1、 1、從微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)購買菌種； 2、從自然界或現(xiàn)有菌種中分離篩選菌種； 3、對篩選出的菌種進(jìn)行改良從而獲得新種。 1、國內(nèi)主要菌種保藏機(jī)構(gòu) 1979年國家科委主持成立了普通、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、獸醫(yī)、林業(yè)、醫(yī)學(xué)、藥用7個(gè)國家專業(yè)微生物菌種保藏中心。 目前中國在世界菌種保藏中心聯(lián)合會注冊的菌種保藏中心達(dá)20個(gè)。除此之外，許多其他的科研或生產(chǎn)機(jī)構(gòu)也保藏有大量微生物菌種。目前我國保藏的10萬株微生物菌種保藏在近30多個(gè)單位。 （1）中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）：開展工業(yè)微生物菌種的保藏、銷售、分離、鑒定、培訓(xùn)與咨詢五個(gè)方面工作。還編輯出版了中國工業(yè)微生物菌種目錄并備有幾十種國際菌種保藏聯(lián)

2、合會成員機(jī)構(gòu)的菌種目錄以供查詢。 （2）中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會：下設(shè)9個(gè)庫，中國普通微生物爆倉管理中心；中國病毒保藏中心；細(xì)胞庫；昆明細(xì)胞庫；基因庫；植物離體種質(zhì)庫；稀有瀕危特有植物種質(zhì)庫；海洋生物種質(zhì)庫及淡水藻種庫。此外，還成立信息網(wǎng)絡(luò)中心。 （1）國際菌種保藏聯(lián)合會（WFCC） （2）美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC） （3）美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心（NRRL） （4）日本技術(shù)評價(jià)研究所生物資源中心（NBRC） （5）荷蘭微生物菌種 保藏中心（CBS） （6）德國微生物菌種 保藏中心（DSMZ） （7）英國國家典型微生物菌種 保藏中心（NCTC） 從自然界分離微生物菌種是最初獲

3、得工業(yè)微生物菌種的主要方式。 從土壤中分離微生物菌種是典型分離方式之一。 但土壤中種類繁雜，要想獲得目標(biāo)菌種將花費(fèi)大量時(shí)間和資金。 如美國輝瑞制藥有限公司為了獲得一個(gè)廣譜抗生素，花費(fèi)了數(shù)百萬美元；美國默沙東公司分離了10000株菌株，才獲得1株有用的微生物；美國禮來公司花了10年時(shí)間從40萬株微生物發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新抗生素菌株?？梢姴唤?jīng)濟(jì)。 1.采樣：（1）選擇采樣地點(diǎn)中性偏堿：細(xì)菌和放線菌多酸性紅土壤及森林土壤：霉菌多果園、菜園、野果生長區(qū)（富含碳水化合物）和沼澤池：酵母和霉菌多。（2）確定采樣時(shí)間秋初好：溫度適中，雨量不多。夏季或冬季土壤微生物存活量少，暴雨后顯著減少。（3）采樣5cm15cm處

4、取土。放在牛皮紙袋或玻璃屏或聚乙烯袋中，標(biāo)明樣品種類、采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等采集的樣品應(yīng)及時(shí)處理，暫不處理應(yīng)放在4保存。 認(rèn)為 地加入一定的限制因素，以使所需的微生物增殖后在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢。 （1）控制培養(yǎng)基中碳源的種類 可選定糖、淀粉、纖維素等，以其中一種作為唯一碳源，讓其中一種生長，其他死亡。 （2）添加某些抑制因子或促進(jìn)因子 培養(yǎng)基中加抗真菌劑，可以抑制真菌生長；培養(yǎng)基中加入15ml天然浸出汁作為促進(jìn)因子，可以分離出不同的放線菌。 （3）控制培養(yǎng)條件：如分離梭狀芽胞桿菌，可利用該菌的厭氧特性，控制好氧菌就不易生長而受到抑制，只有艷陽可以優(yōu)勢生長。 （1）稀釋分離法

5、 （2）劃線分離法 （3）組織分離法 這種從自然界分離得到的純種稱為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得到的菌株是否具有實(shí)用價(jià)值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須通過三角瓶進(jìn)行小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 如果得到的野生型菌株產(chǎn)量偏低，達(dá)不到生產(chǎn)要求，仍可以作為保留作為菌種選育的出發(fā)菌株。 分離篩選獲得菌種，不能直接進(jìn)行實(shí)際生產(chǎn)，要經(jīng)過選育。 選育方法：自然選育、誘變選育、雜交選育、原生質(zhì)體融合、基因工程。 自然選育：不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，從而選育出優(yōu)良菌種的過程。 具有實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和善于觀察的工作人員根據(jù)自發(fā)突變而出現(xiàn)的菌種形狀變化，選育出優(yōu)良菌種。 例如谷氨酸發(fā)酵過程中，人們從被噬菌體污染的發(fā)酵液中分

6、理處抗噬菌體菌種；抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，從某一批次高產(chǎn)的發(fā)酵液中取樣進(jìn)行分離，往往得到較穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。 自發(fā)突變幾率低。 （一）誘變育種的一般步驟 誘變育種：是指利用人工的方法處理微生物，使它們發(fā)生突變，再從中篩選出符合要求的突變菌株，供生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)用。 意義重大，應(yīng)用廣泛。 具有操作簡便、速度快和收獲大的優(yōu)點(diǎn)。 步驟： 1.出發(fā)菌種選擇 2.誘變處理 3.篩選突變株。 出發(fā)菌株是指用于誘變的原始菌種。 選擇原則：菌種對誘變劑的敏感性強(qiáng)、變異幅度大、產(chǎn)量高。 獲得途徑：（1）從自然界的土樣或水樣中分離出來的野生型菌種；（2）生產(chǎn)中正在使用的菌種；（3）從菌種保藏機(jī)構(gòu)購買 培養(yǎng)中的細(xì)胞不處于同一

7、生長階段，它們的生理狀態(tài)和代謝活動也不完全一樣。 同步培養(yǎng)法：使培養(yǎng)的微生物比較一致，生長發(fā)育在同一階段上的培養(yǎng)方法。 在誘變育種前，最好選用生理狀態(tài)一致的單細(xì)胞或單孢子。 方法有：機(jī)械法和誘導(dǎo)法膜洗脫法同步培養(yǎng)方法機(jī)械法（選擇法）誘導(dǎo)法離心沉降分離法溫度調(diào)整法營養(yǎng)條件調(diào)整法特點(diǎn)：同步生長只能維持幾代機(jī)械法膜洗脫法離心沉降分離法小細(xì)胞沉淀慢通過大小不同的微孔過濾器 主要通過控制環(huán)境條件：如溫度、營養(yǎng)物質(zhì)等來誘導(dǎo)同步生長。 （1）溫度調(diào)整法 將溫度控制在接近最適溫度條件下一段時(shí)間，緩慢進(jìn)行新陳代謝，但不進(jìn)行分裂。然后再將溫度提高到最適生長溫度，大多數(shù)細(xì)胞進(jìn)行同步分裂。 （2）營養(yǎng)條件調(diào)整法 控制

8、培養(yǎng)基的濃度或培養(yǎng)基的組成以達(dá)到同步生長。例如限制碳源或其他營養(yǎng)物，使細(xì)胞只能進(jìn)行一次分裂而不能繼續(xù)生長，從而獲得剛分裂的細(xì)胞群體，然后轉(zhuǎn)入適宜的培養(yǎng)基中，它們便進(jìn)入了同步生長。 另外有在培養(yǎng)基中加入某種抑制蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)（如氯霉素）誘導(dǎo)一定時(shí)間后再轉(zhuǎn)到另一種完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；或用紫外線處理；對光合行微生物的菌體可采用光照與黑暗交替處理法等。 總之：不管采用哪種誘導(dǎo)因子，都必須具有以下特性：不影響生物的生長，但可特異性地抑制細(xì)胞分裂，當(dāng)移去（或消除）該抑制條件后，微生物又可立即同時(shí)出現(xiàn)分裂。 目的：為了每個(gè)細(xì)胞都能接觸誘變劑。 用無菌生理鹽水或緩沖溶液配制。 菌懸液細(xì)胞或孢子濃度：10610

9、8個(gè)/mL。 酵母菌或霉菌： 106107個(gè)/mL 細(xì)菌或放線菌：108個(gè)/mL。 另外為保證誘變效果，注意分散度。先加玻璃珠振蕩分散，用脫脂棉或?yàn)V紙過濾，這樣分散度可達(dá)90%以上。 （1）誘變劑種類 包括物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。 物理誘變劑：紫外線、X射線、射線、快中子等。 化學(xué)誘變劑：硫酸二乙酯、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（NTG)和甲基亞硝基脲（NMU）等。 （2）劑量：要確定一個(gè)合適的劑量通常要進(jìn)行多次試驗(yàn)。一般地，突變率隨劑量的提高而提高，但達(dá)到一定程度后，再提高劑量反而使突變率下降。紫外線作誘變劑時(shí)表明：正向突變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，

10、高劑量更容易出現(xiàn)負(fù)變。因此，在誘變育種工作中，目前比較傾向于采用低劑量。過去，殺菌率99%劑量，近年來采用殺菌率3075%劑量。 另外有誘變劑的復(fù)合處理，包括兩種或多種誘變劑的先后使用，一種誘變劑的重復(fù)使用，兩種或多種誘變劑的同事使用等，常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，對育種有利。 篩選的目的：通過盡可能少的工作，將誘變后可能出現(xiàn)的正突變菌株從大量的突變菌株中正分鑒定出來。 分初篩和復(fù)篩兩步。 （1）初篩：快速對單個(gè)菌落進(jìn)行定性。平板稀釋法獲得單個(gè)菌落，再確定單個(gè)菌落是否為正突變型菌株。例如：抗生素選擇抑菌圈大的菌落，蛋白酶選擇透明圈大的菌落。 （2）復(fù)篩：對初篩后獲得的菌株進(jìn)行有關(guān)性狀的精確定量 是利

11、用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的“形態(tài)” 變化。 比如：變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等。 這些生理效應(yīng)的大小表示了變異菌株生產(chǎn)能力的高低。 1）紙片培養(yǎng)顯色法 將飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片擱于培養(yǎng)皿中,用牛津杯架空,下放小團(tuán)浸有3%甘油的脫脂棉以保濕,將待篩選的菌懸液稀釋后接種到濾紙上,保溫培養(yǎng)形成分散的單菌落,菌落周圍將會產(chǎn)生對應(yīng)的顏色變化.從指示劑變色圈與菌落直徑之比可以了解菌株的相對產(chǎn)量性狀.指示劑可以是酸堿指示劑也可以是能與特定產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)生顏色的化合物. 2) 變色圈法 將指示劑直接摻入固體培養(yǎng)基中,進(jìn)行待篩選菌懸液的單菌落培

12、養(yǎng),或噴灑在已培養(yǎng)成分散單菌落的固體培養(yǎng)基表面,在菌落周圍形成變色圈.如在含淀粉的平皿中涂布一定濃度的產(chǎn)淀粉酶菌株的菌懸液,使其呈單菌落,然后噴上稀碘液,發(fā)生顯色反應(yīng).變色圈越大,說明菌落產(chǎn)酶的能力越強(qiáng).而從變色圈的顏色又可粗略判斷水解產(chǎn)物的情況. 3) 透明圈法 在固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分,造成渾濁、不透明的培養(yǎng)基背景.將待篩選在菌落周圍就會形成透明圈,透明圈的大小反映了菌落利用此物質(zhì)的能力. 在培養(yǎng)基中摻入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分別用于檢測菌株產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶或產(chǎn)酸能力的大小. 4) 生長圈法 利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌,若待分離的菌在缺乏上述營養(yǎng)物的條件下,能合成該營養(yǎng)物,或能分泌酶將該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物,那么,在這些菌的周圍就會有工具菌生長,形成環(huán)繞菌落生長的生長圈. 該法常用來選育氨基酸、核苷酸和維生素的生產(chǎn)菌.工具菌往往都是對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株. 5) 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長的物質(zhì),或能分泌某種酶并將無毒的物質(zhì)水解成對工具菌有毒的物質(zhì)