尤其是土壤環(huán)境中的累積已經(jīng)引起 人們的廣泛關注。轉基因毒素能通過吸附作用與土壤活性顆粒結合在一 起,在土壤中會

51、逐漸富集。如粘土礦物、腐殖酸、有機礦物聚合體等可 吸附外源蛋白(李孝剛, 2008 。 Crecchio 等(Crecchio C et al.,2001研 究了 Bt 亞種 kurstaki 產生的毒素蛋白(Btk 與蒙脫石 -腐殖酸 -Al 羥基聚 合體混合物的穩(wěn)態(tài)吸附和結合, 結果表明, 在 1 h內吸附達到總吸附量的 70 %,在 8 h內產生了最大吸附,吸附量隨毒素量的增加而提高,穩(wěn)態(tài) 吸附的等溫線為 L-型。 Tapp 等 (Tapp H et al.,1998研究發(fā)現(xiàn),土壤中 Bt 毒素蛋白僅在很短時間內呈游離態(tài),土壤黏粒和腐殖酸能迅速吸附 Bt 蛋 白并緊緊地結合, 234天后

52、的結合態(tài) Bt 蛋白對煙草甲蟲和天蛾幼蟲仍有 毒害作用, 而且其殺蟲活性比游離態(tài) Bt 蛋白還強, 但結合態(tài) Bt 蛋白的結 構并未被修飾。 Btk 與 4種不同土壤純化的腐殖酸的結合試驗亦證實了 Btk 毒素蛋白能快速與胡敏酸結合,結合能力與腐殖酸的各種功能團有 關,并且結合態(tài) Btk 毒素保持較高的殺蟲活性 (Crecchio C et al.,1998。研 究表明,與土壤黏粒、腐殖物質等組分結合的轉基因毒素比游離態(tài)毒素 更不易被微生物降解,土壤中結合態(tài)的毒素蛋白不能作為微生物生長所 需的 C 源, 只有極少部分可作為 N 源被利用 (Tapp H et al.,1998; Crecchi

53、o C et al.,1998; Stotzky G et al.,2000。由此可見,土壤中的毒素蛋白可通過與 土壤各組分的結合而被積累并長期存在,殘留的結合態(tài)毒素能對非目標 生物造成危害和增加目標昆蟲的選擇抗性,這將會增加轉基因作物釋放 可能引起的生態(tài)環(huán)境風險。轉基因作物外源基因在土壤中行為的研究較少,目前以轉 Bt 基因作 物表達產物 Bt 蛋白的研究為主。轉 Bt 基因作物長期種植可能使 Bt 蛋白 在土壤生態(tài)系統(tǒng)中富集,從而影響土壤特異生物種群、功能類群、生物 多樣性和土壤生態(tài)學過程。 用轉 Bt 玉米含有 CryIA (b蛋白的根系分泌物15轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影

54、響和植株體的試驗顯示, 根系分泌物中的 Bt 蛋白在土壤中存在 180天以后, 仍有殺蟲活性 (SAXENA D et al.,2002。而轉 Bt 基因作物中的 Bt 蛋白在 土壤中消失的時間更長, 如根茬中的 Bt 殺蟲蛋白在轉 Bt 基因玉米收獲后 1447 d后才消失 (SIMS S R et al.,1997。 Rui 等發(fā)現(xiàn) Bt 棉根系分泌的 Bt 毒素的高活性可持續(xù) 2個月 (RUI Y K et al.,2005。當然,也有研究表明, 在連續(xù)種植了 6年的轉 Bt 棉花田中,用 ELISA 和生物檢測法未檢測到 Bt 毒蛋白 (GRAHAM H et al.,2002,因而得

55、到轉 Bt 棉花植株殘體向土壤 釋放的 Bt 毒蛋白含量很低,生物活性也不足以達到能檢測到的水平的相 反結論。土壤微生物是維持土壤生物活性的重要組成,參與有機質分解、腐 殖質形成、養(yǎng)分轉化和循環(huán)等多種土壤生化過程,微生物活性和群落結 構的變化是土壤環(huán)境評價不可缺少的重要生物學指標 (滕應, 等, 2004 。 土壤微生物對外界干擾比較靈敏,轉基因作物的外源基因和基因表達產 物的累積必然會對土壤微生物產生影響。轉基因作物影響土壤微生物群 落有兩條途徑:一是通過轉基因作物根系分泌物和轉基因作物殘體降解 的途徑進入土壤生態(tài)系統(tǒng),直接影響土壤微生物群落的構成、功能與穩(wěn) 定性;二是轉基因作物的遺傳改良可

56、能會影響到植物本身的分解速度和 碳、氮水平,進而間接影響土壤生物、生態(tài)過程。隨著優(yōu)質、抗病蟲、耐逆境的轉基因作物不斷育成和釋放應用,農 田植被類型與特征隨之發(fā)生了變化。由此引發(fā)了農田生物多樣性 (包括土 壤微生物多樣性 的變化及其對農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的健康與穩(wěn)定的影響。轉 Bt 作物在一定程度上能夠改變土壤微生物的群落構成、微生物數(shù)量及其活 性。 Yudina 等發(fā)現(xiàn) 4種不同轉 Bt 基因棉花促使了土壤中細菌和真菌數(shù)量 發(fā)生短暫性的顯著增加 (YUDINA T G et al.,1997。 Watrud 和 Seidie 也報 道,轉 Bt 基因棉花可以提高土壤中細菌和真菌的數(shù)量 (WATRUD

57、L S et al.,1998 。但也有一些報道表明,轉基因植物對土壤微生物區(qū)系沒有顯著 影響。例如,在田間水平上研究轉 Bt 基因棉花和馬鈴薯的根系分泌物對 土壤細菌和真菌的數(shù)量、種類、豐富度及植物病原水平的影響時發(fā)現(xiàn), 根際微生物的數(shù)量在轉基因與對照間差異不顯著 (Kathen A,1996; 錢迎16山東農業(yè)大學碩士學位論文土壤酶是土壤中具有化學催化活性的物質,來源于動植物殘體分解、 植物根系分泌和土壤生物的代謝,其活性體現(xiàn)了土壤中各種生物化學過 程的強度和方向,在一定程度上反映了土壤微生物的活性 (曹慧,等, 2005 。轉基因作物種植在一定程度上改變土壤酶的活性,轉凝集素和內切 幾丁

58、質酶基因的馬鈴薯釋放后, 提高了土壤脫氫酶的活性 (Griffiths BS et al.,2000 ; 而轉 -淀粉酶和木質素過氧化物酶基因的紫花苜蓿使得土壤脫 氫酶和堿性磷酸酶活性下降 (Donegan KK et al.,1995 。 種植轉 Bt 基因水 稻后,土壤酶活性發(fā)生了顯著變化,而且變化幅度與土壤酶的類型和轉 Bt 基因水稻的生長發(fā)育時間有關,轉 Bt 基因水稻生長 15天時,土壤脲 酶活性降低了 2.47%, 土壤酸性磷酸酶活性提高了 8.91%, 土壤芳基硫酸 酯酶活性有所下降而脫氫酶活性有所增加, 但差異不顯著; 生長 30天時, 土壤脲酶活性下降了 16.36%,土壤酸

59、性磷酸酶、芳基硫酸酯酶和脫氫酶 活性顯著升高,增幅分別是 35.69%、 19.70%和 16.83%;土壤蔗糖酶活性 在測定過程中則無明顯改變(孫彩霞,等, 2003 。轉基因作物對土壤酶 活性的影響機理可能是轉基因表達蛋白與土壤酶競爭土壤顆?；钴S表面 的結合位點,從而影響土壤酶的活性,如導入土壤中的殺蟲晶體蛋白能 與土壤礦物質、土壤腐殖酸、土壤有機礦質復合體相結合。1.4轉基因作物的種植對土壤肥力的影響土壤肥力是土壤的基本屬性和質的特性,是土壤從營養(yǎng)條件和環(huán)境 條件方面,供應和協(xié)調作物生長的能力。土壤肥力質量是土壤的物理、 化學和生物學性質的綜合反映(冷春龍, 2007 。17轉基因番茄對土壤生物學性質及養(yǎng)分吸收的影