1、人類免疫缺陷病毒（I型）核酸定量檢測(cè)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 .目的：規(guī)范超敏PCR儀器配置系統(tǒng)及人類免疫缺陷病毒（HIV-I RNA）的檢測(cè)過(guò)程，確保 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。2 .檢測(cè)方法和原理2.1 檢測(cè)方法：TaqMan探針熒光定量PCR法。2.2 檢測(cè)原理：人類免疫缺陷病毒（I型）核算定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光法）采用核酸擴(kuò) 增技術(shù)，定量檢測(cè)人血漿中HIV-I RNA。該方法包括三個(gè)主要步驟：（1）樣品制備以分離HIV-I RNA；（2）靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄形成互補(bǔ)DNA（cDNA）；（3）靶（cDNA）的PCR擴(kuò)增以及裂解的、 靶特異性的、雙標(biāo)記寡核甘酸探針的檢測(cè)。3 .標(biāo)本要求3.1

2、標(biāo)本類型：血漿（EDTA抗凝）。3.2 標(biāo)本的采集與處理3.2.1 標(biāo)本采集量：采集患者靜脈血6 mL（EDTA抗凝真空采血管）。3.2.2 標(biāo)本處理：標(biāo)本采集后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后在1小時(shí)內(nèi)處理 標(biāo)本。3.2.2.1 簽收：門診、住院以及CDC標(biāo)本簽收條碼，并做好相關(guān)登記工作。3.2.2.2 編號(hào)：對(duì)標(biāo)本進(jìn)行唯一編號(hào)，內(nèi)容如下：“年月日6位數(shù)字+標(biāo)本號(hào)3位數(shù)字”，例 如2018年1月1日收到一個(gè)HIV-RNA標(biāo)本即編號(hào)為：“180101401”。3.2.2.3 離心：800-1600g,20min 離心標(biāo)本。3.2.2.4 標(biāo)本保存：血漿在室溫（25-30）最多存儲(chǔ)1天；

3、2-8最多存儲(chǔ)6天；-20 一 -80可存儲(chǔ)6周。將待檢血漿以2管每管1200 uL量存儲(chǔ)于2.0mL戴螺旋蓋的無(wú)菌聚丙烯 管，在管壁編寫如3.2.2.2的編號(hào)。未檢標(biāo)本放置于專用樣本盒中，凍存于-80 冰箱。 已檢血漿置-80°C冰箱保存2個(gè)月，到期后按科室有關(guān)程序作廢棄標(biāo)本處理。4 .儀器和試劑4.2試劑：（配套封閉試劑）4.2.1 試劑盒（包含核酸提取試劑、質(zhì)控品及陽(yáng)性定量參考品組分、PCR檢測(cè)試劑組分）保 存于2-8環(huán)境下，有效期22個(gè)月。4.2.3 試劑開(kāi)瓶后，在室溫條件下放置時(shí)間不應(yīng)超過(guò)72小時(shí)；2-8條件下不超過(guò)30天。4.2.4 主要組成成份：組份名稱規(guī)格數(shù)量質(zhì)控品陰

4、性質(zhì)控品1000P L/ 管1臨界陽(yáng)性質(zhì)控品1000p L/ 管1強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品1000p L/ 管1HIV2CS148測(cè)試1HIV2CS248測(cè)試1HIV2CS348測(cè)試1HIV2CS448測(cè)試15 .標(biāo)準(zhǔn)操作5.1 COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 的配置如下:配置實(shí)驗(yàn)所需的架子和耗材相應(yīng)位置COBAS AmpliPrep_COBASTaqMan 48a. K-tubes放在樣本架上b. 帶有 K-tips 的 K-tip 架c將帶有樣本或質(zhì)控的S-tubes放在樣本架上d. 帶有SPUs的SPU-架e. CS1放在一個(gè)試劑架f. CS2, CS3, CS4放在

5、一個(gè)試劑架g. 將軍的K-carrier放在K-carrier架上樣本核酸提取完成后：F-HM-PF-HJ-LAB-EM-P(M-P)K-carrier上的K-tubes手工轉(zhuǎn)移6.2. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用試劑及耗材的保存及注意事項(xiàng):1) .所有試劑(HIV-I test試劑)2-8保存，即拿即用;2) .試劑啟用后，可保存28 days (2-8)；3) .試劑啟用后，在Cobas Ampliprep上累計(jì)使用時(shí)間最多64 hrs；4) . CTM(-)陰性質(zhì)控、L(+)弱陽(yáng)性質(zhì)控、H(+)強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控，使用后的廢棄；5) .洗液2-30保存，

6、打開(kāi)后可使用28 days；6) .耗材(S-tube/樣本條碼/K-tip/K-tube/SPU)常溫保存。6.3. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用樣本的保存及注意事項(xiàng)：1) .需要的樣本為血漿；2) .血樣在225 下運(yùn)輸，24hrs內(nèi)(HIV RNA)收集出血漿(室溫800-1600g離心20分 鐘)；3) . HIV RNA檢測(cè)：血漿可在室溫下(25-30)保存最多1天，在28最多保存6天，或 者-20-80下長(zhǎng)期保存，至少6周；4) .血漿建議倒取1100-1200 ”L進(jìn)行保存；5) .血漿冷凍時(shí)，最多凍融5次不損失HIV RNA。6.4. C

7、OBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 HBV DNA 定量檢測(cè)操作流程：A儀器初始化及維護(hù)A1打開(kāi)COBAS AmpliPrep和COBAS TaqMan開(kāi)關(guān)，等待儀器初始化完成，為stand-by 狀態(tài)A2登陸電腦及AMPLILINK軟件登陸Windows® XP操作系統(tǒng)(User ID 和 password)a)雙擊桌面上AMPLILINK軟件圖標(biāo)b)登陸AMPLILINK 軟件(User ID 和 password)A3通過(guò)軟件Status界面檢查洗液量是否足夠，如不夠需要更換新的洗液A4檢查軟件維護(hù)界面Due按鈕下的出的需要進(jìn)行的維護(hù)內(nèi)容，按照維護(hù)手冊(cè)

8、進(jìn)行相應(yīng)內(nèi)容的維護(hù)工作，COBAS AmpliPrep儀器自動(dòng)進(jìn)行系統(tǒng)初始化工作B加載試劑將所有試驗(yàn)需要的試劑匣從2-8°C冰箱拿出，立即放在試劑架上并放入COBAS AmpliPrep儀器中，試驗(yàn)開(kāi)始前在儀器上平衡至少30分鐘。不要將試劑匣放在儀 器外進(jìn)行溫度平衡，以免在試劑匣表面形成水凝結(jié)，造成條碼的損壞。如果在試 劑匣表面有水凝結(jié)，不要對(duì)條碼部位進(jìn)行擦拭，以免損壞條碼造成儀器無(wú)法對(duì)條 碼進(jìn)行辨識(shí)。B1將CS1試劑匣放在一個(gè)試劑架上，將試劑匣CS2, CS3 和CS4放于另一個(gè)試劑架 上B2將放有CS1的試劑架放入到8845 AmpliPrep儀器中的A位置B3將放有CS2, C

9、S3和CS4的試劑架放入到COBAS AmpliPrep儀器中的B、C、D、E 的任一位置C加載耗材注意：根據(jù)檢測(cè)的樣本數(shù)計(jì)算需要的COBAS AmpliPrep試劑匣數(shù)目，樣本處理單 元(SPU),樣本管。一林6), K-槍頭(K-tips)和K-管(K-tubes)的數(shù)量。每個(gè) 樣本或質(zhì)控分別需要一個(gè)SPU, 一個(gè)S-tube, 一個(gè)K-tip和一個(gè)K-tube。C1加載樣本處理單元(SPUs)計(jì)算需要SPU數(shù)量，一個(gè)樣本或質(zhì)控需要一個(gè)SPU將SPUs 放入到SPU架中，向下壓SPU的邊緣部分(不要碰至歸-tip的部分)使SPU完全坐穩(wěn)在SPU架的底部確認(rèn)SPUs正確的放入在SPU架中(若

10、SPUs放置不止確，可能造成儀器運(yùn)行中停止)將SPU架放入到8845 AmpliPrep儀器的J, K或L位置C3使用COBAS TaqMan 48 分析儀時(shí)，將K-carriers K-carrier 架上，放在COBASAmpliPrep 的M, N, O 或 P 位置C4加載K-tip 架于COBAS AmpliPrep 上M, N, O 或 P 位置D創(chuàng)建命令和加載樣本D1樣本架準(zhǔn)備，將樣本的條碼夾放在樣本架上相應(yīng)有樣本管(S-tube)的地方將專用于質(zhì)控的條碼夾放在樣本架上與陰性質(zhì)控(-)C,弱陽(yáng)性質(zhì)控L(+)和強(qiáng) 陽(yáng)性質(zhì)控相對(duì)應(yīng)的地方注意對(duì)相應(yīng)的質(zhì)控使用正確的質(zhì)控條碼夾D2 &am

11、p;D3通過(guò)AMPLILINK軟件創(chuàng)建命令(見(jiàn)下圖)在軟件orders界面下的Sample rack按鈕下創(chuàng)建樣本及質(zhì)控的命令選擇相應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目，并進(jìn)行保存打印創(chuàng)建好的樣本及質(zhì)控工作表D4 &D5在生物安全柜中進(jìn)行樣本準(zhǔn)備渦旋混勻樣本及質(zhì)控3-5秒，將1000同樣本及質(zhì)控品轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的樣本管S-tube中；避免將顆?；蚰龎K狀物質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣本管8-皿匕6中裝有樣本及質(zhì)控的樣本管放到樣本架相應(yīng)的位置（與創(chuàng)建好的命令工作表中的 位置一致）；確保質(zhì)控條碼上的10t號(hào)碼與質(zhì)控的10t號(hào)碼一致；確保相應(yīng)的質(zhì) 控使用正確的質(zhì)控條碼夾；避免樣本或質(zhì)控污染樣本管$-皿匕6的上部D6加載帶有樣本管的樣本架于

12、COBAS AmpliPrep儀器的F, G或H位置E開(kāi)始運(yùn)行COBAS AmpliPrep儀器E1在AMPLILINK軟件上啟動(dòng)運(yùn)行COBAS AmpliPrep檢查Status界面下，確保沒(méi)有樣本、質(zhì)控或試劑被鎖住確保所有的樣本和耗材都已加載到COBAS AmpliPrep中，點(diǎn)擊Start按鈕FCOBAS AmpliPrep儀器運(yùn)行結(jié)束后，手工轉(zhuǎn)移提取好的樣本到COBAS TaqMan48 中，應(yīng)避免將所有提取好的樣本及質(zhì)控直接放置于日光或光源下F1檢查AMPLILINK軟件中可能顯示的標(biāo)記flags及錯(cuò)誤信息F2在COBAS AmpliPrep處理好的樣本及質(zhì)控必須在120分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到

13、COBAS TaqMan48中開(kāi)始反應(yīng)，不要冷凍或在2-8°C儲(chǔ)存處理好的樣本及質(zhì)控。F3丟棄COBAS AmpliPrep儀器中的廢物G加載處理好的樣本及質(zhì)控G1加載處理好的樣本及質(zhì)控到COBAS TaqMan 48中-通過(guò)K-carrier轉(zhuǎn)移工具，手工轉(zhuǎn)移帶有 K-carrier 的 K-carrier 架到COBAS TaqMan 48 中01.11.2006 19:36AdmnistratorjrJ 必昌iDiagnosticsSainpleQua 如 CortrdK-CatnerA-RinaSample Rack ID . Batch ID| Date06.11.2006

14、Sample Rack ID08.11.2006CommenJ25.10.2006、annpie iU111他中中Number Test| Cl討HIVLD 1HIVLO 1HCMCAP96 $N00022001HCMCAP96 5L00022002HIV10 1HCMCAP9G SH00022003ORDEF )004HCMCAP9G $500022004ORDEF XK6HCMCAP96 SS00022005ORDEF )006I HCMCAP96 SS00022006ORDEF KO7I HCMCAP96 $S00022007HCMCAPjHIMUPP48ORDEF J008ORDEF

15、XCSORDEF »10ORDEF )911ORDEF »12QRDEF »13ORDEF D14ORDEF )015ORDEF 3D1SORDEF »17ORDEF »18ORDEF »19ORDEF 麻ORDEF »21ORDEF KI22ORDEF 的ORDEF »2WHIMCAP96| HCMCAP9B $S00022008 HCMCAP96 $500022009HCMCAP96 5S(X»22O1OHCMCAP96 $00022011HCMCAP96HCMCP96HCMCAP96SS000220

16、12 $500022013 $800022014HCMCAP96 $500022015HCMCAP9G$S 0002201 £HCMCAP96 5500022017HCMCAP96 $00022018| HCMCAP96 $500022019| HCMCAP96 $500022020| HCMCAP9G $500022021| HCMCAP9B $500022022HCMCAP96 5500022023HCMCAP9G $500022024H開(kāi)始運(yùn)行COBAS TaqManH1打開(kāi)擴(kuò)增儀的外部蓋子，將K-carrier放入到擴(kuò)增模塊中并關(guān)閉蓋子，開(kāi)始運(yùn)行 COBAS TaqMan 4

17、8ICOBAS TaqMan 48 運(yùn)行結(jié)束I1運(yùn)行結(jié)束，打印結(jié)果報(bào)告檢查結(jié)果中的標(biāo)記flags或錯(cuò)誤信息接受結(jié)果，數(shù)據(jù)自動(dòng)備份(archive)I2將檢測(cè)完畢的K-tubes從COBAS TaqMan 48的廢物盒中拿出，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn) 行相應(yīng)處理或丟棄7 .質(zhì)量控制7.1 陰性質(zhì)控品：必須產(chǎn)生“沒(méi)有檢測(cè)到目標(biāo)”的結(jié)果。如果有標(biāo)記標(biāo)為無(wú)效，那么整個(gè)批 次都是無(wú)效的。7.2 陽(yáng)性質(zhì)控品：陽(yáng)性質(zhì)控品的檢測(cè)值應(yīng)該落在其指定的范圍內(nèi)，如果一個(gè)或兩個(gè)質(zhì)控品標(biāo) 記表示無(wú)效，那么整個(gè)批次無(wú)效。8 .結(jié)果報(bào)告對(duì)于有效批次，檢查每個(gè)樣品是否在結(jié)果打印中出現(xiàn)標(biāo)記或注釋。結(jié)果解釋如下：有效 批次可能包括有效和無(wú)

18、效樣品的結(jié)果，這取決于每個(gè)樣品是否得到標(biāo)記和/或注釋。樣品結(jié)果解釋如下:測(cè)定結(jié)果解釋沒(méi)有檢測(cè)到目標(biāo)HIV-I的CT值超出該檢測(cè)的界限之上或者未能獲得HIV-I的 CT 值。報(bào)""HIV-I RNA not detected”。<2.00E+01cp/mL計(jì)算所得的cp /mL結(jié)果低于該檢測(cè)試劑檢測(cè)限。報(bào)告為“<20 cp /mL”三 2.00E+01 cp/mL 且 W1.00E+07 cp/mL該區(qū)間為檢測(cè)系統(tǒng)的線性范圍>1.00E+07 cp /mL結(jié)果超出線性范圍。報(bào)告”>1.00E+07cp/mL"。如果希望得 到定量結(jié)果，必須稀釋原始樣本，重復(fù)該測(cè)試。以1： 100與 HIV-I陰性經(jīng)EDTA處理人類血漿稀釋。根據(jù)稀釋因子換算最 終的結(jié)果。9 .性能參數(shù)9.1 最低檢出限及定量限：試劑最低檢出限濃度為20 cp/mL。9.2 精密度：檢測(cè)高濃度(1.00E+07 cp/mL)，低濃度(2.00E+01 cp/mL)HIV樣本，批內(nèi)及批間的檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值的變異系數(shù)(CV%)均小于5%。9.3 線性范圍：本試劑盒的線性范圍為20 cp/mL1.00E+07 cp/mL之間呈線性。以高濃度的HIV定值樣本，梯度稀釋12個(gè)濃度為待檢樣