1、“實(shí)用生物信息技術(shù)”課程小組集體練習(xí)、討論、交流總結(jié)報告班MS2組C01次11討論時間：2016年11月30日討論地點(diǎn)：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院教學(xué)樓八教參加人員：王琪周燕于海燕寇俊鳳討論主題：通過PrimerPremier5軟件設(shè)計引物討論內(nèi)容：利用PrimerPremier5設(shè)計引物，加深對設(shè)計引物原則理解。提取棉花葉總RNA然后用試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用cDNA作為模板擴(kuò)增基因的CDS區(qū),然后想要轉(zhuǎn)染進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞中。比如TPS27基因，首先在NCBI找到它的mRNA序列，然后找到它的CDS序列，全部復(fù)制下來，在primer5.0中設(shè)計引物，第一次自己操作可以多篩選幾對引物，盡量避免錯配，二聚體，

2、產(chǎn)生錯的產(chǎn)物即可。最后在引物的5端添加酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基。具體操作打開PrimerPremier5File予NewDNASequence選項(xiàng)ASis-OK點(diǎn)擊primer按鈕，彈出菜單后點(diǎn)擊search按鈕選才iPCRprimer,Pairs參數(shù)，并選擇所需PCR產(chǎn)物長度，OK會彈出搜索結(jié)果菜單，點(diǎn)擊OKS-ekirlKiProgPnim-erarchRevljIts;ItadPqhh|回|Till|ElCiC-Ki|eJ”*，4IT3.EndMlHBlDhtyElolEEUll1r-AGCTT3KpnTTypTT口tiay5,3IMccITyp-e11res-tirietidTieriaE

3、ymCACAT3.BTypeIres-trictioriienzyCATATG3hEhITypu11r&s-trictiion口5MNotTTypeTTres-tKictior*emzym&5GCGGCCGCBGjhEType11宇3VHH11riiftricAia”西門EyrriH5,GTGOAG寸hi1Type11res-trictiEirie-n:=yme與JG匚ATQ九七才Xb日ITypeLIres-triction&nzyma*TACTAGA31XhlVyjse|FW隼/tiriGiicaFi寫匚n丁UGdH才引物參數(shù) 物長度：特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫

4、度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18到24個堿基的寡核甘酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘?。引物越長，擴(kuò)增退火時被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54c的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性?？偟膩碚f，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個核甘酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長度為18個核甘酸。引物設(shè)計時使合成的寡核甘酸鏈（1824聚物）適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。 引物的二級結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3末端形成的二聚體，應(yīng)控制其AG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3端或近3端對引物-