1、第1章 植物組織培養(yǎng)簡介1.細(xì)胞工程（Cell Engineering）：在體外對生物的細(xì)胞進行生長與分化的調(diào)控、遺傳重組與改良，使其生產(chǎn)出人類所需要的產(chǎn)品。2.細(xì)胞全能性假說是開展植物組織培養(yǎng)研究的理論基礎(chǔ)；驗證細(xì)胞全能性假說是開展植物組織培養(yǎng)研究的動力。3.細(xì)胞分裂素與生長素的濃度比值決定著愈傷組織根或芽的形成。細(xì)胞分裂素/生長素的比值： 高：形成芽；低：形成根；相當(dāng)：愈傷組織增殖，但不分化。4.植物組織培養(yǎng)在植物性狀改良上的應(yīng)用:.胚培養(yǎng)可克服遠(yuǎn)源雜交不孕的困難；.花藥（花粉）培養(yǎng)可大大縮短育種年限；.原生質(zhì)體融合技術(shù)可克服有性雜交不親和，創(chuàng)造遠(yuǎn)源雜種、甚至新的物種；.單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可用

2、于突變體的篩選。第2章   植物組織培養(yǎng)的設(shè)施1.培養(yǎng)室所需要的設(shè)備： .培養(yǎng)架:培養(yǎng)架的設(shè)計既要考慮充分利用培養(yǎng)室的空間，也要考慮取放材料方便。 .加溫/降溫設(shè)備：空調(diào) .光照和控光設(shè)備。分為光培養(yǎng)室和暗培養(yǎng)室。光培養(yǎng)室常用日光燈照明，并安置控制光照時間的自動開關(guān)。2.瓶蓋、瓶塞、或者封口膜的透氣性能對材料的培養(yǎng)有顯著影響，透氣性能不好的，容器中濕度高（飽和），容易導(dǎo)致植物材料出現(xiàn)玻璃化（生理病態(tài)，植物材料呈水漬狀，深綠色，剛脆，無繼續(xù)培養(yǎng)的價值）第3章 植物組織培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基的重要性: 1)植物材料生長的營養(yǎng)來源； 2)調(diào)節(jié)植物材料生長與分化的主要途徑。2.培養(yǎng)基的組成：.水：

3、要求純凈。應(yīng)用蒸餾水、去離子水，而不用自來水。.無機營養(yǎng)成分： 植物生長發(fā)育需要有16種必需元素：大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S；微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn。不同培養(yǎng)基的無機鹽（特別是大量元素）的濃度差異很大。.有機營養(yǎng)： 有機營養(yǎng)（有機成分）：維生素和氨基酸的總稱。 常用：肌醇、煙酸、維生素B6、維生素B1和甘氨酸等。 其它維生素：維生素M（葉酸）、維生素B2（核黃素）、泛酸鈣等。 其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等.碳源：最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有時用葡萄糖(glucose)、果糖(fruc

4、tose)或其它的糖(lactose, maltose)，有時幾種糖混用。糖是營養(yǎng)物質(zhì)，但不是越多越好。培養(yǎng)基中糖的用量大多在1060g/L，一般為2030 g/L。.植物生長物質(zhì)：植物生長物質(zhì)是植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑的總稱。植物激素：植物合成的、微量就有顯著生理效應(yīng)的物質(zhì)。植物生長調(diào)節(jié)劑：人工合成的、具有植物激素相似作用的物質(zhì)。.凝固劑：在植物組織培養(yǎng)中，瓊脂（agar）是最常用的凝固劑，用量為6-12g/L。另外還有phytagel, Gelrite, 4g/L。 .有機附加物：水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量為0.1-10g/L，一般為0.5-3 g/L。椰子

5、汁：100-200ml/L。.其它物質(zhì)：防止與減緩植物材料褐化的物質(zhì)：1）抗氧化劑：抗壞血酸（Vc）、L-半光氨酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等。2）吸附劑：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。 活性炭吸附無選擇性；改善培養(yǎng)效果、促進生根。 PVP專一吸附酚類物質(zhì)。3.植物激素在植物組織培養(yǎng)中的作用：生長素：(1) 促進細(xì)胞分裂、增殖，導(dǎo)致愈傷組織的形成(2,4-D>NAA>IAA, IBA)；(2) 控制器官的分化，誘導(dǎo)根的形成。（IBA>NAA>IAA)細(xì)胞分裂素:促進細(xì)胞分裂、增殖，導(dǎo)致愈傷組織的形成；控制器官的分化，誘導(dǎo)芽的形成和增殖。 赤霉素:赤霉素最顯著的作用是促進細(xì)

6、胞的伸長，也有打破種子休眠的作用。在植物組織培養(yǎng)中使用赤霉素主要是促進芽或莖的伸長。赤霉素對熱不穩(wěn)定，故不宜用高溫法消毒。乙烯:乙烯促進果實成熟，加速植物衰老。植物組織培養(yǎng)極少使用乙烯（乙烯利），相反，而是盡量控制乙烯的產(chǎn)生。 脫落酸:脫落酸是促進植物衰老的激素，植物組織培養(yǎng)很少用。在胚狀體（embryoid）的誘導(dǎo)和培養(yǎng)中常常使用脫落酸，促進胚狀體的成熟。4.植物激素母液的配制:對于生長素類激素，也可用稀堿助溶；對于細(xì)胞分裂素類激素，可用稀酸助溶。激素母液也應(yīng)在低溫下保存。 5.高溫消毒時應(yīng)注意的問題：一定要先排氣10 min，否則不能消毒不徹底；高溫消毒后，培養(yǎng)基的pH值會下降0.20.5

7、個pH單位；高溫消毒過程中，培養(yǎng)基中有些物質(zhì)會被破壞或發(fā)生沉淀。如蔗糖會水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖變成葡萄糖酸等；有些物質(zhì)甚至幾乎完全被破壞，如赤霉素、玉米素等。物質(zhì)破壞程度與消毒時間和壓力有關(guān)。6.過濾滅菌法:由于過濾消毒不會破壞培養(yǎng)基的成分和改變培養(yǎng)基的pH值，所以在原生質(zhì)體培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)時常用過濾消毒法對培養(yǎng)基進行滅菌。如果培養(yǎng)基中要使用一些熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，如ZT、GA3、核黃素等，則這些物質(zhì)也要用過濾消毒法滅菌。第四章 外植體的表面消毒 外植體(Explant)用于建立無菌培養(yǎng)的起始植物材料。表面消毒(Surface sterilization)（用消毒劑）殺死外植體表面其它生物（主

8、要是細(xì)菌和真菌）的過程。1.外植體表面消毒的必要性：植物材料表面都帶有細(xì)菌和真菌，如消毒不徹底，細(xì)菌和真菌會在培養(yǎng)基中迅速生長，占據(jù)空間、消耗營養(yǎng)、分泌毒素，使植物材料死亡。因此，接種前對外植體進行有效的表面消毒是建立無菌培養(yǎng)的關(guān)鍵。2.表面消毒的要求：（1）最大限度地殺死細(xì)菌和真菌（2）對外植體的毒害要盡可能的小3.常用消毒劑：消毒劑 消毒濃度 消毒時間 效果 優(yōu)缺點 乙醇 70%-75% 10S-5 min，多1min內(nèi) 較差 易清洗，但對材料傷害大。 氯化汞 0.1% -0.2%5-30 min 很好 毒性大，難清洗，清洗不夠則對材料有殘毒效應(yīng)。 次氯酸鈉 1% 有效氯5-30 min

9、較好 易清洗，對材料的殘毒效應(yīng)小。 雙氧水 3% 10-60 min 一般 易清洗，對材料的殘毒效應(yīng)小。 4.外植體的表面消毒消毒步驟：用自來水將材料沖洗干凈。將材料上的水擦干，并剪成適當(dāng)大小（長短）的小塊（段）。在70%-75%的乙醇中10-60 S，然后迅速轉(zhuǎn)入到其它消毒劑（氯化汞、次氯酸鈉）中，消毒劑中可加入少量表面活性劑（Tween 20或80、家用洗滌劑等），以增加消毒效果。消毒結(jié)束后，將材料轉(zhuǎn)入無菌水中漂洗2-8次；將材料的傷口部分切去后，再將其切成適當(dāng)大小，及時接入到培養(yǎng)基中。5.材料內(nèi)部污染的控制。表面消毒不能殺死內(nèi)部的細(xì)菌，可嘗試下列方法：用分生組織作為外植體；在培養(yǎng)基中加抗

10、菌素（青霉素、卡那霉素、四環(huán)素等）；盡量將材料切小，并且每接一個外植體就將接種工具消毒一次，避免交叉感染。第5章   高等植物離體再生和無性繁殖有性繁殖（Sexual propagation）:通過兩性細(xì)胞結(jié)合形成的種子進行繁衍后代的方法叫有性繁殖。因為繁殖體是種子，所以又稱種子繁殖。無性繁殖（Asexual propagation）:通過植物體一部分（常是營養(yǎng)器官，如芽、根、莖、葉等）繁殖的方法，所以又稱營養(yǎng)繁殖（vegetative propagation）。植物的無性繁殖有分株、扦插、壓條和嫁接4種方法。植物離體再生(in vitro plantlet regener

11、ation)：在離體條件下，植物外植體（根、莖、葉、花等）形成完整植株。不定芽(adventitious bud): 從外植體不固定的位置形成的芽。體細(xì)胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis)：指誘導(dǎo)植物體細(xì)胞形成體細(xì)胞胚（胚狀體）的過程。1.無性繁殖的優(yōu)缺點： 優(yōu)點：所繁殖的植株與母株的性狀一致； 缺點：繁殖速度有限，特別是當(dāng)起始材料少時，不能快速推廣優(yōu)良植株；容易傳播病害。2.植物離體再生的途徑：頂芽與側(cè)芽再生途徑；不定芽再生途徑；胚狀體再生途徑；擬原球莖再生途徑。3.植物離體無性繁殖的過程： 繁殖體的誘導(dǎo)（芽、胚性愈傷組織、Plb）繁殖體的增殖；植株再生（芽的生

12、根、胚狀體形成與萌發(fā)、 Plb分化植株）小苗移栽: 將再生植株由組培室移栽到溫室、田間。4.頂芽與側(cè)芽再生途徑步驟： 選擇適當(dāng)?shù)闹l、莖段，消毒；莖段培養(yǎng)（nodal culture）或莖尖培養(yǎng)（shoot tip culture)；1-2芽/段促進頂芽和側(cè)芽生長，形成幼莖(shoot);幼莖生根、形成完整植株。（重復(fù)2和3，可以大量繁殖植物）5.頂芽和側(cè)芽再生途徑的特點：優(yōu)點：頂芽和側(cè)芽是植物生長發(fā)育過程中自然形成的，發(fā)生變異的比率很低。利用頂芽和側(cè)芽途徑繁殖植物時變異率最小，所繁殖出來的群體在性狀上能最大限度地與母株保持一致。缺點：速度可能比較低，不能滿足要求。6.頂芽和側(cè)芽再生

13、途徑可能存在的問題：不是所有的植物都可以進行莖段培養(yǎng)。只有莖能伸長的植物（菊花、馬鈴薯、葡萄、木本植物等）才可用法，節(jié)間短、蓮座狀的植物（如鳳梨、非洲菊、白菜等）則不能用。繁殖效率比較低。（繁殖速率：側(cè)芽生長率、生長速度和長度(節(jié)數(shù))）側(cè)芽萌動率高，但伸長不好，影響增殖效率和生根。7.不定芽再生途徑過程：外植體的選擇與消毒；不定芽的誘導(dǎo)（外植體既可以直接形成不定芽，也可以先形成愈傷組織，再由愈傷組織形成形成不定芽）；芽的增殖(莖段培養(yǎng)或不定芽)；不定芽的生根。8.影響不定芽形成的因素：植物種類和品種（基因）差異：植物外植體形成不定芽的能力：草本植物大于木本植物；雙子葉植物大于單子葉植物。即使同

14、一種植物，品種之間往往也有很大的差異。外植體的類型：同一株植物以不同的器官（根、莖、葉、花、果實、胚）作為外植體，其形成不定芽的能力往往會有差異。外植體的生理狀態(tài)：幼年期的外植體形成不定芽的能力大于成熟期的外植體，特別是木本植物。一株植物不同部位的成熟度與其到根部的距離呈正相關(guān)。9.不定芽途徑的優(yōu)點和缺點優(yōu)點：（1）取材料方便，可以不毀壞母株；（2）芽的增殖速度快，繁殖效率高。（3）是培育轉(zhuǎn)基因植物的重要途徑。缺點：植株變異的幾率較大。10.無根苗生根兩種類型：皮部生根型和愈傷組織生根型。皮部生根型：根直接從無根苗基部莖的皮層處長出。愈傷組織生根型：無根苗基部先形成愈傷組織，再在愈傷組織上形成

15、根。11.影響無根苗生根的因素：植物的類型和品種：草本比木本易；幼年期外植體形成的無根苗比成年期形成的無根苗容易；基本培養(yǎng)基成分：不同培養(yǎng)基的無機鹽濃度差異較大，對生根的影響也比較大。一般較低的無機鹽有利于生根；生長素：有些植物可以在無激素的培養(yǎng)基上生根，但大部分則要求使用一定濃度的生長素。在誘導(dǎo)生根方面，IBANAAIAA。12.胚狀體途徑植株再生的過程：選擇合適的材料、誘導(dǎo)胚性愈傷組織（能夠產(chǎn)生胚狀體的愈傷組織）促進胚性愈傷組織形成正常的胚狀體（球型胚、心型胚、魚雷型胚、子葉胚、成熟胚）促進胚狀體萌發(fā)成苗13.影響胚狀體誘導(dǎo)的因素：植物種類：不同種類植物形成胚狀體的能力差異很大。外植體種類

16、外植體生理狀態(tài)：幼年期外植體高于成年期外植體，尤其是用合子胚及種子萌發(fā)的幼苗為外植體，容易誘導(dǎo)成功。植物激素： 少數(shù)植物可以在無激素的培養(yǎng)基上形成胚狀體，如人參；大多數(shù)植物則需要在生長素、或細(xì)胞分裂素、或生長素和細(xì)胞分裂素共同作用的誘導(dǎo)下才能形成胚狀體，但激素種類、組合、濃度因植物種類而異。培養(yǎng)基成分： 糖、NH4+、Ca2+濃度，氨基酸（特別是脯氨酸）、水解酪蛋白等物質(zhì)有利于胚狀體的誘導(dǎo)；麥芽糖有利于胚的成熟。14.原球莖（根狀莖）途徑是蘭花快速繁殖的最快途徑，其中原球莖（根狀莖）誘導(dǎo)的是蘭花快速繁殖的關(guān)鍵。原球莖（根狀莖）的誘導(dǎo)難易因蘭花的種類和外植體類型而異。以頂芽和側(cè)芽為外植體容易成功

17、，以葉片、根則較難。 15.組培苗的移栽：煉苗：在培養(yǎng)室內(nèi)將瓶塞打開（一半或完全）2-3天，讓組培苗逐漸適應(yīng)培養(yǎng)容器外面的環(huán)境，增加角質(zhì)層和蠟質(zhì)層厚度，增強抵抗室外環(huán)境（特別是濕度）變化的能力。洗苗：煉苗結(jié)束后，在清水中將附著在根上的瓊脂洗凈，否則移栽后根系容易生霉，造成爛根、死苗。移栽：組培苗要移栽入溫室或溫棚中。基質(zhì)要求疏松、透水、透氣性能好（如蛭石、珍珠巖、泥炭土等配成的基質(zhì)），最好要消毒。保持較高的濕度；遮蔭、降低光照；保持溫度相對平穩(wěn)。16.用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)無毒苗的步驟：感病植株的病毒鑒定；感病植株的熱處理；分生組織的分離；病毒的檢測：血清免疫、電鏡觀察、接種鑒定等；移栽后的隔

18、離，保證原種無病毒。17.植物離體繁殖技術(shù)的應(yīng)用：快速繁殖優(yōu)良品種；無病毒優(yōu)良種苗生產(chǎn)；挽救和繁殖瀕危植物；離體保存植物資源（離體種質(zhì)庫）；培育轉(zhuǎn)基因植物。第6章 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)(Plant Cell Culture)：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)彼此分離的細(xì)胞、使之生長、增殖或分化。固體培養(yǎng)(solid culture)：在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞,也稱靜止培養(yǎng)。液體培養(yǎng)（liquid culture）：在運動的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。又稱懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspension cell culture）。繼代培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)；subculture）：將培養(yǎng)物（芽、愈傷組織、細(xì)胞等）分成若干份，接種到新鮮培

19、養(yǎng)基上繼續(xù)增殖的過程。愈傷組織(callus)：一群無明顯組織分化、有分裂能力的細(xì)胞群（團）。分化(differentiation)：形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能相同的細(xì)胞變成形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能互不同的細(xì)胞的過程。脫分化(去分化；dedifferentiation)：已分化、成熟的細(xì)胞失去原有的狀態(tài)、重新恢復(fù)分裂能力的過程。再分化 (redifferentiation)：愈傷組織形成其它組織或器官的過程。最低起始細(xì)胞密度（minimum initial cell density）：細(xì)胞能夠生長、分裂的最低接種密度。 看護培養(yǎng)（nurse culture）：將親本愈傷組織或高密度的懸浮細(xì)胞同低密度細(xì)胞一起培養(yǎng)

20、，以促進低密度細(xì)胞生長、分裂的培養(yǎng)方法。 微室培養(yǎng)(Culture in microchamber)：利用玻璃或塑料制作的小室進行細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)。植板率（plate efficiency）：每個平板中新形成的細(xì)胞團數(shù)與每個平板中接種的細(xì)胞數(shù)百分比。前體物質(zhì)（precursor）：指某一代謝中間體的前一階段的物質(zhì)。誘導(dǎo)子（elicitor）：指能刺激細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。條件培養(yǎng)液（conditioned medium）:已經(jīng)培養(yǎng)過某種細(xì)胞的培養(yǎng)液（內(nèi)含該細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，包括少量生長因子）與一定比例新鮮培養(yǎng)液混合的培養(yǎng)液。毛狀根（hariy root, 發(fā)根）：植物的器官、組織或細(xì)胞在

21、發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)下產(chǎn)生的細(xì)小、多分枝的不定根。生物轉(zhuǎn)化(Biotransformation)：利用酶或生物細(xì)胞（微生物、植物、動物）對外源化合物進行結(jié)構(gòu)修飾。1.細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：（1） 進行細(xì)胞生物學(xué)研究；（2） 培育植物變異體： 有變異，才會有選擇;（3） 生產(chǎn)有用化合物。2.影響植板率的因素:(1)植物種類：生長快、容易培養(yǎng)的植物（如大多數(shù)草本植物），其植板率高；相反，則低。(2) 細(xì)胞的生理狀況：用快速生長期的細(xì)胞接種，則植板率高。(3)接種細(xì)胞密度：接種密度高，有利于細(xì)胞分裂，提高植板率，如煙草細(xì)胞。(4) 培養(yǎng)基成分：用營養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基或條件化培養(yǎng)基，植板率高。(5) 培養(yǎng)方式：采

22、用看護培養(yǎng)（nurse culture）是可以提高植板率。3.植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)研究的過程:(1).選擇外植體、誘導(dǎo)愈傷組織；(2). 通過含量分析、選擇高產(chǎn)細(xì)胞系；(3). 研究培養(yǎng)條件(達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)）；(4). 建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、優(yōu)化培養(yǎng)條件(達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)）；(5). 小試；優(yōu)化培養(yǎng)條件(6). 中試;優(yōu)化培養(yǎng)條件(7). 大規(guī)模培養(yǎng)(8). 工業(yè)化生產(chǎn)；產(chǎn)品分離、純化。4.提高次生代謝產(chǎn)物的方法：(1)選擇高產(chǎn)細(xì)胞系；(2)優(yōu)化培養(yǎng)基 （次生代謝物的產(chǎn)量=細(xì)胞生長量×細(xì)胞合成代謝物的能力）;(3)飼喂前體物質(zhì)（precursor）;(4)使用誘導(dǎo)子（elic

23、itor）;(5)改善培養(yǎng)條件;(6)改進培養(yǎng)方法;(7)固定化細(xì)胞培養(yǎng)。5.如何選擇高產(chǎn)細(xì)胞系：（1） 不同植物、不同單株、不同外植體（2）對細(xì)胞系進行系統(tǒng)選擇： 細(xì)胞系在培養(yǎng)工程中，細(xì)胞系會出現(xiàn)變異，通過持續(xù)選擇，有可能不斷提高細(xì)胞系的生產(chǎn)能力。（3）細(xì)胞誘變選擇細(xì)胞系（4）細(xì)胞系遺傳改良：利用基因工程技術(shù)超量表達(dá)限速酶基因、阻斷或者改變基因表達(dá)，提高細(xì)胞系合成次生代謝產(chǎn)物能力。6.毛狀根的誘導(dǎo)過程：外植體選擇和表面消毒；根農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)；感染（5-30min)；共培養(yǎng)（在無激素、有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-5天）；毛狀根形成（在無激素、有抗生素培養(yǎng)基）7.生物轉(zhuǎn)化用途：增加該化合物

24、的生物活性；生產(chǎn)化學(xué)合成的中間體。生物轉(zhuǎn)化過程中所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)主要有氧化、還原、羥基化、甲基化、去甲基化、糖基化、酰基化、異構(gòu)化等。2、 有一株稀有菊花，莖上長有10片葉。現(xiàn)要用離體培養(yǎng)技術(shù)將其在1年（12個月）內(nèi)繁殖出100萬株生根的組培苗，請寫出主要技術(shù)要點。 第二部：轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基（生長素，細(xì)胞分裂素大致濃度相同，比如MS+BA 1mg/L+NAA 1mg/l ）第三步：將上述愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基（MS+BA2mg/l+NAA0.1mg/l)第四步：轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2MS+BA0.1mg/l+NAA1mg/l)要想獲得大量組培苗重復(fù)第二步或第三步（完）第7章 植物原生質(zhì)體培

25、養(yǎng)與體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交（somatic hybridization）:不同植物原生質(zhì)體(protoplast)（體細(xì)胞）之間發(fā)生融合。1.原生質(zhì)體培養(yǎng)的用途:(1) 原生質(zhì)體是研究細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁的形成、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、大分子物質(zhì)進出細(xì)胞過程與機理等問題的良好實驗體系;(2) 原生質(zhì)體是轉(zhuǎn)基因的良好受體;(3) 原生質(zhì)體可以誘導(dǎo)融合。2.分離原生質(zhì)體的步驟：(1) 植物材料的選擇:選擇分裂能力強，甚至再生能力強的植物材料；(2) 酶解處理:酶解液中一般含有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等三種酶，濃度為0.5-2.0%。為了保持原生質(zhì)體的完整及其活力，必須使原生質(zhì)體處于一個等滲環(huán)境中。將植物材料放

26、入酶解液中、釋放出原生質(zhì)體。(材料與酶解液的比例：2-10g/100ml酶解液)(3) 過濾：酶解結(jié)束后，將酶解物通過孔徑為20-80µm的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去未被酶解的組織塊和細(xì)胞團。(4) 離心：濾液轉(zhuǎn)到離心管中在50×g下離心5min。(5) 洗滌：離心結(jié)束后，棄去上清液，用培養(yǎng)基或者原生質(zhì)體洗液重新懸浮沉淀的原生質(zhì)體，再離心，倒出上清液。如此反復(fù)2-4次，就可以將殘留的酶液去掉。(6) 純化：用含高濃度（21%）蔗糖的培養(yǎng)基進行離心、純化，完整的原生質(zhì)體漂浮在上清液的上部。(7) 收集原生質(zhì)體。3.影響原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的因素：（1）植物材料：用于分離原生質(zhì)體的植物材

27、料對原生質(zhì)體后來培養(yǎng)的效果影響極大。不同的植物、同一植物不同的品種，其遺傳組成存在差異，原生質(zhì)體的培養(yǎng)效果也就必然有差異。一般來說，容易培養(yǎng)的植物、外植體，其原生質(zhì)體也容易培養(yǎng)，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。 （2）培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基：不同植物原生質(zhì)體要求有不同的基本培養(yǎng)基。原生質(zhì)體培養(yǎng)基中的大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的大量元素濃度低。另外較高Ca2+濃度的對原生質(zhì)體分裂有利。有機成分：同培養(yǎng)細(xì)胞、愈傷組織相比，培養(yǎng)原生質(zhì)體時要求培養(yǎng)基有更豐富的有機成分。大量的結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺有利于原生質(zhì)體的分裂。激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長素。條件

28、化培養(yǎng)基：使用條件化培養(yǎng)基可以大大促進原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團的形成。養(yǎng)基中的滲透壓：原生質(zhì)體無細(xì)胞壁，所以培養(yǎng)基中必須使用滲透壓調(diào)節(jié)劑（甘露醇、山梨醇等），以維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。4.原生質(zhì)體融合有哪些方法?(1)化學(xué)誘導(dǎo)法:化學(xué)誘導(dǎo)法是利用一些化學(xué)物質(zhì),最常用的是聚乙二醇法和高鈣高pH法。通過消除原生質(zhì)體表面的電荷，促進原生質(zhì)體彼此靠近、接觸，并能促進接觸處的細(xì)胞膜發(fā)生融解，從而實現(xiàn)原生質(zhì)體融合的。(2)物理方法:在電融合儀上進行的。通過高頻（500K Hz-2MHz）電場脈沖處理原生質(zhì)體，可以使接觸處的原生質(zhì)體發(fā)生膜穿孔，最終導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。5.植物體細(xì)胞雜交存在的問題:(1)再生困難：不

29、同原生質(zhì)體容易融合，但體細(xì)胞雜種難分 裂、分化和再生，更難得到同時表現(xiàn)2個植物性狀的個體。(2)遺傳物質(zhì)丟失：不同原生質(zhì)體之間存在嚴(yán)重排斥(3)植株穩(wěn)定性差。第8章 動物細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長：細(xì)胞需要緊貼培養(yǎng)容器內(nèi)壁才能生長的現(xiàn)象=貼壁現(xiàn)象。貼附型細(xì)胞：依賴貼附才能生長的細(xì)胞。接觸抑制：當(dāng)貼附培養(yǎng)容器內(nèi)壁生長的細(xì)胞增殖到彼此緊密接觸時，細(xì)胞停止分裂、增殖。懸浮型細(xì)胞：在培養(yǎng)過程中不貼附于培養(yǎng)容器表面、成游離狀的細(xì)胞。細(xì)胞系(cell line)：原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后所形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株(Cell Strain)：從一個細(xì)胞系中由單細(xì)胞培養(yǎng)或通過篩選的方法由單細(xì)胞增殖形成的、具有穩(wěn)定特殊性

30、質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。 干細(xì)胞(Stem Cell)：一種未充分分化、尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織、器官和個體的潛在功能。1.動物細(xì)胞培養(yǎng)合成培養(yǎng)基：含合成培養(yǎng)基、血清和抗生素。（1） 合成培養(yǎng)基：主要成分是氨基酸(13種以上) 、維生素、碳水化合物、無機鹽和其他成分（如生長因子、激素、貼壁因子等）（2） 血清：非常重要，尤其是在細(xì)胞建立或細(xì)胞生長狀態(tài)不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛后再換成無血清培養(yǎng)液。（3） 抗生素：青霉素，鏈霉素-防止感染。2.血清在動物細(xì)胞培養(yǎng)中的作用：補充基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量不足的營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等；提

31、供細(xì)胞生存和增殖所必需的生長調(diào)節(jié)因子和激素；含有一些可供貼壁細(xì)胞型細(xì)胞貼壁生長的成分：如貼附因子；提供載體蛋白：結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。中和有毒物質(zhì)的毒性、保護細(xì)胞不受傷害；提供良好的緩沖系統(tǒng)；提供蛋白酶抑制劑，保護細(xì)胞免受死細(xì)胞釋放的蛋白酶的傷害。3.動物細(xì)胞與植物細(xì)胞培養(yǎng)的比較：相同：培養(yǎng)離散的細(xì)胞動物細(xì)胞植物細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞、組織細(xì)胞、組織、器官和個體培養(yǎng)周期大多生命周期較短，不能無限期培養(yǎng)可以長期培養(yǎng)培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價格高，比較專一較簡單、成分一般明確，培養(yǎng)條件37，pH 7.2-7.4， 5%二氧化碳25培養(yǎng)環(huán)境容易污染，環(huán)境條件要求非常潔

32、凈潔凈4.培養(yǎng)細(xì)胞的生命期：（1） 原代培養(yǎng)(primary culture)期：指直接從機體取出的細(xì)胞、 組織和器官進行的第一代培養(yǎng)物。 特點：剛剛離體的細(xì)胞，其生物性狀尚未發(fā)生很大變化，能最大程度地反映細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài)。（2） 傳代培養(yǎng)(subculture)期：原代培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層會合以后，將其分散，按一定的比例轉(zhuǎn)移到另外的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。（3） 衰退期（decline phase)：細(xì)胞傳代一定次數(shù)后，逐漸失去增殖能力，最后衰老、死亡，這個時期為衰退期。 原因復(fù)雜，最主要的原因是無法完全模擬體內(nèi)的條件，導(dǎo)致細(xì)胞退化。5.動物細(xì)胞培養(yǎng)方法：懸滴培養(yǎng)法（微室培養(yǎng)）；培養(yǎng)瓶培

33、養(yǎng)法；培養(yǎng)板培養(yǎng)法；旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法；灌注小室（perfusion chamber）培養(yǎng)法。6.動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：（1） 研究細(xì)胞生物學(xué)、分析基因功能的有效手段。（2） 毒性及安全性分析：用于各種化學(xué)、物理、生物因素對機體的毒性實驗及其產(chǎn)生不良影響的安全性調(diào)查。（3） 診斷孕早期胎兒性別和遺傳疾?。河醚蚰ご┐绦g(shù)獲得的羊水中胎兒細(xì)胞進行培養(yǎng)，產(chǎn)前檢測出多種代謝病與遺傳病，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。（4） 藥物的研發(fā)與生產(chǎn)：動物細(xì)胞是藥物篩選的首要模型，對新藥篩選、疫苗的研制、基因工程藥物的開發(fā)具有決定性意義。（5） 作為生物反應(yīng)器，廣泛用于人用和家禽家畜用的疫苗、生長激素、多肽等生化藥物的生產(chǎn)。（6） 再生組織、器官，為組織、器官移植提供供體。第9章 動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合（cell fusion）：通過誘導(dǎo)兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合；如果2個不同的細(xì)胞進行融合，則稱為細(xì)胞雜交（cell hybridization）。同核體（homokaryon）：由同一