1、一、DNA重組技術(shù)的基本含義 1、基本概念 DNA重組技術(shù)也稱為基因克隆或分子克隆。最終目的是把一個(gè)生物體中的遺傳信息轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體。2、基本步驟目的基因的提取:供體生物基因或稱外源基因的提取限制性酶切：目的基因切成不同大小的片段酶接：連接到另一DNA分子上（克隆載體）轉(zhuǎn)化:將這個(gè)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩選和鑒定:對(duì)吸收了重組DNA的受體細(xì)胞進(jìn)行 篩選和鑒定基因表達(dá)：進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)外援基因是否表達(dá)。 二、限制性內(nèi)切酶 1、限制性內(nèi)切酶的定義 是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個(gè)組成部分，具有識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切酶。 2、限制性

2、內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)Luria和Human發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能將外來(lái)的DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不被外來(lái)噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制修飾。Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，能夠特異性的切割DNA，這個(gè)酶被命名為Hind I,這是第一個(gè)分離到的限制性內(nèi)切核酸酶。 限制性內(nèi)切限制性內(nèi)切酶酶是如何工作的是如何工作的？3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名 按酶來(lái)源菌的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語(yǔ)表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（H

3、aemophilus influenzae d）中先后分離到3 種限制酶，則分別命名為Hind、Hind和Hind。4、限制性內(nèi)切酶的類型 限制性內(nèi)切酶可分為三大類型： 類型I和類型III ：由于識(shí)別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，很少被應(yīng)用。 類型II ：是DNA重組技術(shù)最為常用的工具酶。 類型II 限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn) 識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一 識(shí)別序列的堿基數(shù)一般為4、6、8個(gè)bp 識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)常是一種回文序列的DNA 同切點(diǎn)酶同切點(diǎn)酶 （isoschizomer）：同裂酶同裂酶同識(shí)同識(shí)同同切切5-TTT3-AAAAAA-3TTT-5+Aha Dra 5-TTT3-AAAAAA-3TTT-5同裂酶同裂酶同識(shí)同識(shí)異

4、異切切GCCATGGTACCGGGTACCCCATGGGGTACCCCATGG+Kpn I5-G3-CCATGGTACC-3G-5+Asp718 I5-3-3-55-3-3-55-3-3-5CTCGA G CCC一般的限制性內(nèi)切一般的限制性內(nèi)切酶酶反反應(yīng)應(yīng)條件條件1 1 UnitUnit 定義：定義： 限制性內(nèi)切酶在限制性內(nèi)切酶在50L50L反應(yīng)液中反應(yīng)液中6060分鐘完分鐘完全切斷全切斷1g1g DNADNA（多數(shù)情況是（多數(shù)情況是噬菌體噬菌體DNADNA ）。）。一般來(lái)說(shuō)，一般來(lái)說(shuō)， 1L1L的內(nèi)切酶與的內(nèi)切酶與11的精制的精制DNADNA在在LL反應(yīng)體系中（終濃度反應(yīng)體系中（終濃度1 1

5、倍的最適緩沖液中混合）倍的最適緩沖液中混合）在推薦溫度下溫育在推薦溫度下溫育1 1小時(shí)。小時(shí)。酶量過(guò)剩、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間與酶量過(guò)少、增加反應(yīng)時(shí)酶量過(guò)剩、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間與酶量過(guò)少、增加反應(yīng)時(shí)間都可以完全切斷目的間都可以完全切斷目的DNADNA片段。片段。切錯(cuò)地方了，咋辦？有沒(méi)有可能限制性內(nèi)切酶切錯(cuò)了有沒(méi)有可能限制性內(nèi)切酶切錯(cuò)了？限制性內(nèi)切酶的Star活性應(yīng)該注意利用限制性內(nèi)切酶的要點(diǎn),是反應(yīng)液組成。酶的種類不同 對(duì)反應(yīng)最適合的鹽濃度和 pH 等也不同。鹽濃度太高或太低, pH 很大地偏離既定值、 酶的濃度太高,都有可能切斷原來(lái)本不該切的序列(與識(shí)別序列相似但不相同的序列)。把這個(gè)稱為限制性內(nèi)切酶的 S

6、tar 活性。Star 活性誘導(dǎo)條件活性誘導(dǎo)條件、甘油甘油濃濃度度過(guò)過(guò)高高5%v/v 、 DNA相相對(duì)應(yīng)對(duì)應(yīng)的的酶酶Unit數(shù)數(shù)過(guò)過(guò)高高（ （因因酶酶不同而不同，一般不同而不同，一般100 Unit/）、離子離子強(qiáng)強(qiáng)度低度低（25mM） ）、pH值值高高（pH8.0） ）、殘存有機(jī)溶殘存有機(jī)溶劑劑。 。、Mg2+替替換為換為其他二價(jià)離子其他二價(jià)離子。（。（Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+） ）Star 活性阻害條件活性阻害條件、在切斷可能的范在切斷可能的范圍圍內(nèi)，盡量減少內(nèi)，盡量減少酶酶用量用量。 。、確確認(rèn)認(rèn)完全除去制完全除去制備備DNA時(shí)時(shí)的有機(jī)溶的有機(jī)溶劑劑。 。、反反應(yīng)應(yīng)溶溶劑劑的離子的離子強(qiáng)強(qiáng)度度調(diào)調(diào)至至100-150mM。、。、反反應(yīng)應(yīng)溶液的溶液的pH值調(diào)值調(diào)整到整到7。 。、二價(jià)陽(yáng)離子盡量使用二價(jià)陽(yáng)離子盡量使用Mg2+。 。2、Klenow酶： 也稱DNA聚合酶I大片段，只是從DNA聚合酶I全酶中去除了5 3外切酶活性 a、用于同位素標(biāo)記DN