1、細(xì)菌霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)1簡(jiǎn)述細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢測(cè)非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方法。也是評(píng)價(jià)生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)除另有外均采用平板菌落計(jì)數(shù)法，這是活菌計(jì)數(shù)的方法之一，也是目前國(guó)際上常用的一種方法。以瓊脂平板上的細(xì)菌、霉菌和酵母菌形成的一個(gè)獨(dú)立可見(jiàn)的菌落為計(jì)數(shù)依據(jù)。該法測(cè)定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下所生長(zhǎng)的細(xì)菌(嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)，不包括對(duì)營(yíng)養(yǎng)、氧氣、溫度、pH和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。一個(gè)細(xì)菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成。

2、因此供試品中所測(cè)得的菌落數(shù)，實(shí)際為菌落形成單位數(shù)(colonyformingunity,cfu)不應(yīng)理解為細(xì)菌、霉菌和酵母菌的個(gè)數(shù)。在進(jìn)行本法測(cè)定時(shí)，必須嚴(yán)格按本法所規(guī)定的條件操作，以免產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差。2設(shè)備、儀器2.1 設(shè)備2.1.1 無(wú)菌室微生物限度檢查應(yīng)有單獨(dú)的無(wú)菌室，每個(gè)無(wú)菌室應(yīng)有獨(dú)立的凈化空氣系統(tǒng)。2.1.1.1 結(jié)構(gòu)和要求見(jiàn)無(wú)菌檢查法2.1.1.2 操作間操作間應(yīng)安裝空氣除菌過(guò)濾層流裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級(jí),局部潔凈度為100級(jí)（或放置同等級(jí)凈化工作臺(tái)）（操作間的凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)保持對(duì)環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。操作臺(tái)上備有電子天平，乙醇燈，火柴，乙醇棉球，大、

3、小橡皮乳頭等。1.1.1.3 緩沖間緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆，無(wú)菌衣、帽、口罩、拖鞋等。緩沖間內(nèi)不得放置培養(yǎng)箱和其他雜物。1.1.1.4 潔凈級(jí)別及檢查方法通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)測(cè)定法（參照醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。潔凈級(jí)別塵粒數(shù)/m3浮游菌（個(gè)）沉降菌（個(gè)）/微粒直徑>0,5（1m微粒直徑>5/m3(990mm0.5h)100級(jí)10000級(jí)100000級(jí)<3,500<350,000<3,500,000<0<2000<20,000<5<100<500<1&l

4、t;3<10沉降菌數(shù)測(cè)定（n法）無(wú)菌室操作臺(tái)消毒擦拭后，先啟動(dòng)層流凈化裝置30min,將備妥的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板3個(gè)（經(jīng)3035c預(yù)培養(yǎng)48h,證明無(wú)菌落生長(zhǎng)），以無(wú)菌方式（或經(jīng)傳遞箱）移入操作間，置凈化臺(tái)左、中、右各1個(gè)，開(kāi)蓋，暴露30min后將蓋蓋上，在3035c培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48h,取出檢查。3個(gè)平板生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)不超過(guò)1個(gè)。有條件的單位、同時(shí)應(yīng)檢查無(wú)菌操作架和凈化工作臺(tái)上的浮游菌和塵粒數(shù)，分別應(yīng)達(dá)到10000級(jí)和100級(jí)。如菌落數(shù)或塵粒數(shù)超標(biāo)，應(yīng)清洗過(guò)濾系統(tǒng)中的過(guò)濾器，必要時(shí)予以更換。1.1.1.5 在每次操作前、后，用0.1%苯扎澳鏤溶液或其他消毒液擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角。然

5、后啟動(dòng)層流凈化裝置，同時(shí)用紫外殺菌燈照射30min。2.1.2 陽(yáng)性菌試驗(yàn)應(yīng)另設(shè)單獨(dú)的凈化工作臺(tái)，不得在供試品檢驗(yàn)用的無(wú)菌室內(nèi)或奸猾工作臺(tái)上操作。2.1.3 無(wú)菌室與洗刷、滅菌消毒、培養(yǎng)、結(jié)果觀察及辦公間等配套設(shè)施應(yīng)相對(duì)集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2儀器2.2.1 恒溫培養(yǎng)箱（3035C）、生化培養(yǎng)箱（2025C）、微波爐、勻漿儀（30008000r/min）或康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱（250300C）、電冰箱、離心機(jī)、離心管、0.45小屣膜及薄膜過(guò)濾器、蒸汽滅菌器（使用時(shí)要進(jìn)行生物指示劑滅菌效果檢查并應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門(mén)檢定）。菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡（1500x）、電子天平或天平

6、（感量0.1g）,pH系列比色計(jì)。2.2.2 玻璃器皿錐形瓶（250300ml,內(nèi)裝玻璃珠若干；500ml,1000ml）、培養(yǎng)皿（直徑9cml、量筒（100ml,500ml）、試管（18mme180mm28mm（198mm及塞、吸管（1ml分度0.01,10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml等）、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）、不銹鋼桶（帶蓋）。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒不掛水滴，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入與約2cm適宜疏松的棉花，置吸管筒內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加硅膠塞或棉塞，若振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振

7、蕩時(shí)供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于高壓蒸汽121c滅菌30min,烘干或160c干熱滅菌2h,備用。2.2.3 用具大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%-75濃醇溶液浸泡）。無(wú)菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可用一次性無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。接種環(huán)（白鉞金或銀銘合金，環(huán)徑45mm長(zhǎng)度610cnrh乙醇燈、乙醇棉球或碘狀棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鐐子、滅菌鋼錐、滅菌稱(chēng)樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤(pán)、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。3試液、稀釋劑和試劑3.1 試液3.1.1 0.1%苯扎澳鏤溶液或其它適

8、宜消毒液（供洗手、擦拭操作臺(tái)面用）。3.1.2 5%石炭酸溶液或其他適宜消毒液（配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒菌吸管用）。3.1.3 75%乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2 稀釋劑和試劑稀釋劑配制后，高壓蒸汽滅菌法滅菌。3.2.1 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液附錄3.1。3.2.2 pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白月東緩沖液附錄3.2。3.2.3 無(wú)菌聚山梨酯80氯化鈉溶液附錄3.4。3.2.4 pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液。3.2.5 pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液按藥典附錄XVD配制后，過(guò)濾，分裝，滅菌。3.2.6 0.1%無(wú)菌氯化三苯四氮嚏溶液（TTQ附錄2.15。3.2.7 pH7.2無(wú)菌磷酸

9、鹽緩沖液附錄3.5。4培養(yǎng)基4.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄5.2。4.2 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基附錄5.3。4.3 酵母浸出粉月東葡萄糖（YPD瓊脂培養(yǎng)基附錄5.4。培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)：4.3.1 采用干燥培養(yǎng)基，按說(shuō)明配制，應(yīng)對(duì)滅菌后的培養(yǎng)基pH值進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測(cè)定，以確定配制時(shí)瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)純以上。4.3.2 配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀。如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過(guò)濾，滅菌后使用。4.3.3 培養(yǎng)基的分裝量不得超過(guò)容器的2/3,以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。4.3.4 培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。4.3.5 滅

10、菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225C,防止被污染，可在三周內(nèi)用畢；保存于密閉容器中，可在一年內(nèi)使用。制備好的培養(yǎng)基放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免水分散失及染菌。4.3.6 用水浴或微波爐加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基，勿用電爐直接溶化瓊脂培養(yǎng)基，以免營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)度受熱而破壞。已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，剩余培養(yǎng)基不宜再用。培養(yǎng)基不能反復(fù)加熱溶化。5供試品抽樣、保存及檢驗(yàn)量5.1 抽樣5.1.1 一般采用隨機(jī)抽樣方法，其抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的35倍量（以備復(fù)試或留樣觀察）。5.1.2 抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異常或可疑的樣品，應(yīng)選取有疑問(wèn)的樣品。機(jī)械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。5.1.3 凡藥品、瓶口（外蓋

11、內(nèi)側(cè)及瓶口周?chē)┩庥^長(zhǎng)螭、發(fā)霉、蟲(chóng)蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無(wú)需再抽樣檢驗(yàn)。5.2 保存5.2.1 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)的污染菌因保存條件不妥導(dǎo)致死亡，損傷或繁殖。5.2.2 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開(kāi)啟。包裝已開(kāi)啟的樣品不得作為供試品。5.3 檢驗(yàn)量5.3.1 所有劑型的檢驗(yàn)量均需取自2個(gè)以上包裝單位（中藥蜜丸需取自4丸，膜劑取4片以上）。5.3.2 固體及半固體（黏稠性供試品）制劑檢驗(yàn)量為10g。5.3.3 液體制劑的檢驗(yàn)量為10ml。5.3.4 膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗(yàn)量為2cm2（中藥膜劑較厚，不宜取量過(guò)多），

12、化學(xué)藥及生化藥膜劑檢驗(yàn)量為50cmi5.3.5 特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗(yàn)量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3g,液體制劑采用原液者不得少于6ml,采用供試液者不得少于3ml,外用藥品不得少于5g。5.3.6 要求檢查沙門(mén)菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加10g或10ml。6試驗(yàn)準(zhǔn)備6.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀釋劑等經(jīng)傳遞窗移至無(wú)菌室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先做好計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入無(wú)菌間。編號(hào)后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。6.2 開(kāi)啟無(wú)菌室紫外殺菌燈和空氣過(guò)濾裝置，并使其工作不低于30min。6.3 關(guān)閉紫外

13、殺菌燈后，操作人員用肥皂洗手，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.1%苯扎澳鏤溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。6.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開(kāi)口處周?chē)?，待干后用滅菌的手術(shù)鐐或剪將供試品啟封。7供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。如使用了乳化劑、分散劑、中和劑和滅活劑，其用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)微生物的生長(zhǎng)和存活無(wú)影響性。供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過(guò)45C,30min。除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法如下：7.1 液體供試品取供試品10ml,加pH7.0無(wú)菌氯化鈉

14、-蛋白月東緩沖液至100ml,混勻，作為供試液。油劑可先加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加0.9%無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液至100ml?？扇苄砸后w制劑可用混合的供試品原液作為供試液。7.2 固體、半固體或黏稠液供試品取供試品10g,加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液至100ml,用勻漿儀(30005000r/min、24min)或其他有效的方法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80,并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。蜜丸等需剪碎，放入勻漿杯。7.3 非水溶性供試品7.3.1 軟膏、乳膏劑先將已備妥的含司盤(pán)805g、單硬脂酸甘油脂3g、聚山梨脂8010g的混

15、合物融化，待冷至45c時(shí)，加入供試品5g(或5ml),立即用玻棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45c白ppH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液至80ml,邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20供試液。7.3.2 油劑取供試品10ml,加入無(wú)菌聚山梨酯8058ml,搖勻，再加入pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液至100ml。7.3.3 栓劑稱(chēng)取供試品10g,置滅菌錐形并K中，加適量pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液，置45c水浴保溫10min,使溶，加入無(wú)菌聚山梨酯8058ml,振搖使之乳化，再加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液（稀釋劑和聚山梨酯80總量為100ml）,搖勻。7.3.4 眼

16、膏劑取供試品10g,加至含20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯（制法選用孔徑為0.22wm的脂溶性濾膜，以薄膜過(guò)濾法過(guò)濾除菌。濾器在140c干熱滅菌2小時(shí)，或用集菌儀除菌和無(wú)菌玻璃珠的適宜容器中，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45c的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液至100ml,振搖510min,萃取，待油水明顯分層，取其水層作為供試液。7.4 非水溶性膜劑供試品化學(xué)藥膜劑一般取樣為100cm，置滅菌錐形瓶中，加入適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液，于45C土1C水浴中保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。中藥膜劑取50擊，剪碎，加適量的pH7.0無(wú)菌

17、氯化鈉-蛋白月東緩沖液（通常1cm2加1ml或2ml）,浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。7.5 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g,腸溶制劑加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml,結(jié)腸溶制劑加pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml,均置45c水浴中，振搖，使溶解，作為供試液。7.6 氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室內(nèi)約1h。取出，速消毒供試品容器的開(kāi)啟部位周?chē)脽o(wú)菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無(wú)菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)

18、于10g或10ml的供試品，再稀釋成1:10的供試液。7.7 茶劑取供試品10g,置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml,振搖23分鐘，以滅菌紗布過(guò)濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱(chēng)樣結(jié)果按1:10加稀釋劑，浸泡30分鐘）。以上供試品如吸水膨脹，或黏度過(guò)高，可增加稀釋劑的量，制成1:201:100供試液。7.8 具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法如下：7.8.1 稀釋法取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。用平板法測(cè)定菌數(shù)時(shí)，1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。培

19、養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。7.8.2 離心沉淀集菌法取規(guī)定量的供試液，3000r/min,離心20min,棄去上清液，留底部集菌液約2ml,加稀釋劑至原規(guī)定量。如供試液中有不溶性顆粒、沉淀，先以500r/min,離心5min,留離心沉淀物，取全部上清液按上述高速再離心，留底部集菌液約2ml,加稀釋劑至原規(guī)定量。7.8.3 薄膜過(guò)濾法見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)10.2。7.8.4 中和法凡含汞、碎或防腐劑等的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化、中和其抑菌活性，制成供試液。8供試液的稀釋?zhuān)?0倍遞增稀釋法）8.1 取34支滅菌試管，分別加入9mlPH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白月東緩沖液。加稀釋劑后，試管

20、塞應(yīng)立即塞上。8.2 另取1支1ml滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml,加入裝有9mlPH7.0無(wú)菌氯化蛋白月東緩沖液的試管中，（此時(shí)操作一般為：左手執(zhí)試管并將塞打開(kāi)，傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量。切勿在乙醇燈焰峰的正上方操作，以免燈焰將供試液中的菌細(xì)胞殺滅）混勻，即1:100供試液。以此類(lèi)推，根據(jù)供13t品污染程度，可稀釋至1:103、1:104等適宜稀級(jí)（34）。每遞增1稀釋級(jí)，必須另一支吸管。在彳10倍遞增稀釋時(shí)，吸管插入第1級(jí)稱(chēng)液內(nèi)不低于液面2.5cm,反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁，調(diào)整液量至刻度，吸管移至第2級(jí)稀釋管的內(nèi)壁近液面處

21、（勿接觸液面），緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無(wú)粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。9計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證由于某些供試品具有抗菌活性，在建立測(cè)定方法或原測(cè)定法的檢驗(yàn)條件改變時(shí)，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對(duì)供試品的抑菌活性及測(cè)定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。9.1 驗(yàn)證用菌株大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC(B)44102,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC(B)26003枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)CMCC(B)63501,白色念

22、珠菌(Candidaalbicans)CMCC(F)98001黑曲霸Aspergillusniger)CMCC(F)98003。9.2 驗(yàn)證方法驗(yàn)證試驗(yàn)分4組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照級(jí)試驗(yàn)的菌回收率9.2.1 試驗(yàn)組取最低稀釋級(jí)的供試液，按每1ml供試液加入50100cfu試驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)菌液、供試液1ml分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基；薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取供試液2ml過(guò)濾，沖洗液沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌。9.2.2 菌液組取上述試驗(yàn)菌液，測(cè)定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。9.2.3 供試品對(duì)照組取最低稀釋級(jí)的供試液

23、1ml,按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其所含菌數(shù)。9.2.4 稀釋劑對(duì)照組為考察供試液制備過(guò)程對(duì)微生物的影響程度，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試液，加入試驗(yàn)菌，使最終菌嘗試為每1ml含50100cfu,按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。9.2.5 試驗(yàn)組的菌回收率試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)試驗(yàn)組的菌回收率(%)=菌液組的平均菌落數(shù)X100%9.2.6 稀釋劑對(duì)照組菌回收率稀釋劑對(duì)照組的菌落數(shù)稀釋劑對(duì)照組菌回收率(100%)菌液組的菌落數(shù)=x100%9.3 結(jié)果判定稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%,則可按該供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的

24、細(xì)菌、霉菌或酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%,應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。9.4 驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。9.5 注意事項(xiàng)9.5.1 所用標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。以冷凍干燥的原始菌種開(kāi)啟后轉(zhuǎn)培養(yǎng)，其培養(yǎng)物為第一代。9.5.2 黑曲霉菌的菌液制備將黑曲霉菌的抱子接種至真菌瓊脂培養(yǎng)基上，于2025c培養(yǎng)57天，使大量的抱子產(chǎn)生。加入35ml的0.9%無(wú)菌氯化鈉無(wú)源之水主，用無(wú)菌玻棒或接種環(huán)輕輕將抱子洗脫。然后，用一支10ml無(wú)菌球形毛細(xì)吸管，其管口用無(wú)菌棉花或紗布包扎且能過(guò)濾菌絲的裝置，吸出抱子菌液至無(wú)菌試管內(nèi)，用比濁法，

25、將菌液稀釋至每毫升含10100cfu。9.5.3 做試驗(yàn)菌的回收率試驗(yàn)時(shí)，加入菌量以50100cfu為宜。加菌量過(guò)多，如薄膜法，菌落擁擠，則不好計(jì)數(shù)；加菌量過(guò)少，如小于30個(gè)，則誤差大。10檢查法10.1 平皿法10.1.1 在上述進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸取該稀釋級(jí)供試液各1ml至每個(gè)起先以90mm勺滅菌平皿中，或從高稀釋級(jí)至低稀釋級(jí)吸液時(shí)可用1支吸管吸供試液各1ml至每個(gè)滅菌平皿中。每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注23個(gè)平皿（一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開(kāi)，右手執(zhí)吸管），注皿時(shí)，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無(wú)殘留液體，防止反流到吸管尖端部。一般取適宜的連續(xù)23個(gè)稀釋級(jí)的供

26、試液進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定。10.1.2 陰性對(duì)照待各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管吸取稀釋劑（PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白月東緩沖液）各1ml,分別注入4個(gè)平皿中，其中2個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照；另2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對(duì)照，如另有YP兩脂菌數(shù)時(shí)，則再增加2個(gè)增皿作酵母菌數(shù)陰性對(duì)昭八、10.1.3 傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好的細(xì)菌計(jì)數(shù)用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；含蜂蜜、王漿液制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（霉菌）和YPD瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）溶化，冷至約45c時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15ml,以順時(shí)針或逆時(shí)針?lè)较蚩焖傩D(zhuǎn)平皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，置操作平臺(tái)上待

27、凝。在旋轉(zhuǎn)平皿時(shí)勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上。10.1.4 培養(yǎng)一般細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于3035c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于2025c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。10.1.5 菌數(shù)計(jì)數(shù)一般將平板置落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。切勿計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。注意細(xì)菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的鑒別。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。10.1.5.2 供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)計(jì)在細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定，并

28、須觀察菌落特征及染色形態(tài)。10.1.5.3 供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量很多的有形物，且難與菌落相鑒別。為了有利于菌落計(jì)數(shù)，可在操作時(shí)將適宜稀釋級(jí)的供試液多增加注皿（12個(gè)平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)面放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計(jì)數(shù)菌落時(shí)作為對(duì)照?；蛴?.001%TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后該培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落為紅色，襯于白色背景上易于點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落和區(qū)分基他有形物。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長(zhǎng)的菌落不易辨認(rèn)和點(diǎn)計(jì)，為防止這種情況，也可用0.001%TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿。10.1.5.4 若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上

29、菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長(zhǎng)有鏈狀或片狀、云霧狀菌落，菌落間無(wú)時(shí)顯界線時(shí)，一條鏈、片作為為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈、片上出現(xiàn)性狀與鏈（片）狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長(zhǎng)蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落，其外緣有若干性狀相似的單個(gè)菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。10.1.5.5 若各稀釋級(jí)2個(gè)平板菌落的平均數(shù)在15以上，同釋釋級(jí)二平板菌落數(shù)相差1倍時(shí)，該稀釋級(jí)菌落數(shù)不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)；當(dāng)2個(gè)平板菌落均數(shù)在15（含15）以下時(shí)，兩個(gè)平板菌落數(shù)的差值允許范圍為04,17,29,310,412,514,615,717,818,919,1020。超出以上范圍即視為操作誤差

30、，不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)。10.1.5.6 菌落生長(zhǎng)呈蔓延趨勢(shì)者，細(xì)菌，霉菌需逐日作初步點(diǎn)計(jì)，在點(diǎn)計(jì)霉菌菌落時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)平板，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)，否則使早期形成的抱子散落在平板的基他部位，又萌生新的霉菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差。10.1.5.7 在48小點(diǎn)計(jì)細(xì)菌，72小時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，如菌落極小，不易辨計(jì)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間57天，再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。10.1.5.8 對(duì)有疑議的供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可培養(yǎng)至1周再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。10.1.5.9 含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)霉菌數(shù)，YYD®脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)酵母菌落。兩者計(jì)數(shù)值合并報(bào)告。10.1.5.10 在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)有霉

31、菌和酵母菌其數(shù)量多于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌，或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)多于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)，以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)報(bào)告結(jié)果。10.1.6菌數(shù)報(bào)告規(guī)則宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)在30300之間、霉菌平行菌落數(shù)在30300之間的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。10.1.6.1 當(dāng)公有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)（見(jiàn)附表例10.1.6.1）。10.1.6.2 當(dāng)有2個(gè)相鄰稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，視兩者比值高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)比值=低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)而定。若比等于2,以?xún)上♂尲?jí)的菌落婁乘以稀釋倍

32、數(shù)的均值報(bào)告菌數(shù)；若比值大于2但不超過(guò)5時(shí)，以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)（見(jiàn)附表例10.1.6.2,10.1.6.3）;當(dāng)出現(xiàn)比值大于5,甚至高稀釋級(jí)的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級(jí)的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證（見(jiàn)附表例10.1.6.4和10.6.7）。10.1.6.3 當(dāng)各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均小于30,以最低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)（見(jiàn)附表例10.1.6.5）。10.1.6.4 如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以小于10報(bào)告菌數(shù)（見(jiàn)附表例10.6.6）。附表：細(xì)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則舉例

33、各稀釋級(jí)菌落平均數(shù)規(guī)則原液1:101:1021:103比值菌落數(shù)報(bào)告數(shù)10.1.6.5 不可計(jì)16420164001600010.1.6.6 不可計(jì)295461.6377503800010.1.6.7 不可計(jì)271602.22710027000異常2402405<1010.1.6.8 3941410.210.1.6.9 24191210.1.6.10 0.50010.1.6.11 22270*培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定10.2 薄膜過(guò)濾法10.2.1 取濾膜孔徑不大于0.45小直徑不小于50m訶拆卸的濾器。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。使用時(shí)，必須

34、保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。10.2.2 水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液以潤(rùn)濕濾膜。油類(lèi)供試品，具濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml,沖洗液、沖洗量及沖刺方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。每片濾膜的總過(guò)濾量不宜過(guò)大，以避免濾膜上的微生物受損傷。10.2.3 每張濾膜取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液直接過(guò)濾，或加至適量稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品1g或1ml含菌較多，可選適宜稀釋級(jí)的供試液1ml,過(guò)濾。用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白月東緩沖液或其它適宜的沖洗液沖

35、洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉月東葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)。10.2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn)取試驗(yàn)用的稀釋劑1ml同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。10.2.5 培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不多于100個(gè)。如菌落數(shù)超過(guò)100個(gè)，不便計(jì)數(shù)時(shí)，可取高稀釋級(jí)的供試液同法操作，點(diǎn)計(jì)濾膜上的菌落數(shù)。10.2.6 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾1g或1ml供試品），或1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。10.3 培養(yǎng)基稀釋法：取低稀釋級(jí)供試液（原液或1:10供試液）2份，每份各1ml,分別注入5個(gè)或5個(gè)以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml）,每1個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約1