1、基于分子對(duì)接的射干抗氣道炎癥機(jī)制研究目的:本專題借助國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家“十二五”重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目資 助,擬以射干藥材為研究對(duì)象,通過古典醫(yī)籍考證及現(xiàn)代文獻(xiàn)資料,初步確定藥材 功能主治及臨床適用病癥;利用臨床驗(yàn)證試驗(yàn)明確適用病癥篩選的準(zhǔn)確性;采用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探索藥物對(duì)篩選病癥的初步作用模式;依靠分子對(duì)接技術(shù),預(yù)測(cè)藥材活 性組分與體內(nèi)受體蛋白靶點(diǎn)之間的結(jié)合模式和親和力，模擬藥物可能的作用機(jī)制; 采取模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn),選擇模擬篩選的作用靶點(diǎn)為測(cè)定指標(biāo),從蛋白表達(dá)、體內(nèi)生物 標(biāo)記物變化方面對(duì)所預(yù)測(cè)的機(jī)制進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,確定藥物治療疾病多成分、多途 徑、多靶點(diǎn)作用機(jī)制,探討建立中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的新方法及

2、新技術(shù)可行性。 材料與方法:1.通過查閱春秋戰(zhàn)國(guó)至明清時(shí)期的古典醫(yī)籍,結(jié)合射干古代方劑配 伍應(yīng)用考察分析,對(duì)射干及其組方在不同歷史時(shí)期功能主治、適用病種及性味歸 經(jīng)進(jìn)行歸納，明確了射干應(yīng)用的演變過程。利用普濟(jì)方數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng),對(duì)射干跨病種檢索,可得含射干復(fù)方在治療 所有疾病的分布情況，并與歷代本草學(xué)和中華人民共和國(guó)藥典記載的功能主 治相比較。基于現(xiàn)代文獻(xiàn)學(xué)研究,對(duì)射干現(xiàn)代藥理作用進(jìn)行歸納整理。依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論,對(duì)射干最佳治療適應(yīng)癥型進(jìn)行分析。2.在前期文獻(xiàn)研 究確立射干藥材臨床適應(yīng)證型基礎(chǔ)上,通過設(shè)計(jì)基于臨床適應(yīng)病癥-急性支氣管 炎及感染后咳嗽的臨床驗(yàn)證試驗(yàn)方案,在經(jīng)過遼寧省藥品監(jiān)督管理局審

3、批及醫(yī)院 倫理委員會(huì)討論通過后，采用隨機(jī)、雙盲、對(duì)照試驗(yàn)的方法對(duì)射干藥材臨床應(yīng)用 最佳病癥進(jìn)行篩選研究。臨床評(píng)價(jià)試驗(yàn)選擇感染后咳嗽（治療組和陽(yáng)性藥對(duì)照組）、急性氣管-支氣管 炎病癥（治療組和陽(yáng)性藥對(duì)照組），以肺寧片（返魂草制劑）作為陽(yáng)性對(duì)照藥,按1:1的比例安排病例數(shù)。其中臨床評(píng)價(jià)試驗(yàn)例數(shù)為:感染后咳嗽組為每組40例, 急性氣管-支氣管炎組為每組60例,共200例。急性氣管-支氣管炎和感染后咳嗽各兩組病例在性別、年齡、病程及病情輕 重上經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,差異無(wú)顯著意義（P&gt；0.05），具有可比性。治療組給予射干 制劑，1.2g/次（3次/日）；對(duì)照組給予肺寧片,5片/次（3次/日）；

4、療程為10天。所有病例均符合診斷標(biāo)準(zhǔn),不符合排除標(biāo)準(zhǔn)。分別對(duì)治療前后患者日間咳嗽 評(píng)分、夜間咳嗽評(píng)分、咳痰情況、痰量評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 評(píng)分及淋巴細(xì)胞百分比評(píng)分進(jìn)行測(cè)定。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)。3.根據(jù)兩個(gè)證型臨床驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)果,考慮感染后咳嗽在患病人群中更為常見,患者量較大,且在臨床上沒有較為 有效的治療手段,因此選擇其作為射干藥材作用機(jī)制研究的方向。實(shí)驗(yàn)選取40只SPF級(jí)豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為4組,分別為空白組、 模型組、射干提取物組（600 mg/kg/天），中藥陽(yáng)性（肺寧片512mg/kg/天）對(duì)照組， 每組10只。采用煙熏、RSV滴鼻、枸椽

5、酸霧化誘咳,建立豚鼠合胞病毒感染后咳 嗽模型。造模后,除模型組外,其它各給藥組在第8天時(shí)開始給藥,連續(xù)給藥7天,空白 組給予等體積生理鹽水。末次給藥后45 min,將實(shí)驗(yàn)豚鼠用2%戊巴比妥（25 mg/kg） 麻醉后仰臥固定于操作臺(tái)，采集血液及肺組織等實(shí)驗(yàn)研究用樣本。觀察模型動(dòng)物給藥前后白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)變化;HE染色觀察肺組織形 態(tài)學(xué)變化;觀察治療前后咳嗽次數(shù)的變化;采用HPLC-MS測(cè)定肺組織中花生四烯 酸含量的變化。4.從花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)的多靶標(biāo)藥物研究思路出發(fā),利用分子 對(duì)接的技術(shù),借助虛擬篩選手段,對(duì)射干抗炎可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)（基于分子通過國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索及TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，歸

6、納了已報(bào)道的分子結(jié)構(gòu)明確的50 個(gè)射干異黃酮類化合物;利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得了與花生四烯酸代謝途徑相關(guān) PLA2、COX-1、COX-2、5-LOX、LTA4H、CYP450蛋白結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處理和配 體結(jié)構(gòu)構(gòu)建選用Sybyl6.91軟件包,分子對(duì)接研究由Auto Dock 4.02軟件完成， 并由 Discovery Studio Visuliazer 4.0 軟件包觀察結(jié)果。從晶體結(jié)構(gòu)中提取共結(jié)晶配體作為對(duì)照分子，以相對(duì)分值(R二化合物分值/對(duì) 照分子分值)來(lái)比較化合物與靶點(diǎn)的作用強(qiáng)度。將射干中50個(gè)異黃酮類化學(xué)成分 與花生四烯酸3條通路上的7個(gè)主要蛋白靶點(diǎn)PLA2、COX-1、COX

7、-2、5-LOX、LTA4H、 CYP450(2vn0、5a5i)分別進(jìn)行分子對(duì)接,根據(jù)評(píng)分結(jié)果模擬射干藥材抗炎作用機(jī) 制。5.根據(jù)分子對(duì)接相對(duì)應(yīng)的分值(R)結(jié)果,模擬出射干藥材可能通過抑制 COX-2、5-LOX和CYP450等信號(hào)通路發(fā)揮多途徑、多靶點(diǎn)抗炎作用。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采 用Western-blot法檢測(cè)模型動(dòng)物豚鼠給藥后肺組織中COX-2和5-LOX蛋白表達(dá) 水平;采用蛋白試劑盒提取肺組織中蛋白，并采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)待測(cè)靶標(biāo)蛋白分子量確定分離膠濃度。采用HPLC-MS-MS法;格列本脲 (DHDT系歹列)和PGB1(PGs和HETE系歹列)為內(nèi)標(biāo)物；乙酸乙酯提取,合并上清液,

8、氮 氣吹干，100 L甲醇溶解，13500 r/min離心5 min后，吸取上清液作為供試品溶 液；10 mmol/L醋酸銨水溶液(A):甲醇(B)0-15 min,52-68%B為流動(dòng)相，流量0.3 ml/min,柱溫40c進(jìn)樣量5 L檢測(cè)花生四烯酸COX通路代謝產(chǎn)物TXB2、PGD2、 PGE2;水(A)乙月青(B)48:52為流動(dòng)相，流量0.3 ml/min,柱溫40,進(jìn)樣量5 L 檢測(cè) CYP 通路代謝產(chǎn)物 8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET;水(A)一乙月青（B）38:62,柱溫30,流量0.3 ml/min,進(jìn)樣量5 L檢測(cè)LOX通路代謝產(chǎn)物5HETE、1

9、5HETE的變化，明確射干藥材抗炎作用機(jī)制。結(jié)果:1.射干功能主治本草考證研究結(jié)果表明，射干始載于神農(nóng)本草經(jīng)， 從古至今為治療咽喉腫痛及痰多咳喘的常用藥,具有清熱解毒、宣肺化痰功能， 用于治療咳嗽、發(fā)熱、口渴、咯痰等病癥?；谄諠?jì)方數(shù)據(jù)庫(kù)古方配伍應(yīng)用 考證結(jié)果表明，含射干復(fù)方所治疾病以喉痹咽痛、咳嗽、咳喘、咽干、痰熱壅盛 諸病與2015年版藥典一部所記功能主治完全吻合。所治腳氣、調(diào)經(jīng)等作用，藥典一部則未收錄?，F(xiàn)代文獻(xiàn)學(xué)研究表明，射干 具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等藥理作用。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論研究結(jié)果,考慮急性氣管-支氣管炎（風(fēng)邪犯肺證）及感 染后咳嗽（余熱未清證）在炎性表現(xiàn)方面一急一慢,發(fā)病

10、方面風(fēng)熱犯肺表現(xiàn)在前期, 后期入里化熱、余熱未清,頗具代表性,故選擇此二證為射干臨床應(yīng)用試驗(yàn)病征。 2.基于射干藥材最佳臨床適應(yīng)病種的急性氣管-支氣管炎和感染后咳嗽臨床評(píng)價(jià) 結(jié)果表明:從日間咳嗽評(píng)分、夜間咳嗽評(píng)分、咳痰情況、痰量評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù) 評(píng)分、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分及淋巴細(xì)胞百分比評(píng)分方面,射干制劑均有良好效果。雖然與對(duì)照藥肺寧片比無(wú)顯著性差異，但射干制劑治療組相關(guān)指標(biāo)優(yōu)于肺寧 片組。提示基于傳統(tǒng)文獻(xiàn)與現(xiàn)代文獻(xiàn)研究的臨床最佳病種選擇這一中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī) 學(xué)研究思路具有一定的可行性。3 .在射干制劑臨床應(yīng)用最佳病種篩選基礎(chǔ)上,選擇病毒感染后咳嗽動(dòng)物模型 作為藥物初步作用模式研究的動(dòng)物模型。體內(nèi)動(dòng)

11、物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)制RSV感染 豚鼠咳嗽模型,通過檢測(cè)豚鼠肺組織勻漿能引起Hep-2細(xì)胞病變,證實(shí)合胞病毒 感染成功;肺組織病理學(xué)檢查支持氣道炎癥改變明顯，而肺實(shí)質(zhì)炎癥無(wú)明顯改變；模型動(dòng)物組血清中，白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及 嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與空白組相比，均無(wú)顯著差異;動(dòng)物模型組5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著 高于空白組。干預(yù)藥物射干制劑組能明顯抑制模型動(dòng)物5 min內(nèi)咳嗽次數(shù),減輕肺組織中 支氣管和周圍炎癥，降低肺組織中花生四烯酸含量。據(jù)此推測(cè),射干藥材通過干預(yù) 花生四烯酸炎癥代謝網(wǎng)絡(luò)達(dá)到抗炎、止咳作用。4 .模型動(dòng)物藥效學(xué)評(píng)價(jià)及作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明射干藥材的抗炎作用與花

12、生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)。因此,通過分子對(duì)接技術(shù),利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及分子對(duì)接軟 件,分別模擬了射干藥材所含50個(gè)黃酮類化合物的分子量、氫鍵給體、氫鍵受體 及脂水分配系數(shù),結(jié)果表明射干黃酮類化合物符合“Lipinski”類藥性規(guī)則,表明 射干黃酮具有良好的類藥性。射干黃酮成分與花生四烯酸代謝通路七個(gè)抗炎靶點(diǎn)的打分值依次為:COX-2 > 5-LOX > COX-1 > CYP450(5a5i) > PLA2 > LTA4H > CYP450(2vn0),其中射干黃酮 成分與COX-2對(duì)接結(jié)果最好,50個(gè)化合物的結(jié)合常數(shù)均大于對(duì)照分子。與5-LOX 和COX-1對(duì)接結(jié)

13、果較好,R值均大于0.8。與CYP450(5a5i)亞型分子對(duì)接的相對(duì)分值也較好,有43個(gè)化合物的分值三 0.8,。表明射干藥材所含黃酮類成分可能通過多成分、多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎、 止咳作用，其作用途徑可能與COX、5-LOX及CYP450有關(guān)。5 .基于分子對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用Western-blot檢測(cè)模型動(dòng)物豚鼠肺組織 中COX-2和5-LOX蛋白表達(dá)水平。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較,模型組 COX-2、5-LOX蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),說(shuō)明所建立合胞病毒感染豚 鼠咳嗽模型可激活花生四烯酸代謝COX-2和5-LOX信號(hào)通路，使得致炎性花生四 烯酸代謝

14、產(chǎn)物大量生成。射干提取物組COX-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而5-LOX蛋白表達(dá) 無(wú)顯著降低(P>0.05),提示射干藥材可能通過抑制花生四烯酸COX-2代謝途 徑,減少致炎性代謝產(chǎn)物的生成?；ㄉ南┧岽x產(chǎn)物含量測(cè)定結(jié)果表明:在COX 代謝途徑研究中,應(yīng)用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定了其信號(hào)通路代謝產(chǎn)物PGD2、TXB2、 11HETE和PGE2的含量。與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織中PGD2、TXB2、11HETE含量顯著升高 (P<0.05),給予射干提取物后各代謝產(chǎn)物含量均下降(P<0.05)。結(jié)合蛋白 印跡結(jié)果，推測(cè)射干提

15、取物可能是通過抑制COX2表達(dá)，降低代謝產(chǎn)物PGD2、TXB2、 11HETE的釋放,減緩炎癥的進(jìn)程。在LOX代謝途徑研究中,應(yīng)用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定了其信號(hào)通路代謝產(chǎn)物 5HETE和15HETE的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較,模型組肺組織中 5HETE和15HETE含量顯著升高(P<0.05),說(shuō)明所建立豚鼠感染后咳嗽模型可 激活A(yù)A代謝LOX途徑，使得致炎性AA代謝產(chǎn)物5HETE和15HETE大量生成。給予射干提取物后各代謝產(chǎn)物含量有降低趨勢(shì),但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合 蛋白印跡結(jié)果，推測(cè)射干提取物對(duì)LOX及其代謝產(chǎn)物的抑制作用不明顯。在 CYP450 途徑中，測(cè)定了代

16、謝產(chǎn)物 8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET 和16HETE的含量。與正常對(duì)照組比較,模型組肺組織中16HETE含量顯著升高(P<0.05),給予射干提取物后16HETE含量有降低趨勢(shì)，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是給藥組的11,12-DHET、14,15-DHET含量顯著降低(P<0.05)。推測(cè)射 干提取物能影響CYP表氧化酶途徑生成11,12-DHET、14,15-DHET。結(jié)論:1.射干從古至今為治療咽喉腫痛及痰多咳喘的常用藥,通過古典醫(yī)籍 考證及現(xiàn)代藥理研究,具有清熱解毒、宣肺化痰之功效，推測(cè)射干適合治療風(fēng)熱病 邪引起的病癥,主要包括余熱

17、未清證和風(fēng)熱犯肺證。2.射干制劑在治療感染后咳 嗽及急性氣管-支氣管炎具有很好臨床療效,表明基于古典醫(yī)籍和現(xiàn)代文獻(xiàn)確定 藥物治療病種這一中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)思路具有一定的可行性。3.采用RSV感染豚鼠可以成功復(fù)制病毒感染咳嗽模型；中藥射干提取物能明 顯抑制模型動(dòng)物咳嗽次數(shù),減輕肺組織炎癥，降低肺組織中花生四烯酸含量,表明 射干藥材通過干預(yù)花生四烯酸炎癥通路發(fā)揮抗炎、止咳作用。4.基于射干藥材活 性組分的分子對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:射干黃酮類成分干預(yù)花生四烯酸炎癥通路 達(dá)到抗炎作用途徑可能與COX和5-LOX靶點(diǎn)相關(guān);射干藥材與花生四烯酸代謝通 路七個(gè)抗炎靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)合自由能依次為:COX-2 > 5-LOX > COX-1 >