1、蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定(cdng)的方法的方法 1、微量凱氏定氮法2、雙縮脲法（Biuret）3、Folin-酚試劑(shj)法（Lowry）4、紫外吸收法5、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）6、BCA比色法第一頁，共7頁。1、微量凱氏（、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法 原理：含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫原理：含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和酸銨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。的

2、程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)為了加速消化，可以加入為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸?？捎门鹚崛芤?，滴定則用強(qiáng)酸。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求

3、得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。即得。 靈敏度：低。靈敏度：低。0.2 1.0mg氮，誤差為氮，誤差為 2 時(shí)間：費(fèi)時(shí)時(shí)間：費(fèi)時(shí) 810小時(shí)小時(shí) 說明：用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)說明：用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng) 干擾物質(zhì)干擾物質(zhì)(wzh)：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 第二頁，共7頁。2、雙縮脲法（、雙縮脲法（Biuret法）法） 原理：蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽

4、鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中，原理：蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫色絡(luò)合物，此紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成形成紫色絡(luò)合物，此紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量及氨基酸成分正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量及氨基酸成分(chng fn)無關(guān)，故可用來無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定蛋白質(zhì)含量。多肽鍵堿性多肽鍵堿性Cu2紫色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物 靈敏度：低。靈敏度：低。120mg時(shí)間：中速，時(shí)間：中速，2030分鐘分鐘優(yōu)點(diǎn)：較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。優(yōu)點(diǎn)：較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生

5、顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。缺點(diǎn)：靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的缺點(diǎn)：靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。蛋白質(zhì)測(cè)定。干擾物質(zhì)：硫酸銨、干擾物質(zhì)：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等緩沖液和某些氨基酸等說明：用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似說明：用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似 第三頁，共7頁。3、Folin酚試劑酚試劑(shj)法（法（Lowry法）法） 顯色原理：與雙縮脲方法相同，只是加入了第二種試劑，顯色原理：與雙縮脲方法相同，只是加入了第二種試劑，F(xiàn)olin酚，以增加顯色量提高靈酚，以增加顯色量提

6、高靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的含量成正比。藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的含量成正比。干擾物質(zhì)：硫酸銨；干擾物質(zhì)：硫酸銨； Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇緩沖液；甘氨酸；各種硫醇 ；酚類、檸檬酸、糖類、甘油等。濃；酚類、檸檬酸

7、、糖類、甘油等。濃度較低的尿素（度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（），三氯乙酸（0.5%），乙醇），乙醇（5%），乙醚（），乙醚（5%），丙酮（），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須）等溶液對(duì)顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度氫氧化鈉溶液的濃度12倍。倍。靈敏度：

8、高，靈敏度：高， 5mg 。20250mg。時(shí)間：慢速，時(shí)間：慢速，4060分鐘分鐘優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。干擾物質(zhì)較多。說明：顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。加說明：顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。加Folin酚試酚試劑時(shí)要特別小心，該試劑僅在酸性劑時(shí)要特別小心，該試劑僅在酸性(sun xn)pH條件下穩(wěn)定，但上述

9、還原反應(yīng)只在條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)?shù)那闆r下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅一酚試劑加到堿性的銅蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。第四頁，共7頁。4、紫外吸收、紫外吸收(xshu)法法原理：由于蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收原理：由于蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成

10、正比，可用作定量測(cè)定處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用作定量測(cè)定(cdng)。靈敏度：較高，靈敏度：較高，50100mg時(shí)間：時(shí)間：510分鐘分鐘干擾物質(zhì)：各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸干擾物質(zhì)：各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定(cdng)。特別適用于柱。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，利用層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，利用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況是進(jìn)行紫外檢測(cè)，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況是最常用的方法。最常用的方法。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲

11、線法測(cè)定缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定(cdng)蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定(cdng)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定過校正，

12、測(cè)定(cdng)的結(jié)果還是存在一定的誤差。的結(jié)果還是存在一定的誤差。說明：用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可以校正說明：用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可以校正 。由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因。由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改的改變而有變化，因此要注意溶液的變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定值，測(cè)定(cdng)樣品時(shí)的樣品時(shí)的pH要與測(cè)定要與測(cè)定(cdng)標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線的線的pH相一致。相一致。 第五頁，共7頁。5、考馬斯亮蘭法（、考馬斯亮蘭法（Bradford法）法） 原理：原理：1976年由年由Bradford根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)(shj)。

13、考馬斯亮蘭?？捡R斯亮蘭G-250染料，染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰由在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰由465nm變?yōu)樽優(yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸變?yōu)樗{(lán)色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。殘基相結(jié)合。在在595nm下測(cè)定的吸光度值下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595與蛋白質(zhì)濃度成正比。與蛋白質(zhì)濃度成正比。靈敏度：最高。靈敏度：最高。15mg 時(shí)間：時(shí)間：515分鐘分鐘干擾物質(zhì)：強(qiáng)堿性緩沖液；干擾物質(zhì)：強(qiáng)堿性緩

14、沖液；TritonX-100; SDS；去污劑。；去污劑。優(yōu)點(diǎn)：（優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高。（）靈敏度高。（2）快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。（）快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。（3）干擾物質(zhì)少。）干擾物質(zhì)少。缺點(diǎn)：（缺點(diǎn)：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)以減少這方面的偏差。球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定。）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)的濃度。 說明：最好的方法；說明：最好的方法； 干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 第六頁，共7頁。6、BCA比色法比色法 原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將Cu2+還愿為還愿為Cu+再與再與BCA試劑（試劑（4，4 -二羧酸二羧酸-2，2 -二喹啉鈉）生成紫色復(fù)合物，于二喹啉鈉）生成