1、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)三、 氨基移換反應(yīng)氨基移換反應(yīng)血液中轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定血液中轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定 指在轉(zhuǎn)氨酶催化下指在轉(zhuǎn)氨酶催化下將將 - -氨基酸的氨基轉(zhuǎn)給氨基酸的氨基轉(zhuǎn)給另一個(gè)另一個(gè) - -酮酸，生成相酮酸，生成相應(yīng)的應(yīng)的 - -酮酸和一種新的酮酸和一種新的 - -氨基酸的過(guò)程氨基酸的過(guò)程, ,也稱氨也稱氨基移換作用?；茡Q作用。 轉(zhuǎn)氨作用轉(zhuǎn)氨作用一實(shí)驗(yàn)原理一實(shí)驗(yàn)原理血清中的谷血清中的谷- -丙轉(zhuǎn)氨酶，在丙轉(zhuǎn)氨酶，在3737、pH7.4pH7.4的條件下，可的條件下，可催化丙氨酸與催化丙氨酸與- -酮戊二酸反應(yīng)生成谷氨酸和丙酮酸酮戊二酸反應(yīng)生成谷氨酸和丙酮酸 丙酮酸可與丙酮酸可與2,42,4二硝基苯

2、肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成丙酮酸二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成丙酮酸- -2,4-2,4-二硝基苯腙，該產(chǎn)物在堿性環(huán)境中可轉(zhuǎn)化成紅棕色二硝基苯腙，該產(chǎn)物在堿性環(huán)境中可轉(zhuǎn)化成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺與丙酮酸的生成量，的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺與丙酮酸的生成量，亦即與谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的高低成正比。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可亦即與谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的高低成正比。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以查出丙酮酸的生成量。以查出丙酮酸的生成量。* * 儀器儀器1. 51. 515cm15cm試管、刻度吸量管。試管、刻度吸量管。2. 2. 恒溫水浴、離心機(jī)、恒溫水浴、離心機(jī)、721721型分光光度計(jì)。型分光光度計(jì)。* * 試劑試劑1.0

3、.1mol/L pH7.41.0.1mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液0.1mol/L0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液磷酸氫二鈉溶液0.1mol/L0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液磷酸二氫鉀溶液 0.1mol/L pH7.4 0.1mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。的磷酸鹽緩沖液。 （兩者以（兩者以4 4：1 1體積比混合）體積比混合）三、儀器與試劑三、儀器與試劑 2. 2. 標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（含丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL2.0mol/mL） 3. 3.谷谷- -丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液( (含含- -酮戊二酸酮戊二酸2 mol/ml2 mol/ml及及DL-D

4、L-丙氨酸丙氨酸200 mol/ml) 200 mol/ml) 4. 2.44. 2.4二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 (0.02%,1mol/L HCl(0.02%,1mol/L HCl溶液溶液) )5. 0.4mol/L NaOH5. 0.4mol/L NaOH溶液溶液 。四、實(shí)驗(yàn)操作四、實(shí)驗(yàn)操作 1 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：1 1）、?。⑷? 6支試管，分別標(biāo)上支試管，分別標(biāo)上0 0，1 1，2 2，3 3，4 4，5 5編號(hào)。編號(hào)。先將試管置于先將試管置于3737恒溫水浴中保溫恒溫水浴中保溫5 5分鐘以平衡內(nèi)外分鐘以平衡內(nèi)外溫度。然后按下表所列的次序添加各試劑。溫度。然后按下表

5、所列的次序添加各試劑。 2 2）、向各管內(nèi)加入）、向各管內(nèi)加入0.50.5毫升毫升2,4-2,4-二硝基苯肼溶液，二硝基苯肼溶液，3737保溫保溫1515分鐘，接著分別向各管內(nèi)加入分鐘，接著分別向各管內(nèi)加入0.4M0.4M氫氫氧化鈉溶液氧化鈉溶液5 5毫升。再毫升。再3737保溫保溫1515分鐘，以分鐘，以0 0號(hào)管號(hào)管作空白對(duì)照，測(cè)定作空白對(duì)照，測(cè)定520 nm520 nm的光吸收值。用丙酮酸的光吸收值。用丙酮酸的微摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，畫出的微摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、血清樣品谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定、血清樣品谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定1 1）、?。?/p>

6、、取3 3支試管，分別標(biāo)上空白、樣品支試管，分別標(biāo)上空白、樣品1 1、樣品、樣品2 2。向各。向各管內(nèi)加入管內(nèi)加入0.5 mL0.5 mL谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物、谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物、0.1 mL0.1 mL磷酸緩沖溶液磷酸緩沖溶液并搖勻，并搖勻，3737水浴保溫水浴保溫5 5分鐘。分鐘。2 2）、向樣品管中分別加入）、向樣品管中分別加入0.1 mL0.1 mL血清，血清，3737保溫保溫3030分鐘。分鐘。3 3）、向空白與樣品管中分別加入）、向空白與樣品管中分別加入0.5 mL 20.5 mL 2，4 4二硝基二硝基苯肼，搖勻，水浴保溫苯肼，搖勻，水浴保溫1515分鐘。分鐘。4 4）、向空白管中加入）、

7、向空白管中加入0.1 mL0.1 mL血清，搖勻。血清，搖勻。5 5）、向所以）、向所以3 3支試管中都加入支試管中都加入5.0 mL 0.4 M NaOH5.0 mL 0.4 M NaOH溶液，溶液，搖勻并水浴保溫?fù)u勻并水浴保溫1515分鐘后在分鐘后在520 nm520 nm進(jìn)行比色測(cè)定。進(jìn)行比色測(cè)定。保溫保溫30分鐘分鐘五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、用測(cè)定吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出丙酮酸的生成量、用測(cè)定吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出丙酮酸的生成量2、計(jì)算：、計(jì)算： 丙酮酸物質(zhì)的量（丙酮酸物質(zhì)的量（mol） 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位/100mL= 1000 時(shí)間（時(shí)間（min）國(guó)際單位：在最

8、適溫度下，國(guó)際單位：在最適溫度下，1 1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1 1mol底物的底物的酶量稱為酶量稱為1個(gè)酶單位（個(gè)酶單位（U）。）。Katal單位：在一定條件下，單位：在一定條件下，1 1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol1mol底物所底物所需要的酶量。需要的酶量。 1 U16.67 nKat 1 Kat 6 107 U六、酶活力單位的定義六、酶活力單位的定義 1. 1. 在測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在在測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在3737水水浴中保溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時(shí)。浴中保溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時(shí)。2. 2.轉(zhuǎn)氨酶只能作用于轉(zhuǎn)氨酶只能作用于-L-L-氨基酸，對(duì)氨基酸，對(duì)D-D-氨基酸無(wú)作用。實(shí)驗(yàn)氨基酸無(wú)作用。實(shí)驗(yàn)室多用室多用-DL-DL-氨基酸。氨基酸。 3. 3. 進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，加入進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，加入2,4-2,4-二硝基苯肼溶液后要搖勻并保二硝基苯肼溶液后要搖勻并保溫溫1515分鐘。分鐘。4. 4. 血清樣品的測(cè)定需在顯色后血清樣品的測(cè)定需