1、cell electrophysiology & patch clamp techniques小林小林/forry 祝他科研學(xué)習(xí)順利祝他科研學(xué)習(xí)順利 1991 Nobel基金會的頒獎評語： 膜片鉗技術(shù)點燃了細胞和分子程度的生理學(xué)研討的革命之火，為細胞生理學(xué)的研討帶來了一場革命性的變化，它和基因克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)，給生命科學(xué)研討帶來了宏大的前進動力。2、膜片鉗技術(shù)及其運用、膜片鉗技術(shù)及其運用 3、離子通道藥理學(xué)、離子通道藥理學(xué)1、細胞電生理學(xué)、細胞電生理學(xué)OUTLINE 細胞電生理學(xué)細胞電生理學(xué) E l e c t r o p h y s i o l o g y細胞生理學(xué)：提示細胞的生理過

2、程，用電生細胞生理學(xué)：提示細胞的生理過程，用電生理方法記錄生物電活動理方法記錄生物電活動丈量丈量離子、離子通道離子、離子通道細胞興奮細胞興奮生物電信號生物電信號細胞生理學(xué)細胞生理學(xué)膜的膜的“流動鑲嵌模型流動鑲嵌模型細胞膜和離子學(xué)說建立細胞膜和離子學(xué)說建立Hodgkin，et al . 1946年年 磷脂雙層的磷脂雙層的屏蔽作用屏蔽作用Na-K 泵泵K+o Na+i離子通道 (ion channels) 離子通道是細胞膜上的一種特殊整合蛋白，對某離子通道是細胞膜上的一種特殊整合蛋白，對某些離子些離子K+K+、Na+Na+、Ca2+Ca2+等能選擇通透，其功能是等能選擇通透，其功能是細胞生物電活動

3、的根底。細胞生物電活動的根底。 特性：通透性特性：通透性permeationpermeation 選擇性選擇性selectivityselectivity 門控性門控性gatinggating 研討技術(shù)：研討技術(shù)： 膜片鉗技術(shù)和分子克隆技術(shù)膜片鉗技術(shù)和分子克隆技術(shù) 配體門控通道配體門控通道 陽離子通道：乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體陽離子通道：乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體 陰離子通道：甘氨酸和陰離子通道：甘氨酸和氨基丁酸受體氨基丁酸受體 乙酰膽堿受體乙酰膽堿受體 電壓門控通道：鉀、鈉、鈣離子通道電壓門控通道：鉀、鈉、鈣離子通道電壓門控鉀離子通道電壓門控鉀離子通道 環(huán)核苷酸門控通道環(huán)核苷酸門控

4、通道 氣味分子與氣味分子與G蛋白偶聯(lián)型受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化蛋白偶聯(lián)型受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生酶，產(chǎn)生cAMP，開啟，開啟cAMP門控陽離子通道門控陽離子通道cAMP-gated cation channel，引起鈉離子內(nèi)流，膜去極化，產(chǎn)，引起鈉離子內(nèi)流，膜去極化，產(chǎn)生神經(jīng)激動，最終構(gòu)成嗅覺或味覺。生神經(jīng)激動，最終構(gòu)成嗅覺或味覺。 機械門控通道機械門控通道 一類是牽拉活化或失活的離子通道，另一類是剪切一類是牽拉活化或失活的離子通道，另一類是剪切力敏感的離子通道，前者幾乎存在于一切的細胞膜，研討力敏感的離子通道，前者幾乎存在于一切的細胞膜，研討較多的有血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞以及內(nèi)耳中的

5、毛細胞等，較多的有血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞以及內(nèi)耳中的毛細胞等，后者僅發(fā)現(xiàn)于內(nèi)皮細胞和心肌細胞后者僅發(fā)現(xiàn)于內(nèi)皮細胞和心肌細胞 水通道水通道 2019年諾貝爾化學(xué)獎：年諾貝爾化學(xué)獎： Pete Agre、 Roderick MacKinnon2、膜片鉗技術(shù)及其運用、膜片鉗技術(shù)及其運用3、離子通道藥理學(xué)、離子通道藥理學(xué) 1、細胞電生理學(xué)、細胞電生理學(xué)OUTLINE 電生理學(xué)研討簡史： 二千年前，察看到電鰩魚放電景象。 1825年，Nobili發(fā)明了電流計，用其證明了肌肉有電流存在。 1912年，Bridge 確定了AP的“全或無景象。同年，Oxford提出了突觸的概念及反射弧的生理學(xué)研討，獲1932

6、年Nobel獎。 1937年，Hodgkin和Huxley在槍烏賊宏大神經(jīng)軸突細胞內(nèi)實現(xiàn)細胞內(nèi)電記錄，獲1963年Nobel獎。 1946年，凌寧和Gerard發(fā)明拉制出尖端直徑小于1m的玻璃微電極，并記錄了骨骼肌的電活動。玻璃微電極的運用使的電生理研討進展了革命性的變化。 Voltage clamp電壓鉗技術(shù)由Cole和Marmont 發(fā)明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正開場了定量研討，建立了HH模型膜離子學(xué)說),是近代興奮學(xué)說的基石。 1948年，Katz利用細胞內(nèi)微電極技術(shù)記錄到了終板電位；1969年，又證明NM接觸后的Ach以“量子式釋放，獲1976年Nobel獎。 1

7、976年，德國的Neher和Sakmann發(fā)明Patch Clamp膜片鉗。并在蛙橫紋肌終板部位記錄到乙酰膽堿引起的通道電流。 1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在記錄電極內(nèi)施加負壓吸引，得到了10100 G的高阻封接(giga seal)，大大降低記錄噪聲，實現(xiàn)了單根電極既鉗制膜電位又記錄單通道電流。獲1991年Nobel獎。History of Ion Channel Study 1955年，Hodgkin和Keens運用電壓鉗(Voltage clamp)在研討神經(jīng)軸突膜對鉀離子通透性時發(fā)現(xiàn)，放射性鉀跨軸突膜的運動很像是經(jīng)過許多狹窄空洞的運動，并提出了“通道的概念

8、。 1963年，描畫電壓門控動力學(xué)的Hodgkin-Huxley模型簡稱H-H模型，榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎。 1976年，Neher和Sakmann建立膜片鉗(Patch clamp)技術(shù)。 1983年10月，一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。 1991年， Neher和Sakmann的膜片鉗技術(shù)榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎。1963年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)細胞膜的周邊和中央部分與興奮和抑制有關(guān)的離子機制艾克爾斯艾克爾斯Sir John Carew Eccles澳大利亞澳大利亞澳大利亞國家大學(xué)澳大利亞國家大學(xué)1903年年-2019年年 霍奇金霍奇金Alan Lloyd Hodgkin英

9、國英國英國劍橋大學(xué)英國劍橋大學(xué)1914年年-2019年年赫克斯利赫克斯利Andrew Fielding Huxley英國英國英國倫敦大學(xué)英國倫敦大學(xué)1917年年-The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991) Erwin Neher Bert Sakmann 1/2 of the prize 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr Biophysikalische Chemie, Goettin

10、gen, Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr medizinische Forschung, Heidelberg, Federal Republic of Germany b. 1944b. 1942膜片鉗技術(shù) 膜片鉗技術(shù)：從一小片(約幾平方微米) 膜獲取電子學(xué)方面信息的技術(shù)，即堅持跨膜電壓恒定電壓鉗位，從而丈量經(jīng)過膜離子電流大小的技術(shù)。經(jīng)過研討離子通道的離子流， 從而了解離子運輸、信號傳送等信息。根本原理 利用負反響電子線路,將微電極尖端所吸附的一個至幾個平方微米的細胞膜的電位固定在一定程度上,對經(jīng)過通道的微小離子電流作動態(tài)

11、或靜態(tài)察看,從而研討其功能。 膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)膜電位固定的關(guān)鍵是在玻璃微電極尖端邊緣與細胞膜之間構(gòu)成高阻 10 密封,使電極尖端開口處相接的細胞膜片與周圍環(huán)境在電學(xué)上隔離,并經(jīng)過外加命令電壓鉗制膜電位。 由于玻璃微電極尖端管徑很小,其下膜面積僅約12,離子通道數(shù)量很少,普通只需一個或幾個通道,經(jīng)這一個或幾個通道流出的離子數(shù)量相對于整個細胞來講很少,可以忽略,也就是說電極下的離子電流對整個細胞的靜息電位的影響可以忽略,那么,只需堅持電極內(nèi)電位不變,那么電極下的一小片細胞膜兩側(cè)的電位差就不變,從而實現(xiàn)電位固定。膜片鉗技術(shù)的優(yōu)點 膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的構(gòu)成，由于高阻封接使背景噪聲程度

12、大大降低，相對地增寬了記錄頻帶范圍，提高了分辨率。另外,它還具有良好的機械穩(wěn)定性和化學(xué)絕緣性。而小片膜的孤立使對單個離子通道進展研討成為能夠。膜片鉗記錄的各種方式 根據(jù)膜片與電極之間的關(guān)系，可將膜片記錄主要分為種方式 。首先建立的單通道記錄法Single channel recording是細胞吸附式，其后又建立了膜內(nèi)面向外和膜外面向外的方式；還有一種是全細胞記錄法hole cell recording的全細胞式。如今又開展了開放的細胞吸附式膜內(nèi)面向外和穿孔囊泡膜外面向外的方式 ，以及穿孔膜片的方式。細胞吸附膜片(cell-attached patch mode) 一種將微電極吸附在細胞膜上對

13、單離子通道電流進展記錄的方式。優(yōu)點是不破壞細胞的完好性, 內(nèi)環(huán)境堅持正常。缺陷是不能人為直接地控制細胞內(nèi)環(huán)境條件，不能確切判明細胞內(nèi)電位。即使在浴液中參與刺激物質(zhì)，也不能到達與電極內(nèi)液接觸的膜片的細胞外面。但是，假設(shè)膜片離子通道對浴液中的刺激物有反響，那么可以闡明這種刺激物是經(jīng)過某些細胞內(nèi)第二信使的介導(dǎo)間接地起作用。內(nèi)面向外膜片(inside-out patch) 在細胞吸附方式高阻封接構(gòu)成后,將微管電極提起,使吸附的膜片從胞體上被切割下來，就得到“內(nèi)面向外膜片。此種方式，可直接且自在地經(jīng)浴液介導(dǎo)而調(diào)控細胞內(nèi)液的條件，并可在和細胞活動無關(guān)的方式下察看到單一離子通道的活動。但是，由于胞質(zhì)滲漏，能

14、夠喪失某種通道調(diào)控因子，離子通道活動出現(xiàn)run-down 或run-up景象。全細胞記錄式(hole-cell recording) 在細胞吸附方式下繼續(xù)以負壓抽吸使電極管內(nèi)細胞膜破裂,電極胞內(nèi)液與胞內(nèi)液直接相通,而與浴槽液絕緣,這種方式記錄膜片以外部位的全細胞膜的離子電流。它既可記錄膜電位又可記錄膜電流。其中膜電位可在電流鉗情況下記錄,或?qū)⒉９苓B到規(guī)范高阻微電極放大器上記錄。外面向外膜片(outside-out patch) 在全細胞方式上將微管電極向上提起,可得到切割分別的膜片，斷端游離部分自行交融成脂質(zhì)雙層,此時高阻封接依然存在。而膜外側(cè)面接觸浴槽液。用這種方式，可自在改動細胞外液的情況

15、下，記錄單一離子通道的電流活動。開放細胞吸附膜內(nèi)面向外方式open cell-attached inside-out mode 將細胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜進展機械地破壞，經(jīng)破壞孔調(diào)控細胞內(nèi)液，并在細胞吸附形狀下進展內(nèi)面向外的單一離子通道記錄。這種方法的細胞體積越大，破壞部位離被吸附膜片越遠或破壞孔越小，都可導(dǎo)致細胞因子外流變慢。穿孔膜片方式perforated patch mode 為抑制全細胞方式的胞質(zhì)滲漏問題，Horn和Marty將與離子親和的制霉菌素或二性霉素經(jīng)膜片微電極灌流到含類甾醇的細胞膜片上，構(gòu)成只允許一價離子經(jīng)過的孔，用此法在膜片上做很多導(dǎo)電性孔道借此對全細胞膜電流進展

16、記錄。由于此方式的胞質(zhì)滲漏極為緩慢，部分串聯(lián)阻抗較全細胞方式高，所以鉗制速度很慢，故也稱為緩慢全細胞方式。穿孔囊泡膜外面向外方式(perforated vesicle outside-out mode) 穿孔膜片方式將電極向上提起，便在微電極尖端處構(gòu)成一個膜囊泡膜內(nèi)面向外膜片斷端交融封鎖而成。假設(shè)條件較好，此膜囊泡內(nèi)不僅有細胞質(zhì)因子還可有線粒體等細胞器存在。所以在有比較接近正常的細胞內(nèi)信號傳送條件和代謝條件的根底上，能夠記錄到膜外面向外方式的單一離子通道。 過去以為，膜片鉗只能在培育細胞或酶解的細胞上進展，這樣得到的細胞膜外表比較光滑，才可以構(gòu)成高阻封接，但缺陷是組織的正常三維構(gòu)造被破壞，并且

17、對神經(jīng)中樞內(nèi)突觸特有的傳送機能的研討無法展開。于是，一些學(xué)者建立了組織切片膜片鉗技術(shù)Slice patch，就能在哺乳動物腦片制備上做全細胞記錄。組織切片膜片鉗技術(shù)Slice patch 1992年，在腦片膜片鉗技術(shù)上，美國Ferster 實驗室初次報道在在體貓的視皮層用膜片鉗全細胞記錄研討了視刺激誘發(fā)的興奮性和抑制性突觸后電位相互影響及節(jié)律性膜電位的變化規(guī)律。 1993年，德國的Dodt和Sakmann協(xié)作，利用紅外電視顯微鏡監(jiān)視，使得膜片鉗記錄不但可以在神經(jīng)元胞體及其樹突上進展，而且可同時在這兩個不同的部位作膜片鉗記錄。 為研討化學(xué)門控性通道性質(zhì)，我國學(xué)者秦達意采用 oil-gate co

18、ncentration jump method，配合膜片鉗記錄和分析離子通道在各種化學(xué)條件下的開放與封鎖以及激活與失活的動態(tài)過程。膜片鉗技術(shù)的運用 分辨單通道電流,直接察看通道的開閉過程; 區(qū)分別子通道的離子選擇性及其門控特性(如區(qū)分電壓、化學(xué)或門控性通道),發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型; 在記錄單個通道電流()和全細胞電流()的根底上,可分別計算出細胞膜上的通道數(shù)()和開方概率(),依公式=; 用以檢測某些遞質(zhì)能否翻開通道(外面向外膜片),或能否接受第二信使的調(diào)控(內(nèi)面向外膜片); 研討腺苷酸環(huán)化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶等活性變化,以及細胞膜上信使物質(zhì)二酰甘油花生四烯酸等對離子通道型受體的調(diào)理機制(運用全細胞鉗或外面向外膜片); 研討受體的激活態(tài)、失活態(tài)和靜息態(tài)的功能； 研討不同離子強度對通道特性的影響及細胞內(nèi)信使物質(zhì)如1,4,5-三磷酸肌醇、環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、Ca2+等對離子通道型受體的調(diào)理機制(內(nèi)面向外膜片)。 研討藥物對電壓和化學(xué)內(nèi)控性通道的影響。 Neher等首創(chuàng)將膜片鉗技術(shù)與Fura 2 熒光測鈣技術(shù)結(jié)合,同時進展如細胞內(nèi)熒光強度、細胞膜離子通道電流及細胞膜電容等多目的變化的快速交替測定,這樣便可得出同一事件過程中,多種要素各