1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解外源基因表達(dá)常用的載體及其特點(diǎn)。2、通過本實(shí)驗(yàn)掌握原核基因表達(dá)產(chǎn)物分離的方法。3、通過本實(shí)驗(yàn)掌握原核基因表達(dá)檢測(cè)的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：1、大腸桿菌是分子生物學(xué)研究中表達(dá)外源基因的最常用的模式細(xì)胞之一，外源基因與通過特殊原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。常見載體有冷休克表達(dá)載體pCold系列載體和pET表達(dá)載體系統(tǒng)。 pCold系列載體是利用大腸桿菌冷休克基因CspA啟動(dòng)子序列和5非編碼區(qū)的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。在CspA啟動(dòng)子下游插入了lac operator，可以嚴(yán)格調(diào)控目的基因的表達(dá)?？刹捎玫蜏卣T導(dǎo)載體及攜帶表達(dá)的方法，使大腸桿菌自身的蛋白質(zhì)合成受到抑制、目的蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)

2、。和以前的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)-pET系統(tǒng)相比，在蛋白質(zhì)表達(dá)量和可溶性上有所提高。 pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)。目標(biāo)基因被克隆到T7噬菌體強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)控制之下，并通過宿主細(xì)胞提供的T7 RNA聚合酶來誘導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)。 二、實(shí)驗(yàn)儀器、用具、藥品 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置、電磁爐、水浴鍋、 微量移液器、注射器、 Ecoli （pET-32a空載體）、 Ecoli （ pET-32a 攜帶外源基因）、 Ecoli （無載體）IPTG 、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白等。1、聚丙烯酰胺凝膠的配制 將以上各成分混合后灌膠，以蒸餾水封膠，膠聚合30-60 min后，用濾紙將水吸出。 加入上述濃縮膠,

3、 插入梳子，聚合1560 min。三、實(shí)驗(yàn)步驟：3.4ml2.8ml2、 取檢測(cè)為陽性的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌 100 l接種至6 ml含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37，振蕩培養(yǎng)過夜。1:20比例稀釋菌液，取500 l菌液轉(zhuǎn)接到10 ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37，180 r/min，振蕩培養(yǎng)2-3 h，至OD600到0.5時(shí)，37 水浴30min后，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)， 37 條件下振蕩培養(yǎng)，12 h后取樣。 同時(shí)做對(duì)照組：含有pET-32a空載體的大腸桿菌。 Ecoli （無載體）。3、蛋白質(zhì)樣品的制備 分別取1 ml菌液，12000 r/min，離心2 min，棄上清，再取1mi重復(fù)一次，加入100 l 上樣緩沖液懸浮沉淀，置水浴煮沸5 min，冰上放置5 min，12000 r/min，離心5 min，取上清點(diǎn)樣。4、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 在電泳槽中加入電極緩沖液，連接電源，電泳至溴酚藍(lán)行至電泳槽前沿時(shí)停止(需約4 h)。5、染色、脫色 將膠從玻璃板中取出，用考馬斯亮蘭染色液室溫染色1-2 h。將膠從染色液中取出，在脫色搖床慢搖脫色，更換兩次脫色液后，將膠置于含冰乙酸(1:1000)的蒸餾水中，脫色至條帶清晰。6、