1、土壤微生物的分離與鑒定組員：鞏鵬鵬、高艷雙、顧斐、曹凌雪、白相林、楊金玉實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2006年12月11號2007年1月15號關(guān)鍵詞：土壤微生物，分離鑒定，生理生化，實(shí)驗(yàn)摘要：土壤是微生物的良好生境，土壤中有多種類群的微生物，它們對自然界物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和循環(huán)起著極為重要的作用，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)有著不可忽視的影響。根際微生物與植物的關(guān)系特別密切，不同的土壤和植物對根際微生物產(chǎn)生顯著影響，而不同的根際微生物由于其生理活性和代謝產(chǎn)物的不同，也將對土壤肥力和植物營養(yǎng)產(chǎn)生積極或消極的作用。土壤微生物不僅對土壤的肥力和土壤營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化起著重要作用，而且對于進(jìn)入土壤中的農(nóng)藥及其他有機(jī)污染物的自凈、有毒金屬及

2、其化合物在土壤環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化等都起著極為重要的作用。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10 cm30 cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌數(shù)減少。土壤中微生物以細(xì)菌數(shù)量最多，為幾百萬個(gè)/克土至幾億個(gè)/克土，有各種生理類群，營養(yǎng)類型多屬異養(yǎng)型，鑒別染色多為革蘭氏陽性。放線菌含量為幾萬個(gè)/克土至幾百萬個(gè)/克土，但其生物量不比細(xì)菌低，因?yàn)榫z體積較大。土壤中真菌含量為幾千個(gè)/克土至幾十萬個(gè)/克土，而其生物量常比細(xì)菌的大。酸性土壤中真菌較多。藻類在土壤中的含量不及微生物總數(shù)的1，生長在潮濕土壤的表

3、層。原生動物在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中較多。通過土壤微生物的分離與計(jì)數(shù)及劃線純化，涂布分離長出的單菌落，須經(jīng)劃線純化，再轉(zhuǎn)斜面培養(yǎng)后保藏備用。涂布分離細(xì)菌的平板，溫箱培養(yǎng)2d3d后，于室溫下放置3d或2d，使菌落性狀表現(xiàn)較充分，然后挑取各單菌落的部分培養(yǎng)物，在預(yù)先制備好的平板上劃線純化。達(dá)到分離純化認(rèn)識土壤中微生物的目的，并掌握各種相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：(一) 對土壤中微生物的分離篩選及鑒定 從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程成為微生物的分離與純化，常用的方法有簡易的細(xì)胞挑取法和平板分離法。其中平板分離法操作簡單，普遍用于微生物的分離與純化，奇跡般原理包括兩個(gè)方面： （1

4、） 遜則適合于待分離微生物的生長條件如營養(yǎng)，酸堿度，溫度或氧等要求或加入某種抑制劑造成只有利于該種微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。（2） 微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成單個(gè)的菌落可以是由一個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成的集合體。因而可以通過挑取單個(gè)菌落而獲得一種純培養(yǎng)，或去掉那個(gè)菌落的方法可由稀釋涂布和平板劃線等技術(shù)完成。土壤是微生物生活的大本營，它所含有的微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多有價(jià)值的微生物菌株。<二> 菌株的鑒定的生理生化實(shí)驗(yàn) 糖發(fā)酵與氧化試驗(yàn)在細(xì)菌的分類鑒

5、定中，糖類發(fā)酵與氧化測定是一項(xiàng)重要依據(jù)。特別是對細(xì)菌的鑒定尤為重要。常用的發(fā)酵與氧化的糖類包括單糖，雙糖，多糖三類：如葡萄糖，蔗糖，淀粉等。醇類包括五元醇，六元醇;如到金盞花醇，甘露醇等；糖苷類主要包括有水楊苷等。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為能源和碳源，但由于不同的菌類存在酶類差異，已而對糖類發(fā)酵與氧化的能力就有所不同。有的能利用這種而不能利用那種，有的正好相反；有的在糖類發(fā)酵與氧化代謝中能分解糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的則只能產(chǎn)酸不能產(chǎn)氣。酸產(chǎn)生與否，以及時(shí)發(fā)酵類型產(chǎn)酸還是氧化類型產(chǎn)酸，可以由預(yù)先加在培養(yǎng)基中的指示劑（溴百里酚藍(lán)水溶液）呈現(xiàn)出來。這樣把接好菌種的培養(yǎng)基放在厭氧或好樣的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)

6、基由綠色變?yōu)辄S色為產(chǎn)酸，是否產(chǎn)氣是通過觀察培養(yǎng)基中是否產(chǎn)生氣泡或培養(yǎng)基斷裂來測定，如產(chǎn)生斷裂或有氣泡證明由氣體存在。過氧化氫酶測定乳酸菌和許多厭氧菌與其他細(xì)菌區(qū)分的主要依據(jù)是測定有無過氧化氫酶。過氧化氫酶又稱接觸酶，它能把過氧化氫分解為水和氧氣，氧分子變做氣泡跑出來，則為過氧化氫酶陽性。乳酸菌和許多厭氧菌在過氧化氫試驗(yàn)中呈陰性。細(xì)胞色素氧化酶測定細(xì)胞色素氧化酶是氧化酶中的一種，有時(shí)人們習(xí)慣的把細(xì)胞色素氧化酶稱為氧化酶，所以在細(xì)菌分類鑒定中所說的氧化酶就是指細(xì)胞色素氧化酶。細(xì)胞色素氧化酶在右分子氧和細(xì)胞色素C存在時(shí)，可氧化二甲基對本撐二胺(氨基二甲基苯胺)，使之呈現(xiàn)玫瑰紅到暗紅色，在此基礎(chǔ)上，還

7、能和a-苯酚結(jié)合生成吲哚酚藍(lán)，而出現(xiàn)藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和寥朗俏⑸锷畹拇蟊緺I，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多；其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥、偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線菌數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離并純化細(xì)菌。1、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，分離目的菌，并通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)做出初步鑒定。學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。掌握倒平板的技術(shù)和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)。2、學(xué)習(xí)并掌握過氧化氫酶測定、細(xì)胞色素氧化酶測定和糖發(fā)酵與氧化試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理及其操作方法。3、

8、復(fù)習(xí)顯微鏡底倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，復(fù)習(xí)油浸系物鏡的基本原理，復(fù)習(xí)其使用方法。4、明確培養(yǎng)基的配制原理。復(fù)習(xí)配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。復(fù)習(xí)消毒和滅菌的原理，復(fù)習(xí)各種滅菌方法的操作步驟。5、復(fù)習(xí)、掌握細(xì)菌稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。復(fù)習(xí)并掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間。復(fù)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)法。6、復(fù)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的簡單染色法。復(fù)習(xí)鞭毛染色、革蘭氏染色的基本原理和操作方法。實(shí)驗(yàn)過程：實(shí)驗(yàn)器材：1、 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2、 試劑：革蘭氏染色液、5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅、甘油、滅菌水3、 儀器或其他：三角瓶、試管、接種環(huán)、接種針、載玻片

9、、酒精燈、涂布棒、移液槍、顯微鏡、平皿、木夾子等。4、 樣品：生命科學(xué)院試驗(yàn)田中土壤實(shí)驗(yàn)步驟：一、 分離與純化1. 準(zhǔn)備將內(nèi)裝90ml的蒸餾水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培養(yǎng)基、涂布棒、試管（內(nèi)裝9ml蒸餾水）若干、平皿若干放入高壓鍋高溫滅菌。2. 稀釋將土壤樣品10g加入90ml滅菌水中振蕩20分鐘，形成土壤懸濁液，取1ml加入裝有9ml滅菌水試管中振蕩形成10-2稀釋，依次將土壤樣品稀釋10-3、10-4、10-5、10-6、10-73. 涂布平板將10-5、10-6、10-7的稀釋樣品分別涂布到已制好的固體培養(yǎng)基平板上，每種涂3個(gè)平板。4. 培養(yǎng)將平板置于37。C恒溫培養(yǎng)三天。5. 分

10、離從平板中挑取單個(gè)菌落進(jìn)行平板劃線分離培養(yǎng)，培養(yǎng)2天，共選了4種菌。6. 純化將劃線長出的菌接種于已準(zhǔn)備好的固體斜面培養(yǎng)基中。培養(yǎng)2天。7. 鏡檢對平板中的4種菌分別進(jìn)行美藍(lán)染色、革蘭氏染色、芽孢染色，放在顯微鏡下觀察，并記錄結(jié)果。8. 保種將長出菌的斜面放入冰箱中保存。二、 生理生化實(shí)驗(yàn)（一） 糖類發(fā)酵與氧化實(shí)驗(yàn)一、 器具或材料試管、接種針、恒溫箱等糖類發(fā)酵與氧化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基（半固體）二、 操作步驟1、 接種：以移接1824小時(shí)待鑒定的菌用接種針穿刺接種。接4支，其中2支用滅菌的凡士林或石蠟洋菜上封蓋，以隔絕空氣為閉管，另2支不封為開管，同時(shí)要有不接種的閉管作對照。2、 培養(yǎng)：置于37度恒溫箱

11、中，培養(yǎng)816個(gè)小時(shí)，1天、3天和7天3、 觀察：在上述培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)觀察試管中指示劑的變化情況三、 結(jié)果在8小時(shí)、16小時(shí)檢查，若培養(yǎng)基柱上部變黃，下部仍為綠色，則證明為氧化型，全部變黃或下部變黃上部為綠，則為發(fā)酵型。（二） 過氧化酶測定一、 器具與材料試管、培養(yǎng)皿、小滴管、接種環(huán)、恒溫箱等，3%過氧化氫溶液二、 操作步驟1、 接種：將鑒定菌接種于適宜的斜面或固體平板上2、 培養(yǎng)：適溫培養(yǎng)1824小時(shí)3、 測定：取3%過氧化氫0.5毫升，滴加到不含血紅素或紅血球的瓊脂培養(yǎng)物上，也可取一環(huán)培養(yǎng)1824小時(shí)的菌苔涂在干凈的載玻片上，然后滴一滴3%的過氧化氫。三、 結(jié)果培養(yǎng)物出現(xiàn)氣泡為陽性反應(yīng)，無氣泡

12、為陰性反應(yīng)（三） 細(xì)胞色素氧化酶測定一、 器具與材料新華一號濾紙、培養(yǎng)皿、白金絲（或火柴棒）等。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，1%鹽酸二甲基對苯撐二胺（或鹽酸對氨基二甲基苯胺）溶液，1%萘酚乙醇溶液二、 操作步驟、方法一1、 在干凈培養(yǎng)皿里放一張濾紙（或?yàn)V紙條）2、 用白金絲或火柴棒（切勿用含鐵物質(zhì)，因遇鐵后出現(xiàn)假陽性）取培養(yǎng)1824小時(shí)的鑒定菌苔粘在濾紙上。3、 在濾紙上菌苔處，加上一滴1%鹽酸二甲基對苯撐二胺（或鹽酸對氨基二甲基苯胺）溶液，進(jìn)行觀察。、方法二1、 用1%鹽酸二甲基對苯撐二胺（或鹽酸對氨基二甲基苯胺）溶液濕潤濾紙2、 再滴加約等量的1%萘酚乙醇溶液3、 用白金絲接種環(huán)或火柴棒榨取約鑒定

13、菌菌苔涂抹在上述濾紙上，進(jìn)行觀察。三、 結(jié)果方法一：在10秒鐘內(nèi)涂抹的菌苔呈現(xiàn)紅色者為陽性；1060秒鐘呈現(xiàn)紅色者延遲反應(yīng)，也為陽性；60秒鐘以上呈現(xiàn)紅色者都不計(jì)，按陰性處理。方法二：出現(xiàn)蘭色者為陽性，出現(xiàn)變色的時(shí)間要求同上四、 查伯杰氏手冊根據(jù)菌落形態(tài)、染色性質(zhì)及生理生化性質(zhì)查分離出的菌為哪幾種菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：1、 菌落特征 項(xiàng)目菌號顏色透明度形態(tài)濕潤度邊緣隆起程度1土黃色不透明圓形濕潤整齊扁平2土黃色不透明圓形濕潤整齊扁平3土黃色不透明圓形濕潤整齊扁平4灰白色半透明不規(guī)則濕潤不整齊隆起2、 鏡檢結(jié)果 項(xiàng)目菌號形狀狀態(tài)革蘭氏染色芽孢1桿狀鏈生G-端生2桿狀散亂G-無3球妝成片G+無4桿狀鏈

14、生G+端生3、 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1） 糖類發(fā)酵與氧化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目菌號封管不封管產(chǎn)氣培養(yǎng)基柱上部培養(yǎng)基柱下部培養(yǎng)基柱上部培養(yǎng)基柱下部1黃色黃色綠色綠色無2綠色黃色綠色綠色無3綠色黃色黃色綠色無4綠色黃色黃色黃色無空白綠色綠色無無根據(jù)封管判斷：1、2、3、4號菌均為發(fā)酵型，且均不產(chǎn)氣。（2） 過氧化氫酶測定 菌號結(jié)果1234結(jié)論：1、3、4號菌有過氧化氫酶，2號菌無過氧化氫酶（3） 細(xì)胞色素氧化酶測定 菌號結(jié)果1234結(jié)論：1、2號菌含氧化酶，3、4號菌不含氧化酶4、 查伯杰氏手冊結(jié)果：1號菌：細(xì)胞桿狀，鏈生，革蘭氏反應(yīng)陰性，有芽孢，端生，代謝為發(fā)酵型，過氧化氫酶測定為陽性，氧化酶測定為陽性。查伯杰

15、氏手冊估計(jì)為桿菌科芽孢桿菌屬。2號菌：細(xì)胞桿狀，革蘭氏反應(yīng)陰性，菌散亂不成片生長，代謝為發(fā)酵型，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，過氧化氫酶測定為陰性，氧化酶測定為陽性。查伯杰氏手冊為弧菌科弧菌屬。3號菌：細(xì)胞球狀，革蘭氏反應(yīng)陽性，菌片生生長，過氧化氫酶測定為陽性，氧化酶測定為陰性，代謝為發(fā)酵型。查伯杰氏手冊為微球菌科葡萄球菌屬。4號菌：細(xì)胞桿狀，形成芽孢，不多于一個(gè)。革蘭氏反應(yīng)陽性，代謝為發(fā)酵代謝，產(chǎn)生過氧化氫酶。查伯杰氏手冊為芽孢桿菌科芽孢桿菌屬。實(shí)驗(yàn)心得：1、 配方中使用的糖類不同，配置出的百里酚培養(yǎng)基的顏色不同。本實(shí)驗(yàn)使用了乳糖，培養(yǎng)基呈透明的墨綠色。通過與其他小組的交流，使用蔗糖配置出的蘭色培養(yǎng)基觀察效果較好。2、 在細(xì)胞色素氧化酶測定實(shí)驗(yàn)中，用于培