1、第四章第四章 酶酶 本章主要介紹酶的化學本質(zhì)、結(jié)構(gòu)和特性；本章主要介紹酶的化學本質(zhì)、結(jié)構(gòu)和特性；酶的作用動力學；酶的作用機理；酶的應用；酶的作用動力學；酶的作用機理；酶的應用；還介紹了別構(gòu)酶、共價調(diào)節(jié)酶、同工酶等的概還介紹了別構(gòu)酶、共價調(diào)節(jié)酶、同工酶等的概念、性質(zhì)、生物學意義。念、性質(zhì)、生物學意義。一、酶的概念一、酶的概念 （一）酶的生物學意義（一）酶的生物學意義 6CO2+6H2O+能量能量 C6H12O6+6O2 植物植物動物動物N2+3H2 500 ,300大氣壓大氣壓Fe2NH3N2 + 3H2 2NH3某些微生物某些微生物（二）酶是生物催化劑（二）酶是生物催化劑 1酶與一般催化劑的共

2、同點酶與一般催化劑的共同點 （2）用量少而催化效率高）用量少而催化效率高 （3）能加快化學反應的速度，但不改變平衡點，反）能加快化學反應的速度，但不改變平衡點，反 應前后本身不發(fā)生變化應前后本身不發(fā)生變化 如如 CO2+H2O H2CO3 (1) (1) 只催化熱力學上允許進行的反應只催化熱力學上允許進行的反應（3）降低反應所需的活化能）降低反應所需的活化能 例 2H2O22H2O+O2 反 應活化能非催化反應75.24kJ/mol鈀催化反應48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol2酶作為生物催化劑的特殊點酶作為生物催化劑的特殊點 （1）高的催化效率）高的催化效率 以摩爾為單位進

3、行比較，酶的催化效率比化學催以摩爾為單位進行比較，酶的催化效率比化學催化劑高化劑高1071013倍，比非催化反應高倍，比非催化反應高1081020倍。倍。 例例 2H2O22H2O+O2 1mole H2O2酶酶 能催化能催化 5106mole H2O2的分解的分解 1mole Fe3+ 只能催化只能催化610-4mole H2O2的分解的分解 轉(zhuǎn)換數(shù)（轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number, TN or kcat）: 每秒鐘或每分鐘，每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，或每每秒鐘或每分鐘，每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，或每秒鐘或每分鐘每摩爾酶轉(zhuǎn)換底物的摩爾數(shù)。秒鐘或每分鐘每摩爾酶轉(zhuǎn)換底物的摩爾數(shù)。 （

4、2）高的專一性）高的專一性（3）溫和的反應條件）溫和的反應條件 （4）酶在體內(nèi)受到嚴格調(diào)控）酶在體內(nèi)受到嚴格調(diào)控 如酶濃度的調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、抑制如酶濃度的調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、抑制劑和激活劑的調(diào)節(jié)、別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共價修飾調(diào)節(jié)、劑和激活劑的調(diào)節(jié)、別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共價修飾調(diào)節(jié)、酶原活化等。酶原活化等。 （5）酶的催化活力與輔酶、輔基和金屬離子有關(guān)）酶的催化活力與輔酶、輔基和金屬離子有關(guān) （三）酶的化學本質(zhì) 1大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)（大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)（Most enzymes are proteins） 1926年美國年美國Sumner 脲酶的結(jié)晶，并指出酶是蛋白質(zhì)脲酶的結(jié)晶，并指出酶是蛋白質(zhì)

5、 1930年年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶，并進一步證明了酶是蛋白質(zhì)。白酶的結(jié)晶，并進一步證明了酶是蛋白質(zhì)。 J.B.SumnerJ.H.Northrop 20世紀世紀80年代發(fā)現(xiàn)某些年代發(fā)現(xiàn)某些RNA有催化有催化活性，還有一些抗體也有催化活性，活性，還有一些抗體也有催化活性，甚至有些甚至有些DNA也有催化活性，使酶是也有催化活性，使酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念受到很大沖擊。蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念受到很大沖擊。 2某些某些RNA有催化活性有催化活性 1982年美國年美國T. Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲的等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲的rRNA前前體能在完全沒

6、有蛋白質(zhì)的情況下進行自我加工，發(fā)體能在完全沒有蛋白質(zhì)的情況下進行自我加工，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)RNA有催化活性有催化活性 Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA 1983年美國年美國S.Altman等研究等研究RNaseP（由（由20%蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和80%的的RNA組成），發(fā)現(xiàn)組成），發(fā)現(xiàn)RNaseP中的中的RNA可催化可催化E. coli tRNA的前體加工。的前體加工。 Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA Cech和和Altman各自獨立地發(fā)現(xiàn)了各自獨立地發(fā)現(xiàn)了RNA的催的催化活

7、性，并命名這一類酶為化活性，并命名這一類酶為ribozyme（核酶），（核酶），2人共同獲人共同獲1989年諾貝爾化學獎。年諾貝爾化學獎。 1Cell vol 31, 147157，1982年。年。 2Sci. Amer. Vol 255, 6475，1986。 3抗體酶（抗體酶（abzyme） 抗體：與抗原特異結(jié)合的免疫球蛋白?？贵w：與抗原特異結(jié)合的免疫球蛋白。 抗體酶：指具有催化功能的抗體分子，在抗體分子的可變區(qū)抗體酶：指具有催化功能的抗體分子，在抗體分子的可變區(qū) （即肽鏈的（即肽鏈的N端）是識別抗原的活性區(qū)域，這部分區(qū)端）是識別抗原的活性區(qū)域，這部分區(qū) 域被賦予了酶的屬性。域被賦予了酶的

8、屬性。 1986年美國年美國Schultz和和Lerner兩個實驗室同時在兩個實驗室同時在Science上上發(fā)表論文，報道他們成功地得到了具有催化活性的抗體。發(fā)表論文，報道他們成功地得到了具有催化活性的抗體。 抗體酶的性質(zhì)抗體酶的性質(zhì) 抗體酶的用途抗體酶的用途 抗體酶可催化多種化學反應，包括酯水解、酰胺水解、?；D(zhuǎn)移、抗體酶可催化多種化學反應，包括酯水解、酰胺水解、?；D(zhuǎn)移、光誘導反應、氧化還原分應、金屬螯合反應等。其中有的反應過光誘導反應、氧化還原分應、金屬螯合反應等。其中有的反應過去根本不存在一種生物催化劑能催化它們進行，甚至可以使熱力去根本不存在一種生物催化劑能催化它們進行，甚至可以使熱

9、力學上無法進行的反應得以進行。學上無法進行的反應得以進行?？贵w酶的研究，為人們提供了一條合理途徑去設(shè)計適合于市場需抗體酶的研究，為人們提供了一條合理途徑去設(shè)計適合于市場需要的蛋白質(zhì)，即人為地設(shè)計制作酶。它是酶工程的一個全新領(lǐng)域。要的蛋白質(zhì)，即人為地設(shè)計制作酶。它是酶工程的一個全新領(lǐng)域。利用動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的高度專一性，可以得到一系列高度利用動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的高度專一性，可以得到一系列高度專一性的抗體酶，使抗體酶不斷豐富。隨之出現(xiàn)大量針對性強、專一性的抗體酶，使抗體酶不斷豐富。隨之出現(xiàn)大量針對性強、藥效高的藥物。立本專一性抗體酶的研究，使生產(chǎn)高純度立體專藥效高的藥物。立本專一性抗體酶的研

10、究，使生產(chǎn)高純度立體專一性的藥物成為現(xiàn)實。以某個生化反應的過渡態(tài)類似物來誘導免一性的藥物成為現(xiàn)實。以某個生化反應的過渡態(tài)類似物來誘導免疫反應，產(chǎn)生特定抗體酶，以治療某種酶先天性缺陷的遺傳病。疫反應，產(chǎn)生特定抗體酶，以治療某種酶先天性缺陷的遺傳病?？贵w酶可有選擇地使病毒外殼蛋白的肽鍵裂解，從而防止病毒與抗體酶可有選擇地使病毒外殼蛋白的肽鍵裂解，從而防止病毒與靶細胞結(jié)合?？贵w酶的固定化已獲得成功，將大大地推進工業(yè)化靶細胞結(jié)合?？贵w酶的固定化已獲得成功，將大大地推進工業(yè)化進程。進程。4有些有些DNA也有催化活性也有催化活性 1995年年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)有些等發(fā)現(xiàn)有些DNA分子亦分子亦具有催化活性

11、。具有催化活性。 （四）酶的組成（四）酶的組成 1單純蛋白質(zhì)酶類單純蛋白質(zhì)酶類 2綴合蛋白質(zhì)酶類綴合蛋白質(zhì)酶類 全酶全酶=酶蛋白酶蛋白+輔助因子（輔酶、輔基或金屬離子）輔助因子（輔酶、輔基或金屬離子） 輔基（輔基（prosthetic group）結(jié)合比較緊，用透析的方法不易除去結(jié)合比較緊，用透析的方法不易除去的小分子物質(zhì)的小分子物質(zhì) 輔酶（輔酶（coenzyme）和酶蛋白結(jié)合較松，用透析的方法可以除和酶蛋白結(jié)合較松，用透析的方法可以除去的小分子有機物去的小分子有機物 金屬離子或小分子有機化合物金屬離子或小分子有機化合物輔酶不具備專一型，酶的催化專一性由酶的蛋白質(zhì)部分決定輔酶不具備專一型，酶的

12、催化專一性由酶的蛋白質(zhì)部分決定（五）根據(jù)酶蛋白分子的特點將酶分成三類（五）根據(jù)酶蛋白分子的特點將酶分成三類 1單體酶（單體酶（monomeric enzyme） 一條肽鏈，水解酶一條肽鏈，水解酶2寡聚酶（寡聚酶（oligomeric enzyme）幾個或多個亞基組成，亞基之間以非共價鍵集合，幾個或多個亞基組成，亞基之間以非共價鍵集合，大多為糖代謝酶大多為糖代謝酶 3多酶復合物（多酶復合物（multienzyme complex） 幾個酶嵌合而成的復合物幾個酶嵌合而成的復合物2-6個功能相關(guān)的酶組成個功能相關(guān)的酶組成丙酮酸脫氫酶復合物和脂肪酸合成酶復合物丙酮酸脫氫酶復合物和脂肪酸合成酶復合物二、

13、酶的命名和分類二、酶的命名和分類 1961年國際酶學委員會（年國際酶學委員會（enzyme commission）提）提出的酶的命名和分類方法。出的酶的命名和分類方法。 （一）命名（一）命名 1系統(tǒng)名稱（系統(tǒng)名稱（systematic name） （1）標明底物，催化反應的性質(zhì)）標明底物，催化反應的性質(zhì) G-6-PF-6-P G-6-P異構(gòu)酶異構(gòu)酶 例例:（2）兩個底物參加反應時應同時列出，中間用冒號（）兩個底物參加反應時應同時列出，中間用冒號（:） 分開。如其中一個底物為水時，水可略去。分開。如其中一個底物為水時，水可略去。 例例1： 丙氨酸丙氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸+丙酮酸丙

14、酮酸 丙氨酸丙氨酸:-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶 例例2： 脂肪脂肪+H2O 脂酸脂酸+甘油甘油 脂肪水解酶脂肪水解酶 2習慣名稱（習慣名稱（recommended name） （1）底物）底物 （2）反應性質(zhì)）反應性質(zhì) （3）底物，反應性質(zhì)）底物，反應性質(zhì) （4）來源或其它特點）來源或其它特點 （二）系統(tǒng)分類法及編號（二）系統(tǒng)分類法及編號 1分類分類: 6大類酶，氧轉(zhuǎn)水大類酶，氧轉(zhuǎn)水 裂異連裂異連2編號編號: 用用4個阿拉伯數(shù)字的編號表示，數(shù)字中用個阿拉伯數(shù)字的編號表示，數(shù)字中用“”隔隔開，前面冠以開，前面冠以EC（為（為Enzyme Commission）。）。EC 類類.亞類亞

15、類.亞亞類亞亞類.排號，如排號，如EC l.1.1.1 Enzyme Handbook， Thomas E Barman編，編，Vol I, Vol II 1969年。年。 Enzyme Handbook，Thomas E. Barman編編 Supplement I, 1974年。年。 （三）六大類酶催化反應的性質(zhì)（三）六大類酶催化反應的性質(zhì) 1氧化還原酶類（氧化還原酶類（oxido-reductases） 催化氧化還原反應的酶，包括氧化酶類、催化氧化還原反應的酶，包括氧化酶類、脫氫酶類、過氧化氫酶、過氧化物酶等。脫氫酶類、過氧化氫酶、過氧化物酶等。 p329（1）氧化酶類：催化底物脫氫，并

16、氧化生成）氧化酶類：催化底物脫氫，并氧化生成H2O或或H2O2 。2A2H+O2 2A+2H2O A2H+O2 A+H2O2 鄰苯二酚氧化酶（鄰苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，鄰苯二酚：氧氧化酶），鄰苯二酚：氧氧化酶） 鄰苯二酚鄰苯二酚鄰苯醌鄰苯醌例：例：OHOH+ O2鄰鄰苯苯二二酚酚氧氧化化酶酶OO2+ 2H2O2（2）脫氫酶類：直接催化底物脫氫）脫氫酶類：直接催化底物脫氫 A2H + B A + B2H 例：乳酸脫氫酶（例：乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：乳酸：NAD+氧化還原酶）氧化還原酶） 乳酸乳酸丙酮酸丙酮酸COOHC HCH3H O+ NAD+COOHCOCH

17、3+ NADH + H+乳乳酸酸脫脫氫氫酶酶2轉(zhuǎn)移酶類（轉(zhuǎn)移酶類（transferases） 催化基團的轉(zhuǎn)移催化基團的轉(zhuǎn)移 AR+ BBRA +例：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（例：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）（）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：丙氨酸： 酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶）酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶） 3水解酶類（水解酶類（hydrolases） AB + H2O AOH + BH 蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，蔗糖酶蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，蔗糖酶4裂合酶類（裂合酶類（lyases） 從底物移去一個基團而形成雙鍵或逆反應從底物移去一個基團而形成雙鍵或逆反應 AB A + B 例例1：草酰乙酸脫羧酶草酰乙酸脫羧酶碳酸酐酶碳酸酐酶

18、例例2：5異構(gòu)酶類（異構(gòu)酶類（isomerase） 催化異構(gòu)化反應催化異構(gòu)化反應 例：例：AB6連接酶類（連接酶類（ligases, 也稱也稱synthetases合成酶類）合成酶類） 將兩個小分子合成一個大分子，通常需要將兩個小分子合成一個大分子，通常需要ATP供能。供能。 例：例： 乙酸+CoASH+ATP 乙酰SCoA+AMP+PPiA + B + ATP AB + ADP + PiA + B + ATP AB + AMP + PPi（連接酶）（異構(gòu)）（裂合）（水解）（一）酶的活性中心（一）酶的活性中心（active center）和必需基團）和必需基團活性中心的概念活性中心的概念 酶是

19、蛋白質(zhì)，是大分子化合物，在這樣一個大分子中只有一酶是蛋白質(zhì)，是大分子化合物，在這樣一個大分子中只有一小部分是與底物結(jié)合，并與催化作用直接有關(guān)，這個部位稱酶的小部分是與底物結(jié)合，并與催化作用直接有關(guān)，這個部位稱酶的活性中心。活性中心。 不需要輔酶的酶：活性中心就是酶分子在三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的不需要輔酶的酶：活性中心就是酶分子在三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的少數(shù)幾個少數(shù)幾個AA殘基或是這些殘基上的某些基團殘基或是這些殘基上的某些基團需要輔酶的酶：輔酶分子或輔酶分子上的某一部分結(jié)構(gòu)往往就是需要輔酶的酶：輔酶分子或輔酶分子上的某一部分結(jié)構(gòu)往往就是活性中心的組成部分活性中心的組成部分活性中心的兩個功能部位：結(jié)合部

20、位和催化部位活性中心的兩個功能部位：結(jié)合部位和催化部位三、酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系三、酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 組成酶活性中心的氨基酸側(cè)鏈基組成酶活性中心的氨基酸側(cè)鏈基團主要有團主要有Glu和和ASP的的-COOH，Lys的的-NH2，His的咪唑基，的咪唑基，Ser的的-OH，Cys的的-SH，Tyr的側(cè)鏈基團。的側(cè)鏈基團。 酶活性中心酶活性中心 結(jié)合部位（結(jié)合位）結(jié)合部位（結(jié)合位） 催化部位（催化位）催化部位（催化位） 底物靠此部位和酶分子結(jié)合底物靠此部位和酶分子結(jié)合底物的鍵在此處被打斷或形成新的底物的鍵在此處被打斷或形成新的鍵，從而發(fā)生一定的化學變化鍵，從而發(fā)生一定的化學變化（二）酶原的激活（二

21、）酶原的激活1、胃蛋白酶原（、胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活）的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（從從N N端端失失去去4 44 4個個氨氨基基酸酸殘殘基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶2、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活）的激活 3、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活）的激活 （三）（三） 同工酶（同工酶（isoenzyme or isozyme） 1 同工酶的概念同工酶的概念 同工酶的概念同工酶的概念 同工酶的性質(zhì)同工酶的性質(zhì) 2 乳酸脫氫酶（乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,

22、LDH） 組成和電泳行為組成和電泳行為 HHHH (LDH1) HHHM (LDH2) HHMM (LDH3) HMMM (LDH4) MMMM (LDH5)功能功能 催化的反應催化的反應 乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 LDH5骨骼肌骨骼肌:乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 心肌心肌:LDH1同工酶研究的意義同工酶研究的意義 代謝調(diào)節(jié)、個體發(fā)育、細胞分化、分子代謝調(diào)節(jié)、個體發(fā)育、細胞分化、分子遺傳等方面遺傳等方面蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能臨床和農(nóng)業(yè)臨床和農(nóng)業(yè)四、酶的專一性四、酶的專一性（一）酶的專一性（特異性，（一）酶的專一性（特異性，specificity） 1、絕對專一性（、絕對專一性（abso

23、lute specificity） 例例: CONH2NH2H2O脲脲酶酶CO2 + 2NH3CONH2NHCH3H2O脲脲酶酶X（1）族專一性（基團專一性，）族專一性（基團專一性，group specificity） 2、相對專一性（、相對專一性（relative specificity） A B 或或 A B如如-D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 OCH2OHOHOHOOHR（2）鍵專一性）鍵專一性 A BR1COOR2+ H2O酯酯酶酶R1COOH + R2OH3、立體專一性（、立體專一性（stereospecificity） （1）D-，L-立體異構(gòu)專一性立體異構(gòu)專一性 乳酸脫氫酶催化乳酸脫氫

24、酶催化L乳酸脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，而對乳酸脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，而對D-乳酸無作用乳酸無作用（2）酶能區(qū)分從有機化學觀點來看是屬于對稱分子中兩個等）酶能區(qū)分從有機化學觀點來看是屬于對稱分子中兩個等 同的基團，只催化其中的一個基團，而不催化另一個。同的基團，只催化其中的一個基團，而不催化另一個。 例1： CH2OHCHCH2OHHO14+ ATP甘甘油油激激酶酶CH2CHCH2OHHO14OP+ ADP若甘油激酶不能區(qū)分兩個若甘油激酶不能區(qū)分兩個CH2OH基團，則會生成基團，則會生成 :CH2CHCH2OHHO14OPCH2OHCHCH2HO14OP和和（二）關(guān)于酶作用專一性的幾種假說（二）關(guān)于酶作用專一性

25、的幾種假說 1、鎖鑰學說（、鎖鑰學說（lock and Key theory） 1894年年 Fischer 提出提出底物分子或底物分子的一部分底物分子或底物分子的一部分象鑰匙那樣，專一地鍥入到酶象鑰匙那樣，專一地鍥入到酶的活性中心部位。的活性中心部位。底物分子進行化學反應的部位底物分子進行化學反應的部位與酶分子上有催化效能的必需與酶分子上有催化效能的必需基團間有緊密的互補關(guān)系基團間有緊密的互補關(guān)系2、三點附著學說、三點附著學說 立體對映的一對底物基團相同但是空間排列不同，基團與立體對映的一對底物基團相同但是空間排列不同，基團與酶分子活性中心的結(jié)合基團不能匹配，只有三點都匹配時，酶分子活性中心

26、的結(jié)合基團不能匹配，只有三點都匹配時，酶才能作用于這個底物。酶才能作用于這個底物。3、誘導契合學說（、誘導契合學說（induced-fit theory） 1958年年 Koshland提出提出“剛性模板學說剛性模板學說”不能解釋不能解釋可逆反應可逆反應AB為催化基團為催化基團C為結(jié)合基團為結(jié)合基團底物上加了個龐大的基團底物上加了個龐大的基團底物上切除了某些基團底物上切除了某些基團五、酶的作用動力學（五、酶的作用動力學（kinetics）什么是酶作用動力學？什么是酶作用動力學？酶促反應動力學酶促反應動力學(kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是是研究酶

27、促反應速度及其影響因素的科學研究酶促反應速度及其影響因素的科學這些因素主要包括酶的濃度、底物的濃度、這些因素主要包括酶的濃度、底物的濃度、pH、溫度、溫度、抑制劑和激活劑等抑制劑和激活劑等酶促反應動力學的研究有助于闡明酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)酶促反應動力學的研究有助于闡明酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，也可為酶作用機理的研究提供數(shù)據(jù)；有助于尋找最系，也可為酶作用機理的研究提供數(shù)據(jù)；有助于尋找最有利的反應條件，以最大限度地發(fā)揮酶催化反應的高效有利的反應條件，以最大限度地發(fā)揮酶催化反應的高效率；有助于了解酶在代謝中的作用或某些藥物作用的機率；有助于了解酶在代謝中的作用或某些藥物作用的機理等，因此對它的研究具有重要

28、的理論意義和實踐意義。理等，因此對它的研究具有重要的理論意義和實踐意義。（一）底物濃度對酶反應速度的影響（一）底物濃度對酶反應速度的影響 1米氏方程的提出米氏方程的提出 P356底物濃度較低時，反應速度隨底物濃度增加底物濃度較低時，反應速度隨底物濃度增加而升高，反應速度與底物濃度成正比而升高，反應速度與底物濃度成正比底物濃度很大時，底物濃度增加，底物濃度很大時，底物濃度增加，反應速度幾乎不變反應速度幾乎不變底物濃度較高時，底物濃度增加，底物濃度較高時，底物濃度增加，反應速度升高，但不顯著反應速度升高，但不顯著第一步第一步: E+S ES 中間復合物學說：中間復合物學說： 第二步第二步: ESE

29、+P VES 1913年年Michaelis和和Menten推導了米氏方程推導了米氏方程 SKSVvmmax 2米氏方程的推導米氏方程的推導 基本前提：基本前提：反應方程式反應方程式: 在米氏方程推導中引入在米氏方程推導中引入3個假設(shè)個假設(shè): （1）P0 忽略忽略 這步反應這步反應 ESE + Pk4（2） SES ESS （3）E+SES平衡，要求平衡，要求k3S，S忽略不計，忽略不計，V=VmaxS/Km 反應速度與底物濃度成反應速度與底物濃度成正比，符合一級反應。正比，符合一級反應。底物濃度很高時，底物濃度很高時，Kmk3，Km=K2 /K1時，時， Km可表示酶和底物的親和力可表示酶和

30、底物的親和力。 5米氏常數(shù)的求法米氏常數(shù)的求法 （1）v對對S作圖作圖 （2）雙倒數(shù)作圖法（）雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk作圖法）作圖法） P110將米氏方程改寫成將米氏方程改寫成 maxmaxmV1S1VKv1 （二）酶濃度對酶反應速度的影響（二）酶濃度對酶反應速度的影響 1反應速度與酶濃度成正比反應速度與酶濃度成正比 SEVE 0 0酶酶濃濃度度反反應應速速度度2V與與E 關(guān)系的幾點討論關(guān)系的幾點討論 （三）（三）pH對酶反應速度的影響對酶反應速度的影響 1酶反應的最適酶反應的最適pH（optimum pH） 反反應應速速度度pH最最適適p pH H68100 酶的最適酶的

31、最適pH不是一個固定的常數(shù)不是一個固定的常數(shù)，它受到底它受到底物的種類、濃度物的種類、濃度; 緩沖液的種類、濃度緩沖液的種類、濃度; 酶的純度酶的純度;反應的溫度、時間等的影響。反應的溫度、時間等的影響。例例: 堿性磷酸酶催化磷酸苯酯水解時堿性磷酸酶催化磷酸苯酯水解時 s為為2.5x10-5 M，最適，最適pH為為 8.3 s為為2.5x10-2 M，最適，最適pH為為10.0 2pH影響反應速度的原因影響反應速度的原因 ( 1 ) pH影響了酶分子、底物分子和影響了酶分子、底物分子和ES復合物的復合物的 解離狀態(tài)。解離狀態(tài)。 ( 2 ) 過高、過低的過高、過低的pH導致酶蛋白變性。導致酶蛋白

32、變性。（四）溫度對酶反應速度的影響（四）溫度對酶反應速度的影響 1最適溫度（最適溫度（optimum temperature） 最適溫度與最適最適溫度與最適pH一樣，也不是一個固定一樣，也不是一個固定的常數(shù)的常數(shù)，它隨底物的種類、濃度，它隨底物的種類、濃度, 溶液的離子強溶液的離子強度度, pH, 反應時間等的影響。反應時間等的影響。例例: 反應時間短，最適溫度高。反應時間短，最適溫度高。 反應時間長，最適溫度低。反應時間長，最適溫度低。（五）激活劑對酶反應速度的影響（五）激活劑對酶反應速度的影響 什么是激活劑（什么是激活劑（activator）?酶的激活劑酶的激活劑1. 無機離子無機離子 （

33、1）一些金屬離子，如）一些金屬離子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、 Cu2+、Zn2+、Fe2+等。等。 專一性專一性 有的金屬離子可以互相替代有的金屬離子可以互相替代 有的離子間有拮抗作用有的離子間有拮抗作用 （2）陰離子：如）陰離子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等等 （3）氫離子）氫離子 2. 有機分子有機分子3. 具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子，如酶原可被一些具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子，如酶原可被一些 蛋白酶激活，蛋白酶可看作為激活劑。蛋白酶激活，蛋白酶可看作為激活劑。 （2）EDTA（1）某些還原劑如）某些還原劑如Cys、GSH等等（六）酶的抑制作用和抑制作用動力學（六）酶的抑制作用和抑

34、制作用動力學 什么是抑制作用（什么是抑制作用（inhibition）?研究抑制作用的意義研究抑制作用的意義 1、不可逆抑制作用（、不可逆抑制作用（irreversible inhibition） E+IEI例例:二異丙基氟磷酸二異丙基氟磷酸 DFP（DIFP）對胰凝乳蛋白酶的抑制）對胰凝乳蛋白酶的抑制 凡使酶的必需集團或酶活性部位中的基團的化學性質(zhì)改變而凡使酶的必需集團或酶活性部位中的基團的化學性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，稱為抑制劑，降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，稱為抑制劑，用用I表示，其作用稱為抑制作用。表示，其作用稱為抑制作用。2、可逆抑制作用、可逆抑制作用(r

35、eversible inhibition)及其動力學及其動力學 （1）競爭性抑制作用（）競爭性抑制作用（competitive inhibition） E+I EI 抑制劑與酶結(jié)合后可用透析等方法除去抑制劑使酶恢復活力抑制劑與酶結(jié)合后可用透析等方法除去抑制劑使酶恢復活力例例: : 丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制作用丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制作用 延胡索酸延胡索酸 競爭性抑制作用動力學方程的推導競爭性抑制作用動力學方程的推導 競爭性抑制作用可用下式表示競爭性抑制作用可用下式表示 : E + S ES E + Pk1k2k3+Iki2ki1EIEI+S no reaction 推導的要點推導的要點 推

36、導出的方程推導出的方程 )K I 1(KKSKSVvimmmmax 有競爭性抑制劑存在時，有競爭性抑制劑存在時，Km值增大值增大1+I/Ki倍，倍，而且而且Km值隨著值隨著I增高而增大增高而增大 競爭性抑制作用動力學方程的討論競爭性抑制作用動力學方程的討論 A、與標準米氏方程比較、與標準米氏方程比較 B、當、當 I 0時，方程還原成米氏方程。時，方程還原成米氏方程。 mK0v , I 時，時， C、取方程的倒數(shù)，進行雙倒數(shù)作圖、取方程的倒數(shù)，進行雙倒數(shù)作圖 maximaxmV1S1)K I 1(VKv1 D、抑制程度、抑制程度: 0vv1 有有I存在時，改變存在時，改變Km而不改變而不改變Vm

37、ax的作用，競爭性抑制作用的作用，競爭性抑制作用的特點時當?shù)孜餄舛群芨邥r，的特點時當?shù)孜餄舛群芨邥r，抑制作用可以被解除抑制作用可以被解除SVSKS)KI(1KSV1vv1maxmimmax0 S)KI(1KSK1imm 當當S 很大很大很大很大0vv1 SS1 0 （2）非競爭性抑制作用（）非競爭性抑制作用（noncompetitive inhibition） E+S ES ESI IE+I EI ESI S 非競爭性抑制作用動力學公式推導非競爭性抑制作用動力學公式推導 非競爭性抑制作用可用下式表示非競爭性抑制作用可用下式表示 :E + S ES E + Pkm+IkiEI + S+IkiEI

38、Skm經(jīng)推導后得方程經(jīng)推導后得方程 : imaxmaxmmaxK I 1VVSKSVv 非競爭性抑制作用動力學方程討論非競爭性抑制作用動力學方程討論 A、與米氏方程比較、與米氏方程比較 imaxK I 1VV B、當當I0 VVmax I 0v0Vmax C、取方程倒數(shù)，進行雙倒數(shù)作圖、取方程倒數(shù)，進行雙倒數(shù)作圖 D、抑制程度、抑制程度: 0vv1 非競爭性抑制作用的機制可能是抑制劑作用非競爭性抑制作用的機制可能是抑制劑作用于酶活性部位中催化基團，也可能是維持酶于酶活性部位中催化基團，也可能是維持酶分子構(gòu)象的必需基團作用，而使酶的活性降低分子構(gòu)象的必需基團作用，而使酶的活性降低兩種可逆抑制作用

39、的總結(jié)兩種可逆抑制作用的總結(jié) 酶先與底物結(jié)合再與抑制劑結(jié)合酶先與底物結(jié)合再與抑制劑結(jié)合 P373（3）反競爭性抑制作用（）反競爭性抑制作用（anticompetitive inhibition） 類型類型VmaxKm無抑制劑無抑制劑VmaxKm競爭性抑制劑競爭性抑制劑不變不變增加增加非競爭性抑制劑非競爭性抑制劑 減小減小不變不變反競爭性抑制劑反競爭性抑制劑 減小減小減小減小3、一些重要的抑制劑及其實際意義、一些重要的抑制劑及其實際意義 （1）不可逆抑制劑：）不可逆抑制劑：E+IEI POOXOR1R2POOXR2R1或或有機磷化合物有機磷化合物 化學結(jié)構(gòu)通式化學結(jié)構(gòu)通式: R1、R2 : 烷基

40、烷基 ; X: -F, -CN等等 這些有機磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶這些有機磷化合物能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，特別是強烈抑制膽堿酯酶。使昆蟲體內(nèi)的活力，特別是強烈抑制膽堿酯酶。使昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿大量積累，影響神經(jīng)傳導，使昆蟲功的乙酰膽堿大量積累，影響神經(jīng)傳導，使昆蟲功能失調(diào)，失去知覺而死亡能失調(diào)，失去知覺而死亡 。膽堿膽堿 乙酸乙酸乙酰膽堿乙酰膽堿乙酰膽堿酶乙酰膽堿酶膽堿酯酶膽堿酯酶 有機磷化合物中常用的是有機磷化合物中常用的是DFP以及有機磷殺蟲以及有機磷殺蟲劑，如劑，如1605、敵百蟲、敵敵畏、樂果等。、敵百蟲、敵敵畏、樂果等。（2）可逆抑制劑）可逆抑制劑 最常見的是競爭性抑制

41、劑最常見的是競爭性抑制劑 例例1：磺胺藥中的對一氨基苯磺酰胺：磺胺藥中的對一氨基苯磺酰胺 SO2 NH2H2N對氨基苯磺酰胺與對氨基苯磺酰胺與PABA兩者競爭兩者競爭FH2合成酶合成酶 （PABA）細菌：細菌：PABAFH2合成酶合成酶FH2FH4人服用的磺胺藥物作為競爭性抑制劑和細菌體內(nèi)的人服用的磺胺藥物作為競爭性抑制劑和細菌體內(nèi)的FH2合成酶結(jié)合，合成酶結(jié)合，從而使細菌體內(nèi)代謝紊亂，細菌繁殖受到抑制從而使細菌體內(nèi)代謝紊亂，細菌繁殖受到抑制六、酶的作用機理六、酶的作用機理（一）與酶高效率有關(guān)的因素（一）與酶高效率有關(guān)的因素 1、鄰近效應與定向效應、鄰近效應與定向效應 （proximity a

42、nd orientation effect） 化學反應速度于底物濃度成正比化學反應速度于底物濃度成正比底物分子進入活性中心區(qū)域，提高活性中心區(qū)域的底物有效濃度底物分子進入活性中心區(qū)域，提高活性中心區(qū)域的底物有效濃度雙羧酸單苯基酯雙羧酸單苯基酯受羧基催化受羧基催化酸酐酸酐鄰近效應：指兩個反應的分子，它們反應的基團鄰近效應：指兩個反應的分子，它們反應的基團需要互相靠近，才能反應。需要互相靠近，才能反應。 定向效應定向效應: 指酶的催化基團與底物的反應基團指酶的催化基團與底物的反應基團之間的正確向。之間的正確向。 2、張力效應和底物形變（、張力效應和底物形變（strain and distortio

43、n） 酶和底物的分子構(gòu)型都會發(fā)生酶和底物的分子構(gòu)型都會發(fā)生變化。（羧肽酶變化。（羧肽酶A）3、酸堿催化（、酸堿催化（acid-base catalysis） OHNNOH酚酚吡啶吡啶羥基吡啶羥基吡啶酶蛋白質(zhì)中集中可以起廣義酸堿催化作用的功能基，入酶蛋白質(zhì)中集中可以起廣義酸堿催化作用的功能基，入氨基、羧基、巰基、酚羥基和咪唑基等氨基、羧基、巰基、酚羥基和咪唑基等4、共價催化（、共價催化（covalent catalysis） 什么是共價催化？什么是共價催化？ 共價催化共價催化 親電子催化親電子催化 親核催化親核催化底物于酶形成一個反應活性很高的共價中間物，底物于酶形成一個反應活性很高的共價中間物

44、，此中間物很容易變成過渡態(tài)，因此能大大降低反應活化能此中間物很容易變成過渡態(tài)，因此能大大降低反應活化能（二）某些酶的活性中心及其作用機理（二）某些酶的活性中心及其作用機理 1、溶菌酶（、溶菌酶（Lysozyme） N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸 N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺 -1.4糖苷鍵糖苷鍵底物斷裂部位底物斷裂部位D糖環(huán)構(gòu)象由椅式糖環(huán)構(gòu)象由椅式變成半椅式變成半椅式Glu35Asp52酶使底物分子變形酶使底物分子變形廣義的酸堿催化廣義的酸堿催化2、羧肽酶、羧肽酶A（carboxypeptidase A，CpA） 催化C端肽鍵水解Glu 270Arg 145Tyr 248酶單獨存在時酶單獨存在時 :

45、Arg 145Tyr 248Glu 270酶底物復合物酶底物復合物 :底物誘導后，酶底物誘導后，酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化生了很大的變化Glu270使底物的敏感肽鍵發(fā)生電子張力而易斷裂使底物的敏感肽鍵發(fā)生電子張力而易斷裂七、別構(gòu)酶（也稱變構(gòu)酶，七、別構(gòu)酶（也稱變構(gòu)酶，allosteric enzyme） p413（一）別構(gòu)酶結(jié)構(gòu)上的特點（一）別構(gòu)酶結(jié)構(gòu)上的特點 （二）別構(gòu)酶性質(zhì)上的特點（二）別構(gòu)酶性質(zhì)上的特點 （三）別構(gòu)酶的別構(gòu)效應（三）別構(gòu)酶的別構(gòu)效應（allosteric effect） 1、什么是別構(gòu)效應、什么是別構(gòu)效應 一般都是寡聚酶一般都是寡聚酶當?shù)孜锘虻孜镆酝獾姆?/p>

46、子和別構(gòu)酶分子上的相應部位非共當?shù)孜锘虻孜镆酝獾姆肿雍蛣e構(gòu)酶分子上的相應部位非共價結(jié)合后，通過酶分子構(gòu)象的變化影響酶的催化活性價結(jié)合后，通過酶分子構(gòu)象的變化影響酶的催化活性反應初反應初v對對S作圖不服從米氏曲線作圖不服從米氏曲線（四）別構(gòu)酶的作用動力學（四）別構(gòu)酶的作用動力學 p4131、正協(xié)同效應（、正協(xié)同效應（positive cooperative effect） 2、負協(xié)同效應（、負協(xié)同效應（negative cooperative effect） 3、正協(xié)同效應別構(gòu)酶與米氏酶動力學比較、正協(xié)同效應別構(gòu)酶與米氏酶動力學比較 4、負協(xié)同效應別構(gòu)酶與米氏酶動力學比較、負協(xié)同效應別構(gòu)酶與米氏

47、酶動力學比較 怎么區(qū)分米氏酶與別構(gòu)酶？怎么區(qū)分米氏酶與別構(gòu)酶？ Koshland建議用飽和比值（建議用飽和比值（saturation ratio, Rs） 飽飽和和度度時時的的底底物物濃濃度度結(jié)結(jié)合合達達到到配配基基酶酶與與底底物物飽飽和和度度時時的的底底物物濃濃度度結(jié)結(jié)合合達達到到配配基基酶酶與與底底物物%10)(%90)(Rs 典型的米氏酶典型的米氏酶 RS=81 具有正協(xié)同效應的別構(gòu)酶具有正協(xié)同效應的別構(gòu)酶 RS81 （五）別構(gòu)酶舉例（五）別構(gòu)酶舉例 1、大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（、大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（E.coli aspartate transcarbamylase, ATC

48、ase） （1）ATCase催化的化學反應和催化的化學反應和ATCase的動力學曲線的動力學曲線 （2）ATCase活性調(diào)節(jié)的機理活性調(diào)節(jié)的機理 CTPATP有催化活性的構(gòu)象有催化活性的構(gòu)象 無催化活性的構(gòu)象無催化活性的構(gòu)象 CCCCCCR汞汞鹽鹽完完整整的的催催化化亞亞基基調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)亞亞基基CCCCCC+（三三聚聚體體）（二二聚聚體體）（活活性性）ATCaseRR RR RR RR RR R（六）別構(gòu)酶調(diào)節(jié)酶活性的機理（六）別構(gòu)酶調(diào)節(jié)酶活性的機理 1、對稱或協(xié)同模型（、對稱或協(xié)同模型（symmetry or concerted model,也稱齊變模型、也稱齊變模型、MWC模型）模型） 196

49、5年由年由Monod、Wyman和和Changeux提出。提出。 該模型的要點該模型的要點 : 2、序變模型（、序變模型（sequential model，也稱，也稱KNF模型）模型） 1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer提出。提出。 該模型的要點 :八、酶的活力測定八、酶的活力測定 p3351選材選材 2破碎細胞破碎細胞 3抽提抽提 4去核酸、去多糖去核酸、去多糖 5提純提純 6保存保存 （一）（一） 酶的制備酶的制備由于酶的特殊性，在提純過程中要注意由于酶的特殊性，在提純過程中要注意 :1全部操作在低溫全部操作在低溫04。 2在分離提純過程中，不能劇烈攪拌。在分

50、離提純過程中，不能劇烈攪拌。 3在提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo劑，如少量在提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo劑，如少量EDTA、 少量少量-巰基乙醇。巰基乙醇。 4在分離提純過程中要不斷測定在分離提純過程中要不斷測定酶活力酶活力和蛋白質(zhì)濃和蛋白質(zhì)濃 度，從而求得度，從而求得比活力比活力，還要計算，還要計算總活力總活力。 （二）酶活力的測定（二）酶活力的測定 p338酶活力（酶活力（enzyme activity, 也稱酶活性）也稱酶活性） 酶活力的測定酶活力的測定 1測定酶活力時應注意幾點測定酶活力時應注意幾點 （1）應測反應初速度（）應測反應初速度（initial velocity or initial spee

51、d） （2）酶的反應速度一般用單位時間）酶的反應速度一般用單位時間 內(nèi)產(chǎn)物的增加量來表示。內(nèi)產(chǎn)物的增加量來表示。 （3）測酶活力時應使反應溫度、）測酶活力時應使反應溫度、pH、離子、離子 強度和底物濃度等因素保持恒定。強度和底物濃度等因素保持恒定。 （4）測定酶反應速度時，應使）測定酶反應速度時，應使SE。 產(chǎn) 物 濃 度 P(t)2酶活力和比活力表示方式酶活力和比活力表示方式 （1）酶活力（）酶活力（enzyme activity） 酶活力的定義酶活力的定義 酶活力的大小用酶活力單位來表示，簡稱酶單位（酶活力的大小用酶活力單位來表示，簡稱酶單位（unit, U） 酶單位的定義酶單位的定義 1

52、961年國際酶單位（年國際酶單位（IU）1972年年Katal（簡稱（簡稱Kat）單位）單位 習慣上沿用的單位如習慣上沿用的單位如 :乳酸乳酸 + NAD+ 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 乳酸脫氫酶的活力可用乳酸脫氫酶的活力可用丙酮酸的增加量丙酮酸的增加量表示，也表示，也可用可用340nm光吸收的增加量光吸收的增加量來表示。來表示。 （2）酶的比活力（）酶的比活力（specific activity，也稱比活性），也稱比活性） 比活力：比活力：指每指每mg蛋白質(zhì)所具有的酶活力蛋白質(zhì)所具有的酶活力，一般用，一般用 U/mg蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)來表示，比活力說明酶的純度。來表

53、示，比活力說明酶的純度。 比活力比活力= 酶活力（酶活力（U/ml）/蛋白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） 比活力有時也可用每比活力有時也可用每g或每或每ml酶含多少個活力單位來表示。酶含多少個活力單位來表示。 （4）分子活性（）分子活性（molecular activity） （5）催化中心活性（）催化中心活性（catalytic center activity） 在最適底物濃度時，每分鐘或每秒鐘每分子酶在最適底物濃度時，每分鐘或每秒鐘每分子酶 轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。（3）轉(zhuǎn)換數(shù)（）轉(zhuǎn)換數(shù)（TN or kcat) 在最適底物濃度時，每分鐘每分子酶轉(zhuǎn)換底物在最適底物濃度時，每分鐘

54、每分子酶轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。的分子數(shù)。每分鐘每一個催化中心所轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。每分鐘每一個催化中心所轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。3. 酶活力的測定方法酶活力的測定方法 P337 分光光度法（分光光度法（spectrophotometry） 該法要求酶的底物和產(chǎn)物在紫外或可見光部該法要求酶的底物和產(chǎn)物在紫外或可見光部分光吸收不同。分光吸收不同。 簡便、迅速、準確。簡便、迅速、準確。 一個樣品可多次測定，有利于動力學研究。一個樣品可多次測定，有利于動力學研究。 可檢測到可檢測到10-9mol/L水平的變化。水平的變化。 優(yōu)點：優(yōu)點：例例: 人血清乳酸脫氫酶活力的測定人血清乳酸脫氫酶活力的測定 L-乳酸乳酸 + NAD+ 丙酮酸丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶九、酶的制備九、酶的制備鹽析法有機溶劑沉淀法吸附法十、酶的應用十、酶的應用工業(yè)農(nóng)業(yè)醫(yī)藥科學研究十一、固定化酶十一、固定化酶（immobilized enzyme） 固定化酶是將水溶性的酶連接到固相載體上，固定化酶是將水溶性的酶連接到固相載體上， 使它以固相的狀態(tài)作用于底物，因此也稱固相酶。使它以固相的狀態(tài)作用于底