1、1實(shí)驗(yàn)一植物的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 植物組織培養(yǎng)是指植物的任何器官、 組織或細(xì)胞，在人工預(yù)知的控制條件下，放在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等組成的培養(yǎng)基中，使其生長(zhǎng)、分化并形成完整植株的過(guò)程。其理論依據(jù)是植物細(xì)胞具有全能性。2 組織培養(yǎng)的特點(diǎn)是：組織培養(yǎng)的特點(diǎn)是：取材少，培養(yǎng)材料經(jīng)濟(jì)；人為控制培養(yǎng)條件，不受自然條件影響；生長(zhǎng)周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動(dòng)化控制。組織培養(yǎng)不但是進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、生物化學(xué)和藥物學(xué)等學(xué)科研究的重要手段；而且在農(nóng)學(xué)、園藝、林業(yè)和次生代謝產(chǎn)物工程等生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。3 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的主要部分培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的主要部分，除了培養(yǎng)

2、材料本身因素外，培養(yǎng)基的種類和成分等直接影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)和發(fā)育，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的種類和培養(yǎng)部位選擇適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的種類很多，不同的培養(yǎng)基有其不同的特點(diǎn)。4培養(yǎng)基的主要成分：水無(wú)機(jī)成分：無(wú)機(jī)大量元素 氮： 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮混合 磷： 磷酸鹽 鉀： 鉀鹽 鈣、硫、鎂無(wú)機(jī)微量元素 主要有：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、鈷、氯有機(jī)成分： 糖、 維生素、肌醇、氨基酸及有機(jī)附加物。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)： 生長(zhǎng)素類：NAA、IAA、IBA、2,4-D 細(xì)胞分裂素類：BAP, KT，TDz，ZT 其他類： GA3, ABA， PP333瓊脂pH值5 配制培養(yǎng)基最方便的方法是預(yù)先配制不同組分的培養(yǎng)基母液，貯藏在冰箱

3、，待配制培養(yǎng)基時(shí)取出，按比例稀釋。 配制母液時(shí)為了減少工作量可以把幾種藥品配在同一母液中，但是應(yīng)該注意各種化合物的組合以及加入的前后順序，應(yīng)該把鈣離子、錳離子、鋇離子和硫酸根和磷酸根例子錯(cuò)開，以免發(fā)生沉淀。 把每種試劑單獨(dú)溶解后再加入后一種化合物?；旌弦讶芙獾母鞣N礦質(zhì)鹽時(shí)還應(yīng)該注意加樣順序。6 鐵鹽單獨(dú)配制，其配法為5.57g 的硫酸亞鐵（Fe SO4.7H2O）和7.45g乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）溶于1L水中，用時(shí)每配1L培養(yǎng)基，取該溶液5ml。 IAA 、IBA、NAA等可用少量的乙醇溶解，然后在加水定容。2,4-D可用1 N的Na OH 溶解然后再定容； KT和6-BA應(yīng)先定

4、容于少量的1 mol/L 的HCl中，再加水定容。玉米素應(yīng)該溶于95% 的乙醇中再定容。 pH值對(duì)培養(yǎng)基的凝固情況和植物材料的生長(zhǎng)有很大的影響，因此，等培養(yǎng)基配好后，應(yīng)該立即調(diào)整培養(yǎng)基的pH ,最好用酸度計(jì)，既快又準(zhǔn)。培養(yǎng)基配好后應(yīng)該立即分裝，體積一般為容器的 1/4 或者1/3為好。 7器材和藥品器材和藥品 高壓蒸汽滅菌鍋、潔凈工作臺(tái)、循環(huán)水式真高壓蒸汽滅菌鍋、潔凈工作臺(tái)、循環(huán)水式真空泵、電子天平、酸度測(cè)定儀、光照培養(yǎng)箱空泵、電子天平、酸度測(cè)定儀、光照培養(yǎng)箱,搪搪瓷杯、搪瓷盤、瓷杯、搪瓷盤、100 ml三角燒瓶（三角燒瓶（12個(gè)個(gè)/組）、組）、250 ml三角瓶（三角瓶（2個(gè)個(gè)/組）、試劑瓶

5、、解剖刀柄與組）、試劑瓶、解剖刀柄與刀片、單面刀片、剪刀、長(zhǎng)鑷子、培養(yǎng)皿、移刀片、單面刀片、剪刀、長(zhǎng)鑷子、培養(yǎng)皿、移液管、漏斗、量筒、燒杯（液管、漏斗、量筒、燒杯（50、100、500、1000 m1），酒精燈、火柴、玻璃棒、吸耳球、），酒精燈、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、牛皮紙、線繩、牛皮筋、脫脂棉、封口薄膜、牛皮紙、線繩、牛皮筋、脫脂棉、濾紙、濾紙、pH試紙（試紙（5.4-7.0）、標(biāo)簽紙、稱量紙、）、標(biāo)簽紙、稱量紙、藥勺等。藥勺等。8 次氯酸鈉消毒液次氯酸鈉消毒液, 75%的酒精的酒精 ,0.2的升汞溶液的升汞溶液. 1 N 鹽酸鹽酸,1 N NaOH,0.8%的瓊脂的瓊脂,3%的蔗

6、糖的蔗糖. 0.1 mg/ml的的2,4-D溶液溶液：取25 mg的 2,4-D，加入少量95%的酒精和1 N的NaOH溶解，再加蒸餾水定容至250 ml。 0.1 mg/ml 的的6-BA溶液溶液：取25 mg的6-BA，用少量1 N的鹽酸溶解，再加蒸餾水定容至250 ml。9表.1 MS培養(yǎng)基儲(chǔ)備液的配制培養(yǎng)基儲(chǔ)備液的配制10實(shí)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟P培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制11母液配制：母液配制： 按照表 1分別配制，并在4 冰箱中保存。22. 植物激素配制植物激素配制：稱取10 mg NAA,加入少量酒精，并加水定容50 ml (濃度為0.2 mg/ml), 用同樣的方法配制2，4-D母液。

7、 稱取 50 mg 6-BA, 加少量的1 mol/L HCl，使其充分溶解，然后加水至50 ml (濃度為1 mg/ml) 。4 113MS基本培養(yǎng)基的配制基本培養(yǎng)基的配制：分別吸取MS貯備液30.0 ml（大量元素）、3.0 ml微量元素、 3.0 ml鐵鹽、 3.0 ml有機(jī), 加入1 L的搪瓷缸中，然后稱取蔗糖18.0g, 加入瓊脂4.8g，加蒸餾水約550 ml，在電爐上加熱，煮沸，融化瓊脂，然后加水至560ml。4. 不同激素濃度培養(yǎng)基的配制不同激素濃度培養(yǎng)基的配制：取200ml燒杯3個(gè)，分別吸取所需要的2,4-D溶液(0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L 所需要的體積為：1

8、.0，2.0, 4.0ml)，然后加入MS基本培養(yǎng)190ml，攪拌均勻后，用10%的NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8。 加水定容至200ml。5. 將配制好的培養(yǎng)基分裝于50ml三角瓶中，蓋上封口膜，并用牛皮紙包扎。 12操培養(yǎng)基滅菌11. 打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水。22.加水后，將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，不要放的太多，以免影響滅菌效果。物品不要近靠鍋壁，以免冷凝水順壁流入物品中。33. 加蓋旋緊螺旋。44. 打開放汽閥，加熱，自開始產(chǎn)生蒸汽后5分鐘，再關(guān)緊放汽閥，此時(shí)鍋內(nèi)的冷空氣已由排氣孔排盡，讓溫度隨蒸汽壓力的增高而上升。5 135. 待壓力逐漸上升到所需壓力時(shí)（待壓力逐漸上升到所需壓力時(shí)（一般為一

9、般為15磅磅/時(shí)，時(shí)， 1.03410 5Pa）, 滅菌滅菌20分鐘。分鐘。6 滅菌后，滅菌后，待壓力降至待壓力降至0時(shí)，時(shí)，開蓋，取出滅菌物品。開蓋，取出滅菌物品。（在壓力未完全下降前，切勿打開鍋蓋）。（在壓力未完全下降前，切勿打開鍋蓋）。14胡蘿卜組織培養(yǎng)胡蘿卜組織培養(yǎng)1. 取兩個(gè)50ml的小燒杯,分別倒入25ml的70%的酒精和0.2%的升汞。2. 取胡蘿卜貯藏根，洗凈，然后將胡蘿卜根于70酒精中浸泡數(shù)秒鐘。 3. 浸于0.2氯化汞（升汞）液中消毒滅菌10 min后,再用無(wú)菌水沖洗34次。4. 將滅菌材料放在滅菌的濾紙上,吸干水分。5. 用解剖刀將胡蘿卜切去表皮和中柱，取皮層，切成0.5cm見方的小塊，接種于MS附加 2.0mg/L 2，4-D 培養(yǎng)基內(nèi),于 25，黑暗或漫射光下培養(yǎng),1421 天后繼代一次。15水稻成熟胚組織培養(yǎng)水稻成熟胚組織培養(yǎng)1. 取成熟種子，用 70乙醇浸l min，轉(zhuǎn)至l.5次氯酸鈉溶液（ 含有0.01%吐溫20）浸泡l.52 h后，用無(wú)菌水沖洗45次，置無(wú)菌濾紙上吸干多余水分。2. 將成熟胚置于含 2 mgL 2，4D的 MS固體培養(yǎng)基上，27 暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織 10天后（成熟胚）繼代一次。 16注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：配制培養(yǎng)基時(shí)，一定要注意調(diào)節(jié)配制培養(yǎng)基時(shí)，一定要注意調(diào)節(jié)pH。2.外植體不能太小，否