1、過氧化物酶的提取、分離、純化及其測定實驗1 過氧化物酶的提取、分離、純化 一、目的意義酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒有酶的催化反應(yīng)，植物的生命也就停止了，因此對酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。為要研究酶，首先要將酶從組織中提取出來，加以分離、純化。不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據(jù)不同情況區(qū)別對待。在酶的提取和純化過程中，自始至終都需要測定酶的活性，通過酶活性的測定以監(jiān)測酶的去向。本實驗的目的是了解并掌握勻漿、鹽析、透析及酶活性測定的原理及操作。二、原理（

2、一）酶的提取 從高等植物中提取酶常遇到一些實際問題，首先是細(xì)胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低。此外，各種酶的存在狀態(tài)不同，有在細(xì)胞外的外酶，也有在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)酶，內(nèi)酶中又有與細(xì)胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中，提取時都應(yīng)區(qū)別對待，作不同處理。如果酶僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，只要將細(xì)胞破碎，酶就會轉(zhuǎn)移到提取液中；但如果是與細(xì)胞器（如細(xì)胞壁、細(xì)胞核、線粒體、原生質(zhì)膜、微粒體等）緊密結(jié)合的酶，這時如僅僅破碎細(xì)胞還不夠，還需要用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來。其次，細(xì)胞中存在抑制物質(zhì)，如酚、

3、酸、離子等，它們通常在液泡中，當(dāng)細(xì)胞破碎時，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細(xì)胞中釋放出來，進(jìn)入提取液中，特別是酚類物質(zhì)，具有游離的酚羥基，能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強的氫鍵，不能為一般的實驗方法，如透析和凝膠過濾所解離。酚易氧化產(chǎn)生醌，醌為一種強氧化劑，會使蛋白質(zhì)的功能團(tuán)發(fā)生氧化或發(fā)生聚合，使蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基團(tuán)，如-SH、-NH2，通過1,4-加成反應(yīng)而發(fā)生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物組織和提取液產(chǎn)生棕色，以致影響酶活性的測定。因此如果沒有特殊需要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶

4、液，因為在高pH值時，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強的氫鍵，但高pH值促進(jìn)酚類氧化，同時降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用pH 6.7-7.2。已經(jīng)知道PVP能與游離酚羥基形成強的氫鍵復(fù)合物，是酚類化合物的有效結(jié)合劑。在提取線粒體時加入可溶性PVP，提取可溶性酶時加入不溶性交聯(lián)PVP（Polyvinyl Polypyrrolidone，簡稱PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體，可加10 HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應(yīng)用。植物細(xì)胞有堅韌的細(xì)胞壁，需要強烈的

5、方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動勻漿器。為減低研磨或勻漿過程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷，提取液的用量一般為組織的1-5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘渣再提取一次。提取勻漿時加入酚類結(jié)合劑PVPP、金屬螯合劑Na2-EDTA，以及-SH化合物以保護(hù)蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如Triton X-100，以增加蛋白質(zhì)的可溶度，常用于與膜脂結(jié)合的酶?？傊?，可以通過試驗確定提取蛋白質(zhì)的最佳條件。（二）分離和純化 酶的分離和純化包括兩方面的工作：一是將含酶的提取液從很大體積濃縮到比較小的體積；另一方面是將酶制劑中大量的雜蛋白

6、質(zhì)和其他大分子物質(zhì)分離除去。在分離提純過程中始終需要測定酶的活性和蛋白質(zhì)含量，以酶總活性的回收來判明提純過程中酶的損失情況，以比活性的提高程度來確定提純方法的有效性。一個好的提純步驟應(yīng)該是總活性的回收率高，比活性提高的倍數(shù)也較大，但實際上兩者往往難以兼顧。因而可在比活性多提高一些和總活性多回收一些之間，作出適當(dāng)?shù)倪x擇。 上面制備得到的提取液中，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì)。要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法、柱層析法、薄膜超濾法、親和層析法、電泳法等。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最

7、早的方法之一，迄今仍廣泛使用，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨，使沉淀的蛋白質(zhì)的酶活性最大。大多數(shù)酶的活性存在于35-45 和45-55飽和度硫酸銨沉淀的部分，但也有存在于65-80飽和度的（如花椰菜根的過氧化物酶）。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集之；再溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過濾，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì)，然后再經(jīng)過柱層析分離。由于吸附劑的不同，又有吸附柱層析、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也

8、不同，分子篩類型凝膠過濾柱層析，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫。對于吸附柱和離子交換柱層析，往往要采用濃度梯度溶液進(jìn)行洗脫，最方便的是線性梯度濃度，當(dāng)然用非線性梯度會得到更好的分離效果。柱層析一般都需要自動收集儀，如果能配用蛋白質(zhì)檢測儀就更好了。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣，已經(jīng)成為一種常規(guī)的酶的分離提純的步驟之一了。近年來純化酶常用的一種有效方法為親和層析。主要利用酶和底物、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來分離、提純酶。首先選擇一支持物，如瓊脂糖（Sepharose）將底物、競爭性抑制劑或輔酶，以共價鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流過裝有

9、專一性底物、競爭抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上，再經(jīng)過充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì)，然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑或輔酶的緩沖液，進(jìn)行競爭性洗脫。如果親和劑選擇合適，往往能得到較高純度的酶，是酶分離、純化中既方便又最有效的一種方法。（三）酶活力的測定酶的活力表現(xiàn)為催化某一反應(yīng)的速度，反應(yīng)速度越大，酶的活力也越大。酶催化的反應(yīng)速度可以用單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來表示。由于酶的催化作用和周圍環(huán)境的關(guān)系十分密切，環(huán)境的溫度、pH、離子強度等都對酶的活力有很大的影響，因此測定酶活力時應(yīng)該使這些條件保持恒定。酶活力大小常以每mg酶蛋白每min所分解的底物量（或生成的產(chǎn)物量）

10、mol數(shù)表示之。 測定酶活性的方法很多，常因反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同可選用不同的方法，應(yīng)用最廣泛的是比色法或分光光度法。凡反應(yīng)系統(tǒng)中的化合物在紫外區(qū)或可見光區(qū)有吸收峰的都可以用這種方法進(jìn)行測定。如果酶催化的是一需氧反應(yīng)，如氧化酶，則可用測壓法或氧電極法。如果催化的反應(yīng)系統(tǒng)中需要ATP或產(chǎn)生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脫氫酶和氧化還原酶?；蛘叻磻?yīng)產(chǎn)生H2O2，如一些氧化酶，這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行測定?？傊?，測定酶活性的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的方法。 三、實驗材料、儀器、試劑1. 實驗材料：新鮮楊樹葉片。2. 儀器：高速冷凍離心機、分光光度計、組織

11、搗碎機、電磁攪拌器、天平、微量進(jìn)樣器、透析袋、量筒、燒杯、移液管、試管等。3. 試劑：硫酸銨、0.02 molL-1 KH2PO4溶液、BaCl2溶液、0.01 molL-1 pH 7.0磷酸緩沖液、0.01 molL-1 pH 6.0磷酸緩沖液、0.04 molL-1 H2O2溶液、0.02 molL-1愈創(chuàng)木酚溶液、20三氯乙酸溶液、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250等。四、操作步驟（一）酶的提取用天平稱取剪碎的楊樹葉片40g，先加入120mL 0.02 molL-1 KH2PO4溶液，在組織搗碎機中攪成勻漿，再用80mL KH2PO4溶液分次洗凈。勻漿全部倒在大燒杯中，用4層紗布過濾，量

12、取濾液體積。濾液8000rpm冷凍離心15min，棄去沉淀，量取上清液體積，將上清液放入冰箱冷藏2h。上清液即為酶的粗提取液。 （二）硫酸銨分級沉淀吸取6ml酶液留作酶活性及蛋白質(zhì)含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固體硫酸銨，使達(dá)35飽和度（參閱附錄）。加硫酸銨時要緩慢，以避免造成局部濃度過高，在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入。然后置冰箱中靜置20min，離心15min。分別收集上清液和沉淀，量取上清液體積，再加入硫酸銨使達(dá)65飽和度，冰箱中靜置20min，離心15min，收集沉淀和上清液。按這樣的方法分別收集35、65、80飽和度的硫酸銨沉淀。每部分沉淀分別復(fù)溶于1/20原始體積的0.01 mo

13、lL-1 pH 6.0磷酸緩沖液，裝入透析袋，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中進(jìn)行透析過夜，其間更換KH2PO4溶液約4次，直至無SO42-析出為止（用BaCl2溶液檢查）。待透析完畢后，分別量取體積，保存于冰箱中備用。（三）蛋白質(zhì)含量的測定（考馬斯亮藍(lán)G-250法）1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（參閱實驗指導(dǎo)）： 2.樣品提?。喊聪卤肀壤♂屧崛∫杭案鞣植砍恋怼悠吩崛∫?5%鹽析65%鹽析80%鹽析稀釋倍數(shù)1005010103.樣品測定（參閱實驗指導(dǎo)）（四）酶活性的測定（愈創(chuàng)木酚比色法）: 參閱實驗指導(dǎo)。五、結(jié)果計算將結(jié)果填入下表中。項目粗酶液硫酸銨飽和度（%）0-3535-6565-

14、80體積（mL）蛋白質(zhì)gmL-1總量（mg）%酶活性UmL-1U%比活性附：2、考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量（一）原理 考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌罢呶辗逶?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)范圍內(nèi)（01000gmL-1），蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在595nm波長下的消光值與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合反應(yīng)十分迅速，2min左右即達(dá)到平衡，其結(jié)合物在室溫下1h 內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏（

15、比斐林酚法還高4倍），可測微克級蛋白質(zhì)含量，易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。其缺點是在蛋白質(zhì)含量很高時線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。（二）實驗材料、儀器與試劑1. 實驗材料：小麥葉片及其他植物材料。2. 儀器：分光光度計、離心機、藥物天平、容量瓶、移液管、試管等。3. 試劑（1）100gmL-1標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：精確稱取牛血清白蛋白10mg，溶于100mL蒸餾水中。（2）考馬斯亮藍(lán)G-250試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入100mL 85磷酸（W/V），最后用蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中。此溶液在常溫

16、下可放置一個月。（3）其他試劑：90乙醇、85磷酸。（三）操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取6支試管，按下表添加試劑。搖勻，放置2min后在595nm波長下比色，記錄消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管編號123456標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（mL）蒸餾水（mL）蛋白質(zhì)濃度（gmL-1）考馬斯亮藍(lán)G-250（mL）消光值01.0050.20.82050.40.64050.60.46050.80.28051.0010052. 樣品提?。悍Q取鮮樣0.51.0g放入研缽中，加2mL蒸餾水研成勻漿，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，再以蒸餾水分次洗滌研缽，收集于同一容量瓶中，用水定容至刻度

17、，放置30min以充分提取，其間搖動幾次。然后過濾或離心，清液即為待測液。3. 樣品測定：吸取提取液1mL，放入試管中，加5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分搖勻，放置2min后于595nm處比色，記錄消光值。（四）結(jié)果計算式中：為蛋白質(zhì)含量（mgg-1）；為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)濃度（gmL-1）；為提取液總體積（mL）；為樣品重（g）。3、愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶活性（一）原理在過氧化物酶催化下，過氧化氫將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物，其在470nm處有最大吸收峰。該生成物顏色的深淺與其濃度成線性關(guān)系，故可用分光光度計測量生成物的含量，間接測定過氧化物酶的活性。（二）實驗材料、儀器與試劑1

18、. 實驗材料：各種植物材料均可。2. 儀器：分光光度計、離心機、磁力攪拌器、秒表、研缽、容量瓶、量筒、試管、移液管等。3. 試劑：（1）10mmolL-1 pH 7.0磷酸緩沖液：準(zhǔn)確稱取0.156g NaH2PO42H2O，溶解后定容至100mL，即為A液；準(zhǔn)確稱取0.35g Na2HPO412H2O，溶解后定容至100mL，即為B液。取A液39mL和B液61mL混勻，即為10mmolL-1 pH 7.0磷酸緩沖液。（2）40mmolL-1 H2O2：吸取0.318mL 30 H2O2（比重1.438gmL-1），加水定容至100mL。（3）20mmolL-1愈創(chuàng)木酚：吸取0.2mL愈創(chuàng)木酚

19、，加水定容至100mL，貯于棕色瓶中。（4）20三氯乙酸：稱取20g三氯乙酸，用蒸餾水溶解后定容至100mL。（三）操作步驟1. 酶液制備：稱取植物材料0.31.0g，加入適量的pH 7.8磷酸緩沖液，充分研磨至無粗纖維為止，分裝在兩個塑料小離心管中，再用pH 7.8磷酸緩沖液洗凈研缽，洗液一并轉(zhuǎn)入小離心管，10000rpm離心20min，上清液即為酶提取液。或稱取植物材料1.0g，充分研磨至勻漿，加入pH 7.8磷酸緩沖液6mL，完全轉(zhuǎn)移至離心管中，4000rpm離心10min，此步離心液可用于丙二醛含量測定，剩余部分15000rpm再離心10min，上清液冷凍保存，可用于POD、SOD活性

20、測定。2. 酶活性測定：取兩只試管，1支為測定管（可設(shè)重復(fù)），另1支為對照管，按下表加入試劑，配成POD反應(yīng)體系（隨酶量的增減，相應(yīng)改變加入磷酸緩沖液的量，以保持總體積不變）。搖勻，放入34水浴中保溫3min后，加入60L左右三氯乙酸，搖勻，以對照管作用液為空白，在470nm波長下比色，讀取OD值。試 劑磷酸緩沖液愈創(chuàng)木酚H2O2酶提取液蒸餾水OD值測定管2.91mL0.05mL0.02mL0.02mL對照管2.91mL0.05mL0.02mL0.02mL（四）結(jié)果計算 過氧化物酶活性單位（U）定義為1g鮮樣1min內(nèi)470nm處吸光值升高1 個單位所需的酶量。式中：為470nm下的OD值；為

21、樣品重（g）；為反應(yīng)時間（min）；為提取時酶液體積（mL）；為反應(yīng)時酶液體積（mL）。【附注】1. 反應(yīng)液中加入酶液的數(shù)量視酶活性而定，可根據(jù)顯色情況增加或減少。2. 加入三氯乙酸是為了終止酶的活性，故要在保溫后加入。具體加入數(shù)量應(yīng)以O(shè)D470相對穩(wěn)定為度，如隨時間延長，比色液一直在加深（OD470增大），即說明加入的三氯乙酸量少，此時應(yīng)適量增加。適用范圍一般為4080L。3. 隨加入酶液及三氯乙酸量的增減應(yīng)相應(yīng)改變加入磷酸緩沖液的量，以維持總體積不變。4 植物同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳目的意義同工酶（isoenzyme或isozyme）是指生物體內(nèi)存在的一類催化相同反應(yīng)而其分子結(jié)構(gòu)以及理化性

22、質(zhì)不同的酶，是不同基因表達(dá)的結(jié)果。這一術(shù)語是1959年由Markert首先提出的。同工酶的具體作用是為了以不同的方式和途徑來滿足細(xì)胞或組織中特殊代謝的需要。研究表明，它與生物的遺傳、生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)、抗逆生理以及生物的進(jìn)化有著密切的聯(lián)系。因此測定同工酶在理論和實踐上都有重要的意義，廣泛受到生理生化及遺傳育種研究者的高度重視。同工酶的研究方法很多，但最常用的是把凝膠電泳技術(shù)與酶染色技術(shù)結(jié)合起來，稱為酶譜技術(shù)。這一技術(shù)方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性強，測定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）分離植物材料中的過氧化物酶（peroxidase，POD）、酯酶（estera

23、se，EST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、蘋果酸脫氫酶（Malate Dehydrogenase，MDH）等同工酶，然后利用各自不同的反應(yīng)機理進(jìn)行鑒定。通過本實驗，學(xué)習(xí)掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理與操作方法，同時學(xué)習(xí)同工酶分析的方法酶譜技術(shù)。電泳技術(shù)一、原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（Acr）單體和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié)。凝膠電泳具有濃縮效應(yīng)（在樣品膠和濃縮膠中進(jìn)行）、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)（在分離膠中進(jìn)行）。被分離物質(zhì)由于所載電荷數(shù)量、分子大小和形狀

24、的差異，因此在電泳時產(chǎn)生不同的泳動速度而相互分離。二、實驗材料、儀器與試劑1. 實驗材料：小麥葉片或其他植物組織。2. 儀器：電泳儀、電泳槽、高速臺式離心機、真空泵、真空干燥器、抽濾瓶、燒杯、移液管、細(xì)長滴管、 研缽、微量注射器、普通注射器、試管、試管架等。3. 試劑：（1）分離膠緩沖液（pH 8.9 Tris-HCl）：稱取Tris 36.8g，加1M HCl 48mL，用無離子水溶解后定容至100mL。（2）分離膠貯液（Acr-Bis）：稱取Acr 28.0g，Bis 0.735g，用無離子水溶解后定容至100mL，過濾除去不溶物。（3）隔層膠緩沖液（pH 6.7 Tris-HCl）：稱取

25、Tris 5.98g，加1M HCl 48mL，用無離子水溶解后定容至100mL。（4）隔層膠貯液（Acr-Bis）：稱取Acr 10g，Bis 2.5g，用無離子水溶解后定容至100mL。（5）2瓊脂：稱取2g瓊脂，用100mL無離子水加熱熔化。（6）過硫酸銨溶液：稱取0.14g過硫酸銨溶于100mL無離子水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。（7）電極緩沖液（pH 8.3 Tris-Gly）：稱取Tris 6g、Gly 28.8g，溶于無離子水后定容至1000mL，用前再稀釋10倍。（8）40蔗糖溶液：稱取蔗糖40g，溶于100mL無離子水中。（9）0.5溴酚藍(lán)溶液：稱取0.5g溴酚藍(lán)溶于100mL無離子水中。

26、上述各試劑（除過硫酸銨外）配好后裝入棕色瓶于冰箱中可保存12個月。三、操作步驟1. 凝膠的制備（1）將上述試劑貯液自冰箱中取出，置于室溫平衡后再配制工作液。（2）取一洗凈裝好的垂直板電泳槽，在下口處加入適量熔化的2瓊脂，靜置冷卻，待凝固后即封好下口，可用于制膠。（3）分離膠制備：按下表比例配制分離膠。其中過硫酸銨單獨放一小燒杯中，其余混勻于另一小燒杯中。然后小心混勻兩杯溶液，其中加入TEMED 180L，立即用玻璃棒沿電泳膠槽玻壁灌膠。膠液液面離上限34cm左右停止灌膠，再沿玻壁緩緩加水約0.5cm，以防過量氧氣的散入。剛剛加過水可看出界面，后逐漸消失，等再看出界面時，凝膠即已聚合完成。再靜置

27、10min左右，將水用濾紙條吸干。貯液名稱分離膠緩沖液分離膠貯液過硫酸銨水體積比例雙面槽取用量（mL）1921843619（4）隔層膠制備：按下表配制隔層膠溶液。其中核黃素單獨放一小燒杯中，其余混勻于另一小燒杯中。然后小心混勻兩杯溶液，加入TEMED 120L，將其灌注在分離膠之上約3cm，加膠隔梳子（注意：梳子的底部應(yīng)與分離膠界面平行），加水封膠。放入人工智能氣候室照光，待聚合完成（變成乳白色），輕輕拔出小梳子，邊拔邊加水。吸出小槽中的水，露出點樣槽，準(zhǔn)備點樣。貯液名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠貯液核黃素40蔗糖體積比例雙面槽取用量（mL）1441614282. 樣品制備：稱取樣品1g，加1mL冰冷

28、的無離子水或電極緩沖液，于冰浴中研磨成勻漿，然后用2mL提取液分幾次洗入離心管，在高速臺式離心機上10000rpm離心10min。倒出上清液，以等量40蔗糖混合，即為樣品制備液。3. 點樣：用微量進(jìn)樣器吸取適量的樣品制備液，注入樣品槽中。一個膠板上一般有1020個點樣槽，可用于不同樣品的分析，也可用于同一樣品不同的分析內(nèi)容。4. 裝槽：點樣完畢后，將稀釋10倍的電極緩沖液分別注入上、下電極槽中。下槽以沒過電極為宜，上槽應(yīng)浸沒膠板上端12cm。上槽加液時要小心操作，以免將樣品液沖散出來。然后在上槽中滴加幾滴溴酚藍(lán)作為前沿指示劑。5. 電泳：將電泳槽放入層析冷柜，接好電源線，上槽為負(fù)極，下槽為正極

29、。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流至每板15mA左右。待樣品進(jìn)入分離膠（約15min）中，調(diào)節(jié)電流到30mA，此時電壓應(yīng)維持在150V左右，電泳約45h。6. 剝膠：待示蹤染料下行到距膠板下端0.5cm處即可關(guān)閉電源，停止電泳。然后放出電極緩沖液，剝膠。打開固定螺絲或夾子，取出玻板和膠板，在流水沖刷下，輕輕撬開兩層玻板，取出膠板，放入一個大培養(yǎng)皿中，以無離子水浸泡10min，即可開始染色。酶譜技術(shù)一、原理同工酶是一系列催化相同反應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此鑒定同工酶的最適宜的方法是用底物反應(yīng)。底物被酶作用產(chǎn)生產(chǎn)物，生成的產(chǎn)物或自身就有生色團(tuán)而顯色，或是與適宜的染料結(jié)合而生色。因為產(chǎn)物的生成只局限于酶存在的區(qū)域，所以色帶便是明顯的酶帶。而同工酶與同一底物反應(yīng)生成的產(chǎn)物相同，有同樣的生色反應(yīng)，經(jīng)電泳分離后因結(jié)構(gòu)的差異性可在支持介質(zhì)上顯現(xiàn)出數(shù)條酶帶，這就是所謂的酶譜。它反映了同工酶存在的數(shù)量，而酶帶的寬窄以及顏色的深淺則反映了酶的相對活性。（一）過氧化物酶過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，是一含有血紅素鐵的蛋白質(zhì)，催化如下的反應(yīng)：RH2 + H2O2 R + 2H2ORH2可以是大多數(shù)的酚類或胺類物質(zhì)。本實驗所用的是聯(lián)苯胺，顯色結(jié)果是在無色透明的膠板上形成藍(lán)色的酶帶。二、儀器和試劑（一）儀器電泳譜帶掃描儀、真空凝膠干燥器、恒溫箱、日光燈、照相機和繪圖紙、