1、基于介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器測(cè)定水體中的苯酚及高效液相色譜法 酪氨酸酶（三維尺寸為6.5 nm x9. 8 nm x5.5nm)生物傳感器是催化氧化苯酚的核心部件，同時(shí)酪氨酸酶也是一種生物活性蛋白質(zhì)(體外易失活) 。酪氨酸酶易失活的特性決定了必須要有一個(gè)對(duì)酪氨酸酶分子生物相容性較好的固定材料來提供一個(gè)有利的微環(huán)境，以保持其生物活性和穩(wěn)定性，同時(shí)要求這個(gè)固定基底具有較好的電化學(xué)換能力（導(dǎo)電性)和高的酶載量以提高生物傳感器的靈敏度和檢出限。因此，電化學(xué)酶基生物傳感器發(fā)展的核心是傳感材料，性能優(yōu)良的固定材料能夠顯著提高酶的體外穩(wěn)定性和生物活性。電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器是一種非常有應(yīng)用前景的苯

2、酚污染物檢測(cè)方法。第1頁/共18頁 其對(duì)苯酚的檢測(cè)原理是:電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器能夠利用分子氧催化苯酚生成鄰苯酚和鄰苯醌，而鄰苯醌又可以在電極表面通過電化學(xué)催化還原生成鄰苯酚形成信號(hào)循環(huán)放大。有序介孔碳具有可控的孔結(jié)構(gòu)和孔徑大小。大的比表面積和孔體積、良好的導(dǎo)電性、好的電化學(xué)穩(wěn)定性，可以作為酪氨酸酶的理想固定基底。 本研究將酪氨酸酶分子誘陷到合適孔徑大小的介孔碳材料中，并由此構(gòu)建了基于介孔碳材料的酪氨酸酶生物傳感器。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)介孔碳直徑與酶分子大小相匹配時(shí)，利用介孔碳的空間限制效應(yīng)，可防止酶分子的去折疊失活，提高酶的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和生物活性;同時(shí)酪氨酸酶分子與導(dǎo)電基底之間由于距離較近而減少

3、了長(zhǎng)程電子傳輸，利于電化學(xué)能轉(zhuǎn)化。介孔碳多孔的網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)還可以為酪氨酸酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物提供通暢的通道，提高傳感器的響應(yīng)速度和靈敏度。此外，介孔碳材料優(yōu)良的電化學(xué)換能能力和高的酶載量能夠滿足環(huán)境中酚類檢測(cè)對(duì)酪氨酸酶生物傳感器在靈敏度和檢出限等方面的要求，達(dá)到快速檢測(cè)環(huán)境樣品中苯酚污染物的要求。本研究采用高準(zhǔn)確度的（HPLC）對(duì)電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。第2頁/共18頁1.1材料與試劑 殼寡糖和酪氨酸酶(酶活力大于1 000 /mg,等電點(diǎn)5. 92)都購自美國(guó)西格瑪公司，甲醇(色譜純)購自德國(guó)默克公司，苯酚和其他所有試劑都購自天津科密歐公司。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中采

4、用的水均為Milli-Q水(電阻率18 Mcm）。如果沒有特殊說明，電化學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中的電解質(zhì)溶液均采用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液爭(zhēng)（PH 7. 0)。酶活力（enzyme activity）也稱為酶活性，是指妹催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測(cè)定酶活力實(shí)際就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在一般的酶促反應(yīng)體系中，底物往往是過量的，測(cè)定初速度時(shí)，底物減少量占總量的極少部分，不易準(zhǔn)確檢測(cè)，而產(chǎn)物則是從無到有，只要測(cè)定方法靈敏，就可準(zhǔn)

5、確測(cè)定。因此一般以測(cè)定產(chǎn)物的增量來表示酶促反應(yīng)速度較為合適。這里單位是每毫克酶蛋白所具有的酶活力。單位是u/mg?；盍υ礁邉t酶越純。1.2實(shí)驗(yàn)儀器 透射電鏡(TEM, JEM-2000EX，日本);高效液相色譜儀(按捷倫1200，配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó));物理吸附儀(康塔SI4，美國(guó));CHI 440 B電化學(xué)工作站（上海辰華公司);三電極體系:玻碳電極（GC)為工作電極，Ag/AgCI為參比電極（KCl濃度3 mol/L），鉑電極為對(duì)電極;超聲波清洗器。實(shí)驗(yàn)部分第3頁/共18頁1.3 10 nm孔徑介孔碳材料的制備 本研究以采用溶膠-凝膠法制備的直徑為10nm的單分散硅球作為硬模板，然后以

6、苯乙烯為碳源，經(jīng)惰性氣氛下的高溫催化碳化一去除模板等步驟后，獲得10 nm孔徑的有序介孔碳。步驟一在100 mL的三頸燒瓶中加人0. 0292 g L-賴氨酸、27. 8 mL去離子水以及4 mL的正硅酸乙酯，在70下磁力攪拌反應(yīng)12 h，于80緩慢蒸干溶劑，得到直徑為10 nm的納米硅球。步驟二在石英研缽中研細(xì)上述硅球，然后向模板硅球中加人Ni(NO3)26H20的乙醇水溶液(乙醇/水的體積比為1: 1），最終使Ni與Si的物質(zhì)的量比為1:34。步驟三然后將浸漬過Ni(NO3)26H20的SiO2模板在80烘箱中干燥，然后在紅外壓片機(jī)上壓成厚1mm的薄片（壓力6 Mpa）步驟四向10 mL新

7、鮮蒸餾的苯乙烯單體中滴加0. O5 mL濃硫酸，使苯乙烯初步聚合;取1g浸漬Ni(NO3)2的SiO2模板置于25mL鉗禍中，加人5 mL初步聚合的苯乙烯，于160預(yù)碳化24 h，然后將SiO2 / C的復(fù)合物移人管式爐中，在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至850熱解3h，升溫速率為5 /min。步驟五熱解結(jié)束后將復(fù)合物冷卻至室溫，在20%氫氟酸溶液中攪拌12 h去除SiO2 ，過濾、洗滌后干燥，得到孔徑為10 nm的介孔碳材料。步驟六將制備得到的納米硅球（模板)和介孔碳材料進(jìn)行透射電鏡表征。采用物理吸附儀表征介孔碳材料的氮?dú)馕揭幻摳降葴厍€和孔徑分布。測(cè)定之前，需要將介孔碳樣品于180脫氣6 h。介孔

8、碳材料合成的具體步驟:第4頁/共18頁麂皮是一種野生動(dòng)物麂的皮，粒面?zhèn)麣堓^多，比羊皮厚實(shí)，纖維組織也較緊密，是加工絨面革的上等皮料。麂皮現(xiàn)己很少用，現(xiàn)多用優(yōu)質(zhì)山羊皮，綿羊皮，鹿皮代替，經(jīng)油鞣法制成的清潔用革，質(zhì)地相當(dāng)柔軟,對(duì)于硬度不高的玻璃或者是其他東西相當(dāng)有保護(hù)性.而這種麂皮又分為生麂皮和熟麂皮,生麂皮一般用來擦拭汽車中的玻璃或者是反光鏡的。1.4基于介孔碳材料的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器的構(gòu)建首先將玻碳電極分別在含粒徑1、0.3、0.05m氧化鋁微球的麂（j)皮上打磨，然后用去離子水和無水乙醇分別超聲清洗5 min以去除電極表面弱吸附的氧化鋁，用氮?dú)鈱㈦姌O表面吹干。經(jīng)過條件優(yōu)化，選擇的介孔碳

9、、酪氨酸酶以及殼寡糖的質(zhì)量濃度分別為0.2、2.5、1.5 g/L。基于介孔碳材料的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器的具體組裝步驟:首先，將10 L10 g/L的酪氨酸酶溶液加人到20 L 0. 4 g/L介孔碳溶液中振蕩搖勻30 min;隨后，將具有極強(qiáng)成膜能力的殼寡糖溶液(10 L 6 g/L)加人到上述溶液中，得到酪氨酸酶與介孔碳的混合溶液;最后，取4 L上述溶液滴加到潔凈的玻碳電極表面，用燒杯將玻碳電極蓋住，使玻碳電極表面的水分緩慢蒸干形成均一的薄膜。電極表面的水分蒸干后得到酪氨酸酶修飾的玻碳電極。備注：電化學(xué)測(cè)定之前，所有修飾電極均需要在50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（PH7.0)中攪拌3

10、0 min以去除電極表面弱吸附的成分。第5頁/共18頁電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器采用恒電位方法進(jìn)行苯酚檢測(cè)腔制電位為-0. 1 V，基底溶液為 8 mL50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液)。 高效液相色譜法測(cè)定條件:Diamonsil C18（Diamonsil C18是北京迪馬科技有限公司色譜柱品牌。）、色譜柱(250 mm x 4. 6 mm , 5 m)為分析柱;流動(dòng)相為甲醇-水(4:1, v/v)，流速 1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm;柱溫為30;進(jìn)樣量為10 L。 電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性（A）的評(píng)價(jià)公式:A = (CH-CE )/CH x 100%，其中CH代表

11、高效液相色譜法檢測(cè)的濃度值;CE代表電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)的濃度值。苯酚樣品的測(cè)定取5個(gè)具有代表性的水樣各1 L，分別用25 、15、10 mL的苯萃取3次，合并3次萃取有機(jī)相，隨后采用0. 45 m微孔濾膜過濾，得到待測(cè)溶液。然后分別采用電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器和高效液相色譜法進(jìn)行苯酚檢測(cè)。第6頁/共18頁2.1硅球及介孔碳材料的表征 通過透射電鏡對(duì)按1. 3節(jié)所述方法制備的納米硅球進(jìn)行了表征。從圖1a中可以看出，這些硅球粒徑均一(10 nm左右)，呈單分散性。將這些納米硅球采用紅外壓片機(jī)壓成片狀作為制備介孔碳的硬模板。以上述合成的硅球?yàn)槟０搴铣傻慕榭滋嫉耐干潆婄R圖見圖1b，可見合成的

12、介孔碳孔徑均一，排列規(guī)則有序，呈蜂窩狀。結(jié)果與討論第7頁/共18頁 圖2給出了10 nm孔徑介孔碳材料的氮?dú)馕揭幻摳降葴鼐€及相應(yīng)的孔徑分布曲線。從圖2a可以看出，介孔碳材料的吸附等溫線由于毛細(xì)管濃縮現(xiàn)象呈現(xiàn)較大的滯后回路，是典型的介孔結(jié)構(gòu)特征曲線，進(jìn)一步說明制備的介孔碳材料具有典型的介孔結(jié)構(gòu)。從圖2b的孔徑分布曲線可以看出，10 nm孔徑介孔碳的孔徑分布較窄，主要集中在812nm，其比表面積為1060 m2/g，孔體積為3. 467cm3/g，介孔碳材料大的比表面積和孔體積為固載和容納酶分子提供一個(gè)有利的微環(huán)境，與酪氨酸酶三維尺寸(6. 5 nm x 9. 8 nm x 5. 5 nm)相近

13、的孔徑能夠發(fā)揮介孔碳材料的“空間限制效應(yīng)”，防止酶分子去折疊失活，保持酶分子的體外穩(wěn)定性。毛細(xì)管氣相色譜儀的這一部分部件和填充柱色譜儀沒有太大的區(qū)別，只是由于毛細(xì)管氣相色譜要求的載氣流量比填充柱小得多(每分鐘只有幾毫升)，如不用分流進(jìn)樣，則柱前壓較小，流量指示部件的數(shù)值也很低，對(duì)控制和檢測(cè)部件的要求要高，所以早期的毛細(xì)管氣相色譜儀多用分流進(jìn)樣。第8頁/共18頁2.2酪氨酸酶修飾電極電化學(xué)性能的表征 電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器的構(gòu)建過程如圖3所示:介孔碳材料(10 nm)通過液相自組裝將酪氨酸酶誘陷到介孔碳介孔中形成超分子組裝體，然后將其固載到電極表面構(gòu)建酶?jìng)鞲衅鳌＠野彼崦甘且环N銅蛋白，能夠利用分

14、子氧催化苯酚生成相應(yīng)的鄰苯酚和鄰苯醌，而鄰苯醌又可以在電極表面通過電化學(xué)催化還原生成鄰苯酚形成信號(hào)循環(huán)放大。第9頁/共18頁圖4是基于介孔碳材料的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器在除氧磷酸鹽緩沖溶液中循環(huán)伏安圖（掃描速度從10mV/s到100 mV/s）。隨著掃描速度的增加，酪氨酸酶電極的陰極和陽極峰電流同時(shí)增加，同時(shí)其峰峰電位差也隨之增加。從圖4b中可以看出，其陰極和陽極峰電流隨著掃描速度的增加(10100 mV/s)線性增加，說明酪氨酸酶和玻碳電極之間的電子傳輸能夠很容易地在復(fù)合膜修飾電極上實(shí)現(xiàn)，酪氨酸酶和玻碳電極之間的電子傳輸是一個(gè)表面控制的電化學(xué)過程。第10頁/共18頁2.3酪氨酸酶生物傳感器

15、對(duì)苯酚的定量檢測(cè) 圖5給出了不同傳感器檢測(cè)苯酚的電流一時(shí)間響應(yīng)曲線。從圖5可以看出，基于介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器(Tyr-GMC10-Chi/GC)的性能高于基于電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器(Tyr-Chi/GC)。通過對(duì)照可以看出，電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)苯酚時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度小，信號(hào)的噪聲也較小，信號(hào)更穩(wěn)定。由于介孔碳的比表面積很大，活性位點(diǎn)很多，苯酚在電極表面電催化生成的中間過渡態(tài)醒類等沉積在介孔碳表面，導(dǎo)致生物傳感器的電信號(hào)產(chǎn)生較大的噪聲。經(jīng)過21 d的存儲(chǔ)后，基于介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器能保持85%的最初響應(yīng)信號(hào)，說明酪氨酸酶在介孔碳材料“空間限制效應(yīng)”作用下有較好的體外長(zhǎng)

16、期穩(wěn)定性。基于介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器對(duì)苯酚在0. 1-10mol/L范圍內(nèi)線性相關(guān)，檢出限為20 nmol/L(1.88g/L)，靈敏度為1 385 mA/ (cm2mol);而無介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器對(duì)苯酚的檢出限為100 nmol/L，靈敏度為154. 9 mA/ (cm2mol) o第11頁/共18頁結(jié)果顯示基于介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器的靈敏度(8. 9倍);其檢出限(1. 88 g/L 低于中國(guó)國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)(GB 5749-2006中苯酚限量為低于2/L)。由于酪氨酸酶分子對(duì)苯酚的專一性生物催化作用，電化學(xué)

17、酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)苯酚具有良好的選擇性。這說明本生物傳感器可以作為快速檢測(cè)水體中苯酚的有用工具，可實(shí)現(xiàn)苯酚的高靈敏檢測(cè)。第12頁/共18頁本研究采用新型的介孔碳材料作為固載酪氨酸酶的檢測(cè)平臺(tái)構(gòu)建生物傳感器，應(yīng)用于水體環(huán)境中苯酚污染物的檢測(cè)，并通過HPLC方法對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。介孔碳材料的“空間限制效應(yīng)”提高了介孔中酪氨酸酶分子的電子傳輸效率、酶活性以及穩(wěn)定性，構(gòu)建的酪氨酸酶?jìng)鞲衅髟诒椒訖z測(cè)方面顯示了更高的信噪比、更低的檢出限。應(yīng)用HPLC評(píng)價(jià)的結(jié)果表明，盡管基于介孔碳材料的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果還不夠十分準(zhǔn)確，但仍可作為苯酚污染物突發(fā)污染事件的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急檢測(cè)的初步篩查工具。結(jié)

18、論第13頁/共18頁應(yīng)用基于介孔碳的電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器對(duì)5個(gè)水樣品中的苯酚進(jìn)行檢測(cè)，并采用HPLC方法對(duì)其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證?；诮榭滋嫉碾娀瘜W(xué)酪氨酸酶生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果為2個(gè)樣品未檢出苯酚，另外3個(gè)樣品中苯酚的質(zhì)量濃度分別為0.7、0.42、0.23 mg/L。HPLC的檢測(cè)結(jié)果也是有2個(gè)樣品未檢出苯酚，另外3個(gè)樣品中苯酚的質(zhì)量濃度分別是0.62、0.53、0. 19 mg/L?？梢娫撋飩鞲衅髋cHPLC的檢測(cè)結(jié)果基本一致。采用準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)公式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果分別為-13. 0% , 20. 8%和-21.1%。兩種方法結(jié)果對(duì)比表明，基于介孔碳的電化學(xué)生物傳感器

19、方法檢測(cè)苯酚濃度與HPLC方法基本一致，表明該生物傳感器方法相對(duì)準(zhǔn)確和可靠，可以作為苯酚污染物的突發(fā)污染事件的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急檢測(cè)的備選方法。HPLC對(duì)生物傳感器檢測(cè)準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià)第14頁/共18頁 其對(duì)苯酚的檢測(cè)原理是:電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器能夠利用分子氧催化苯酚生成鄰苯酚和鄰苯醌，而鄰苯醌又可以在電極表面通過電化學(xué)催化還原生成鄰苯酚形成信號(hào)循環(huán)放大。有序介孔碳具有可控的孔結(jié)構(gòu)和孔徑大小。大的比表面積和孔體積、良好的導(dǎo)電性、好的電化學(xué)穩(wěn)定性，可以作為酪氨酸酶的理想固定基底。 本研究將酪氨酸酶分子誘陷到合適孔徑大小的介孔碳材料中，并由此構(gòu)建了基于介孔碳材料的酪氨酸酶生物傳感器。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)介孔碳直

20、徑與酶分子大小相匹配時(shí)，利用介孔碳的空間限制效應(yīng)，可防止酶分子的去折疊失活，提高酶的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和生物活性;同時(shí)酪氨酸酶分子與導(dǎo)電基底之間由于距離較近而減少了長(zhǎng)程電子傳輸，利于電化學(xué)能轉(zhuǎn)化。介孔碳多孔的網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)還可以為酪氨酸酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物提供通暢的通道，提高傳感器的響應(yīng)速度和靈敏度。此外，介孔碳材料優(yōu)良的電化學(xué)換能能力和高的酶載量能夠滿足環(huán)境中酚類檢測(cè)對(duì)酪氨酸酶生物傳感器在靈敏度和檢出限等方面的要求，達(dá)到快速檢測(cè)環(huán)境樣品中苯酚污染物的要求。本研究采用高準(zhǔn)確度的（HPLC）對(duì)電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。第15頁/共18頁 其對(duì)苯酚的檢測(cè)原理是:電化學(xué)酪氨酸酶生物傳感器能夠利用分子氧催化苯酚生成鄰苯酚和鄰苯醌，而鄰苯醌又可以在電極表面通過電化學(xué)催化還原生成鄰苯酚形成信號(hào)循環(huán)放大。有序介孔碳具有可控的孔結(jié)構(gòu)和孔徑大小。大的比表面積和孔體積、良好的導(dǎo)電性、好的電化學(xué)穩(wěn)定性，可以作為酪氨酸酶的理想固定基底。 本研究將酪氨酸酶分子誘陷到合適孔徑大小的介孔碳材料中，并由此構(gòu)建了基于介孔碳材料的酪氨酸酶生物傳感器。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)介孔碳直徑與酶分子大小相匹配時(shí)，利用介孔碳的空間限制效應(yīng)，可防止酶分子的去折疊失活，提高酶的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和生物活性;同時(shí)酪氨酸酶分子與導(dǎo)電基底之間由于距離較