1、2022-5-2111.2.4純化與精制純化與精制- 色譜技術(shù)色譜技術(shù)v概述v吸附色譜v離子交換色譜v凝膠過濾v親和色譜2022-5-212概述概述v2.2.特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1 1） 純化倍數(shù)高純化倍數(shù)高（2 2） 操作規(guī)模小，放大困難操作規(guī)模小，放大困難（3 3） 終產(chǎn)品純化終產(chǎn)品純化（4 4） 適用于價(jià)格昂貴的產(chǎn)品適用于價(jià)格昂貴的產(chǎn)品2022-5-2132022-5-214 Pharmacia KTA Pharmacia KTA 層析系統(tǒng)層析系統(tǒng) 2022-5-2152022-5-2164.色譜的分類色譜的分類（1 1）根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的）根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同機(jī)

2、理不同的分類的分類凝膠色譜親和色譜離子交換色譜分離法吸附色譜法分配色譜法2022-5-217（2 2）根據(jù)固定相的形狀不同的分類：）根據(jù)固定相的形狀不同的分類： 柱色譜法柱色譜法薄層色譜法薄層色譜法2022-5-218（3 3）根據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)不同的分類）根據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)不同的分類 ： 液相色譜（LC）：LLC、LSC反相色譜：固定相極性小于流動(dòng)相（4 4） 根據(jù)流動(dòng)相與固定相的極性分類根據(jù)流動(dòng)相與固定相的極性分類 ： 正相色譜：固定相極性大于流動(dòng)相氣相色譜（GC）：GLC、GSC2022-5-219任何色譜分離過程實(shí)質(zhì)上都是任何色譜分離過程實(shí)質(zhì)上都是溶質(zhì)隨流動(dòng)相流動(dòng)而遷溶質(zhì)隨流動(dòng)相流動(dòng)而遷移

3、的過程移的過程，不同溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配比例不同溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配比例不同，不同，因而隨流動(dòng)相遷移的速度不同，從而使不同物因而隨流動(dòng)相遷移的速度不同，從而使不同物質(zhì)分離開來。質(zhì)分離開來。2022-5-2110溶質(zhì)在固定相與流動(dòng)相濃度比值溶質(zhì)在固定相與流動(dòng)相濃度比值cqKd2022-5-2111遷移距離流動(dòng)相在色譜系統(tǒng)中的溶質(zhì)的遷移距離fR2022-5-21125.2色譜圖及基本概念v（1）色譜圖：混合液中各組分經(jīng)色譜柱分離）色譜圖：混合液中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱進(jìn)入監(jiān)測器，后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱進(jìn)入監(jiān)測器，監(jiān)測器的響應(yīng)信號(hào)時(shí)間（或流動(dòng)相體積）監(jiān)測器的

4、響應(yīng)信號(hào)時(shí)間（或流動(dòng)相體積）曲線，稱為色譜圖或色譜流出曲線。曲線，稱為色譜圖或色譜流出曲線。v（2）基線：在操作條件下，色譜柱出口沒有）基線：在操作條件下，色譜柱出口沒有組分流出，僅有流動(dòng)相流過監(jiān)測器，此時(shí)流組分流出，僅有流動(dòng)相流過監(jiān)測器，此時(shí)流出的曲線。出的曲線。v（3）色譜峰：當(dāng)樣品中的組分隨流動(dòng)相流入）色譜峰：當(dāng)樣品中的組分隨流動(dòng)相流入監(jiān)測器時(shí)，監(jiān)測器的響應(yīng)信號(hào)隨時(shí)間變化所監(jiān)測器時(shí)，監(jiān)測器的響應(yīng)信號(hào)隨時(shí)間變化所形成的峰形圖形。形成的峰形圖形。v（4）峰形：對(duì)稱于峰尖的正態(tài)分布曲線。）峰形：對(duì)稱于峰尖的正態(tài)分布曲線。2022-5-2113洗脫曲線返回返回2022-5-21142022-5-

5、2115（6）保留值保留值2022-5-2116 (7)(7)分離度：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組色譜峰分離度：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組色譜峰峰底寬度平均值之比。峰底寬度平均值之比。峰寬（峰寬（W W）：兩側(cè)拐點(diǎn)處所作的切線與峰底相交于兩點(diǎn)，）：兩側(cè)拐點(diǎn)處所作的切線與峰底相交于兩點(diǎn)， 此兩點(diǎn)的距離。（此兩點(diǎn)的距離。（見圖見圖）半高峰寬（半高峰寬（W W1/21/2) )：1/21/2峰高處的峰寬。峰高處的峰寬。峰高：峰頂點(diǎn)與峰底的垂直距離。峰高：峰頂點(diǎn)與峰底的垂直距離。峰面積：峰與峰底之間的面積。峰面積：峰與峰底之間的面積。標(biāo)準(zhǔn)偏差（標(biāo)準(zhǔn)偏差（）：）：0.607h0.607h峰高處的峰寬的

6、峰高處的峰寬的1/21/2區(qū)域?qū)挾龋ǚ鍖?、半高峰寬、?biāo)準(zhǔn)偏差）區(qū)域?qū)挾龋ǚ鍖?、半高峰寬、?biāo)準(zhǔn)偏差） W=4W=4 2/ ) 12(12WWttRRRR1完全分離2022-5-2117流動(dòng)相與固定相平均濃度流動(dòng)相與固定相平均濃度達(dá)傳質(zhì)平衡時(shí)的一段柱高達(dá)傳質(zhì)平衡時(shí)的一段柱高（22/1)(54. 5WtNR2)(16bRWtN NLH 2022-5-21186.6.色譜分離操作色譜分離操作（1 1）裝柱）裝柱（2 2）上樣）上樣（3 3）淋洗）淋洗（4 4）洗脫方法）洗脫方法按操作方式按操作方式a a 恒定洗脫恒定洗脫b b 分步洗脫分步洗脫 c c 梯度洗脫梯度洗脫 按洗脫機(jī)理按洗脫機(jī)理專一性洗脫

7、（專一性洗脫（specific elutionspecific elution） 非專一性洗脫（非專一性洗脫（nonspecific elutionnonspecific elution） 2022-5-21192022-5-2120（1）裝柱 裝柱的質(zhì)量直接影響到分離的效果，因而裝柱是分離成功的最關(guān)鍵的一步。 目前，裝柱的方式主要采用自然自然沉降法、加壓法沉降法、加壓法等。2022-5-2121自然沉降法裝柱的要點(diǎn)1.先在柱內(nèi)注入約1/3柱高的起始緩沖液，并排除好氣泡；2.將填充層析介質(zhì)慢慢地、連續(xù)不斷地添加到裝有緩沖液的柱中，確保裝柱均勻、不斷層、無氣泡；3.控制好流速和操作壓，出水口不能

8、降得太低；4.層析柱一定要垂直，以免填充層析介質(zhì)歪斜；5.在柱的表面始終要保持一層溶劑，不能“流干”；6.添加的填充層析介質(zhì)不宜過稀；7.裝好柱后，應(yīng)在柱的表面放一張濾紙片、尼龍紗或人造絲網(wǎng)2022-5-2122（2）平衡 平衡：用起始緩沖液溶液流經(jīng)（浸泡）層析介質(zhì)，使層析介質(zhì)顆粒四周和內(nèi)部處于相同pH和離子強(qiáng)度狀態(tài)的過程。 層析柱正式使用前，必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度 一般用起始緩沖溶液在恒定壓力下走柱 平衡液用量一般為相當(dāng)于35倍床體積，使層析介質(zhì)充分平衡、柱床穩(wěn)定2022-5-2123（3）上樣 上樣量的多少和上樣體積大小是影響分離效果的關(guān)鍵因素。上樣量越少和上樣體積越小，則分離效果

9、越好 最大上樣量必須在具體實(shí)驗(yàn)條件下通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)來確定2022-5-2124樣品的制備 樣品在上柱前必須經(jīng)過預(yù)處理：一般要使其與起始緩沖液有相同的pH值、離子強(qiáng)度和盡可能小的體積 預(yù)處理方法：常用超濾法、透析法和凝膠過濾法等進(jìn)行濃縮和脫鹽，樣品中的不容物在上樣前用離心法或過濾法除去。2022-5-2125加樣方法 移去柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加樣：先使移液管尖端接觸離柱床表面約1cm高出的內(nèi)壁，隨后隨沿柱內(nèi)壁轉(zhuǎn)動(dòng)一周，然后迅速移至中央，使樣品盡可能快地覆蓋住全膠面，打開下口，以便使樣品均勻地滲入柱內(nèi)，當(dāng)樣品液下降至膠面相切（膠面必須覆蓋一層薄薄的溶液）時(shí)，關(guān)閉下口。 用蠕動(dòng)泵把樣

10、品直接傳送到柱表面（適用于添加大量樣品或工業(yè)生產(chǎn)上） 加樣后，即開始收集流出液體。樣液完全流入層析柱后，用起始緩沖液裝滿柱，再接恒流泵開始洗脫2022-5-2126（4）洗脫 先用足夠量的起始緩沖液流洗層析柱，洗出未被吸附的物質(zhì)，并使床體得到充分平衡 然后，在用適當(dāng)?shù)南疵撘哼M(jìn)行洗脫，以達(dá)到分離的目的 洗脫液的pH及離子強(qiáng)度等是影響分離效果、產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量的重要因素，故不同物質(zhì)應(yīng)選用不同的洗脫液2022-5-2127洗脫操作方式 可連接恒流泵和收集器，全自動(dòng)進(jìn)行洗脫與收集 也可以利用自然壓力，人工操作進(jìn)行洗脫與收集2022-5-2128洗脫方式 通常采用的洗脫方式有兩種：階段洗脫法和連續(xù)梯度洗脫

11、法2022-5-2129階段洗脫法 又稱逐次洗脫法，是指分段改變洗脫液中的pH值或鹽濃度，使吸附在柱上的各組分洗脫下來。 當(dāng)欲分離純化的混合物組成簡單，或分子量及性質(zhì)差別較大，或需要快速分離時(shí)，階段洗脫是比較實(shí)用但這種方法有以下缺點(diǎn)： 洗脫能力較強(qiáng)，分辨率較差，親和力或分子量相近的不同組分不易分開，可能集中組分將出現(xiàn)在同一個(gè)洗脫峰中，不能分開。易形成拖尾現(xiàn)象2022-5-2130連續(xù)梯度洗脫 又稱線性梯度洗脫法，是通過連續(xù)改變洗脫液中的pH值或鹽濃度，使吸附柱上的各組分被洗脫下來 通常采用一種低濃度的鹽溶液為起始溶液，另一種高濃度的鹽溶液作為最終溶液。兩者之間通過一根玻璃管連通，使高鹽溶液向低

12、鹽溶液處流，起始溶液直接流入柱內(nèi)，這樣就使柱內(nèi)的鹽濃度梯度上升，克服了直線洗脫中的拖尾現(xiàn)象。 它的分辨率大大超過分段洗脫。在生化試驗(yàn)及生化物質(zhì)制備中常用連續(xù)梯度洗脫，它優(yōu)于階段洗脫法。2022-5-2131常用的梯度混合器由2個(gè)容器構(gòu)成 2個(gè)容器安放在同一個(gè)水平上，第一個(gè)容器盛有起始緩沖液，第二個(gè)容器盛有等量的、含較高離子強(qiáng)度或不同pH值的上限緩沖液，二者用管子相連，以保持其中溶液的流動(dòng)靜力平衡。第一個(gè)容器通過管道與柱相連，當(dāng)緩沖液從第一個(gè)容器流入柱中時(shí)，第二個(gè)容器的緩沖液自動(dòng)地來補(bǔ)足，結(jié)果使洗脫液的pH值、離子強(qiáng)度呈線性地增加。2022-5-2132（5）流速控制 流速與所用介質(zhì)的結(jié)構(gòu)、粗細(xì)

13、及數(shù)量有關(guān)，與層析柱大小、介質(zhì)填裝的松緊、洗脫液的粘度、操作壓等也有關(guān)，必須根據(jù)具體條件反復(fù)試驗(yàn)，以確定一個(gè)合適的流速。流速控制方法有兩種： 流速可以通過調(diào)價(jià)“操作壓”或恒流泵的速度來控制?！安僮鲏骸毕喈?dāng)于在柱上部的儲(chǔ)液瓶中溶劑的水平和柱出水口位置的水平之差，可以用裝有恒壓管的恒壓瓶，使操作壓保持恒定。 利用恒流泵通過固定流速把洗脫液泵入或泵出柱，并保持穩(wěn)定流速。2022-5-2133（6）分部收集 洗脫液必須分成小部分收集。每管收集的體積愈小，愈容易得到純的組分。收集時(shí)，現(xiàn)多使用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行。2022-5-2134（7）洗脫峰檢測 為了測定收集的各部分中各種成分的分布，必須用一些能特異

14、地檢測被分離化合物的方法來進(jìn)行分析，一般可用直接或間接方法，主要取決于溶質(zhì)的性質(zhì)和層析目的。直接法有分光光度法、光折射法、熒光法和放免法等2022-5-2135（8）合并收集 欲得到高純度的化合物，一般根據(jù)洗脫峰的位置收集合并較窄的部分；欲得產(chǎn)量較多目的物，則合并較寬部分。2022-5-2136（9）脫鹽和濃縮 在科研、生產(chǎn)中，要得到高純度的組分，往往要經(jīng)過幾次柱層析，每次柱層析后，某一峰的洗脫液可依次用透析法除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮法將樣品濃縮到一定體積后，再上第二次柱。上第三次柱前也可采用類似的方法處理樣品2022-5-21372022-5-21382022-5-21392022-5-21

15、40第二節(jié) 吸附色譜法1.11.1吸附定義：吸附定義：吸附是利用吸附劑對(duì)吸附是利用吸附劑對(duì)液體或氣體液體或氣體中中某一組分具有某一組分具有選擇性吸附選擇性吸附的能力，使其富集在吸的能力，使其富集在吸附劑表面的過程。附劑表面的過程。 （表面吸附與吸收）（表面吸附與吸收）1.21.2吸附作用：吸附作用： 脫色、除臭、吸濕、防潮、及某些產(chǎn)品（如：脫色、除臭、吸濕、防潮、及某些產(chǎn)品（如：酶、蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸、抗生素等）的分酶、蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸、抗生素等）的分離精制。離精制。2022-5-21411.31.3吸附的特點(diǎn)：吸附的特點(diǎn)：選擇性高選擇性高處理能力較低處理能力較低可直接分離發(fā)酵液中所

16、需的產(chǎn)物可直接分離發(fā)酵液中所需的產(chǎn)物操作簡單，但實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜。操作簡單，但實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜。2022-5-21422022-5-21432 吸附過程的理論基礎(chǔ)吸附過程的理論基礎(chǔ)v2.1基本概念基本概念吸附：吸附： 利用吸附劑對(duì)液體或氣體中某些組分具有選擇性利用吸附劑對(duì)液體或氣體中某些組分具有選擇性 吸附能力，使其富集在吸附劑表面的過程。吸附能力，使其富集在吸附劑表面的過程。吸附物：被吸附的物質(zhì)。吸附物：被吸附的物質(zhì)。吸附劑：吸附操作所使用的固體原料。一般為多孔微粒或吸附劑：吸附操作所使用的固體原料。一般為多孔微粒或 多孔膜，具有很大比表面積。多孔膜，具有很大比表面積。原因：固體內(nèi)部分子作用力原因：

17、固體內(nèi)部分子作用力0 0 固體分子外部作用力固體分子外部作用力00，即從外界吸附分子、離，即從外界吸附分子、離子原子，并在吸附表面形成單分子或多分子層。子原子，并在吸附表面形成單分子或多分子層。2022-5-21442.2 吸附原理吸附原理（1 1）作用力：吸附劑與吸附質(zhì)間的范德華力（定向）作用力：吸附劑與吸附質(zhì)間的范德華力（定向力、誘導(dǎo)力、色散力）或氫鍵。力、誘導(dǎo)力、色散力）或氫鍵。（2 2）吸附力大小：吸附質(zhì)能否被吸附及吸附量多少）吸附力大?。何劫|(zhì)能否被吸附及吸附量多少 a. a. 溶質(zhì)與吸附劑極性的相似性溶質(zhì)與吸附劑極性的相似性 b. b. 溶劑極性與溶質(zhì)極性的相似性溶劑極性與溶質(zhì)極性

18、的相似性2022-5-21452.3 2.3 影響吸附的因素影響吸附的因素（1 1）吸附劑的性質(zhì)：影響吸附容量和吸附速率）吸附劑的性質(zhì)：影響吸附容量和吸附速率 a.a.吸附劑吸附劑表面積表面積b.b.吸附劑吸附劑孔徑孔徑- -適中適中 c.c.極性極性：極性化合物選極性吸附劑；非極性化合物選非：極性化合物選極性吸附劑；非極性化合物選非極性吸附劑。極性吸附劑。（2 2）吸附質(zhì)性質(zhì)）吸附質(zhì)性質(zhì)a.a.溶質(zhì)從較易溶解的溶劑中被吸附時(shí)，吸附量較少溶質(zhì)從較易溶解的溶劑中被吸附時(shí)，吸附量較少（相（相似相容）似相容）b.b.極性極性被吸附物被吸附物質(zhì)質(zhì)吸附劑吸附劑溶劑溶劑極性極性極性極性非極性非極性非極性非

19、極性非極性非極性極性極性2022-5-2146vc.c.同系物：分子量越大，極性越低，易被非極性吸同系物：分子量越大，極性越低，易被非極性吸附劑吸附附劑吸附 如：活性炭：如：活性炭：W W大大W W小；小； 多肽氨基酸；多糖單多肽氨基酸；多糖單 糖糖 v(3)(3)其他因素：其他因素：T T、pHpH、吸附質(zhì)濃度、吸附劑用量等、吸附質(zhì)濃度、吸附劑用量等 2022-5-21472.4 2.4 常用吸附劑常用吸附劑2.4.12.4.1活性炭（活性炭（非極性吸附劑）非極性吸附劑）（1 1）種類：）種類： 活性炭種類活性炭種類顆粒大小顆粒大小表面積表面積吸附力吸附力吸附量吸附量洗脫洗脫粉末活性炭粉末活

20、性炭小小大大大大大大難難顆粒活性炭顆?；钚蕴看蟠笮⌒≥^小較小較小較小較難較難錦綸活性炭錦綸活性炭較小較小較大較大小小小小易易2022-5-2148（2 2）活性炭對(duì)物質(zhì)的吸附活性炭對(duì)物質(zhì)的吸附一般規(guī)律一般規(guī)律a.a.吸附作用吸附作用：在：在水水中吸附力中吸附力最強(qiáng)最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中吸附力最，在有機(jī)溶劑中吸附力最弱弱 b.b.洗脫作用洗脫作用：水的洗脫能力：水的洗脫能力最弱最弱，有機(jī)溶劑洗脫能力最強(qiáng)，有機(jī)溶劑洗脫能力最強(qiáng) c.c.被分離物類型被分離物類型 ：W W大大W W?。恍。?芳香族脂肪族芳香族脂肪族 d. pH d. pH 值的影響值的影響應(yīng)用：精制有機(jī)物常用活性炭脫色；高純金屬微量雜質(zhì)

21、的分應(yīng)用：精制有機(jī)物常用活性炭脫色；高純金屬微量雜質(zhì)的分離分析。離分析。2022-5-21492.4.2 2.4.2 硅膠極性吸附劑硅膠極性吸附劑（1 1）影響吸附的因素）影響吸附的因素 a.a.吸附物的性質(zhì)：極性化合物非極性化合物吸附物的性質(zhì)：極性化合物非極性化合物 b.b.硅膠含水量（硅膠含水量（1 12020） （2 2）硅膠活化：）硅膠活化：105105110 110 活化活化 1h1h 2022-5-21502.4.32.4.3大孔性吸附樹脂大孔性吸附樹脂（1 1）大孔性樹脂的結(jié)構(gòu)）大孔性樹脂的結(jié)構(gòu) 大孔吸附樹脂是一種不大孔吸附樹脂是一種不含交換基團(tuán)的含交換基團(tuán)的, , 具有大具有大

22、孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑?？捉Y(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。通常大孔性樹脂是聚苯通常大孔性樹脂是聚苯乙烯和二乙烯苯的共聚乙烯和二乙烯苯的共聚物，它們具有多孔性的物，它們具有多孔性的巨大網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。巨大網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。2022-5-2151(2)(2)大孔網(wǎng)狀吸附樹脂的種類大孔網(wǎng)狀吸附樹脂的種類v非極性吸附樹脂：苯乙烯交聯(lián)而成，又稱芳香非極性吸附樹脂：苯乙烯交聯(lián)而成，又稱芳香族吸附劑。族吸附劑。v中等極性吸附樹脂：甲基丙烯酸酯交聯(lián)而成，中等極性吸附樹脂：甲基丙烯酸酯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑亦為甲基丙烯酸酯，故又稱脂肪族吸附交聯(lián)劑亦為甲基丙烯酸酯，故又稱脂肪族吸附劑。劑。v極性吸附劑：丙烯酰胺或亞砜經(jīng)聚合而成，通極性吸附劑：丙烯

23、酰胺或亞砜經(jīng)聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基團(tuán)。常含有硫氧、酰胺、氮氧等基團(tuán)。2022-5-2152（3 3）吸附原則）吸附原則a.a.吸附劑的極性吸附劑的極性 非極性吸附劑適應(yīng)從極性溶劑中吸附非極性物非極性吸附劑適應(yīng)從極性溶劑中吸附非極性物 極性吸附劑適應(yīng)從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)極性吸附劑適應(yīng)從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)b.b.吸附物分子大小吸附劑孔徑（孔徑吸附物分吸附物分子大小吸附劑孔徑（孔徑吸附物分子直徑的子直徑的6 6倍）倍）2022-5-21532.吸附薄層色譜吸附薄層色譜吸附薄層吸附薄層色譜色譜2022-5-21542022-5-21552.3吸附薄層色譜-操作v制板制板：硅

24、膠：硅膠G G板，硅膠板，硅膠CMCCMC板板v點(diǎn)樣點(diǎn)樣：少量多次、：少量多次、D D3mm、邊、邊 1.52cmv展開展開：密閉容器、提前配好展開劑；：密閉容器、提前配好展開劑；溶劑不能浸沒樣品點(diǎn)；展完后劃前溶劑不能浸沒樣品點(diǎn)；展完后劃前沿及樣品移動(dòng)距離沿及樣品移動(dòng)距離v檢測檢測：紫外線照射；噴霧顯色；碘：紫外線照射；噴霧顯色；碘蒸汽等蒸汽等v計(jì)算計(jì)算Rf-Rf-影響因素影響因素2022-5-21562.4薄層色譜的應(yīng)用v定性分析v純度鑒定v樣品制備v分離純化2022-5-21573.吸附柱色譜吸附柱色譜v3.13.1基本原理基本原理v3.23.2吸附柱色譜條件吸附柱色譜條件v（1 1）色譜

25、柱的選擇）色譜柱的選擇v（2 2）吸附劑的選擇吸附劑的選擇- -分辨率高（對(duì)不同的物質(zhì)有不分辨率高（對(duì)不同的物質(zhì)有不同的吸附與解吸能力）同的吸附與解吸能力） 如：極性吸附劑易吸附極性化合物；但便于解吸，如：極性吸附劑易吸附極性化合物；但便于解吸，極性化合物，應(yīng)選擇極性較小的吸附劑極性化合物，應(yīng)選擇極性較小的吸附劑2022-5-21582022-5-21592022-5-21602022-5-21612022-5-21622022-5-21632022-5-21642022-5-21652022-5-21662022-5-2167第三節(jié)離子交換色譜第三節(jié)離子交換色譜2022-5-2168離子交換

26、層析原理Starting conditionsAdsorptions on sample substancesStart of desorptionEnd of desorptionregenerations2022-5-2169v1.1.基本概述基本概述v1.11.1離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)離子交換樹脂的結(jié)構(gòu) 在水溶液中呈不溶解狀態(tài)，能釋放反離子，在水溶液中呈不溶解狀態(tài)，能釋放反離子，同時(shí)也可與溶液中其它帶相反電荷物質(zhì)結(jié)合。如：同時(shí)也可與溶液中其它帶相反電荷物質(zhì)結(jié)合。如：RSORSO3 3NaNa，DEAEDEAE纖維素纖維素（1 1）基質(zhì)：具有三維空間立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)骨架）基質(zhì)：具有三維空間立體結(jié)

27、構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)骨架（2 2）功能基團(tuán)（或活性基團(tuán)）：聯(lián)接在骨架）功能基團(tuán)（或活性基團(tuán)）：聯(lián)接在骨架（3 3）反離子（活性離子）：活性基團(tuán)所帶的相反電）反離子（活性離子）：活性基團(tuán)所帶的相反電荷的活性離子（可交換離子）荷的活性離子（可交換離子）2022-5-21701.21.2離子交換的分類離子交換的分類v1.2.11.2.1按活性基團(tuán)分類，可分為按活性基團(tuán)分類，可分為（1 1）陽離子交換樹脂（含酸性基團(tuán)）陽離子交換樹脂（含酸性基團(tuán)）強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂：強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂：a.a.活性基團(tuán)是活性基團(tuán)是- -SOSO3 3H H（磺酸基）和磺酸基）和- -CHCH2 2SOSO3 3H H（次甲基磺

28、酸基）次甲基磺酸基）b.pH1b.pH11414使用，選擇性差使用，選擇性差弱酸性陽離子交換樹脂：弱酸性陽離子交換樹脂：a.a.活性基團(tuán)有活性基團(tuán)有- -COOH, -OCHCOOH, -OCH2 2COOH, CCOOH, C6 6H H5 5OHOH等弱酸性基團(tuán)；等弱酸性基團(tuán)；b. pHb. pH大于大于7 7，選擇性好，選擇性好2022-5-2171（2 2）陰離子交換樹脂（含堿性基團(tuán)）。）陰離子交換樹脂（含堿性基團(tuán)）。 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂：強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂：a a活性基團(tuán)為季銨基團(tuán)，如三甲胺基或二甲基活性基團(tuán)為季銨基團(tuán)，如三甲胺基或二甲基- - -羥基羥基乙基胺基；乙基胺基；b.

29、pH1b.pH11414，選擇性差，應(yīng)用廣泛，選擇性差，應(yīng)用廣泛弱堿性陰離子交換樹脂：弱堿性陰離子交換樹脂：a.a.活性基團(tuán)為伯胺或仲胺，堿性較弱；活性基團(tuán)為伯胺或仲胺，堿性較弱；b.pHb.pH小于小于7 7，選擇性好，應(yīng)用范圍窄，選擇性好，應(yīng)用范圍窄2022-5-2172以上為以上為4 4種基本類型，可通過轉(zhuǎn)型成種基本類型，可通過轉(zhuǎn)型成其它類型其它類型vR-SOR-SO3 3- -H H+ + R-SOR-SO3 3- -NaNa+ +vR-COOH R-COOH R-COO R-COO- -NaNa+ +vR-NRR-NR3 3+ +OHOH- - R-NRR-NR3 3+ +ClCl-

30、 -vR-NHR-NH3 3+ +OHOH- - R-NHR-NH3 3+ +ClCl- -2022-5-2173類型類型結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)活性機(jī)團(tuán)活性機(jī)團(tuán)使用使用pH值值商品號(hào)商品號(hào)強(qiáng)酸型強(qiáng)酸型交聯(lián)的聚交聯(lián)的聚苯乙烯苯乙烯SO3H（磺酸基）（磺酸基）014國產(chǎn)國產(chǎn) #732Amberlite1R-120(美美)Dowex 50(美美)Zerolit225(英英)神膠神膠1號(hào)（日）號(hào)（日）弱酸型弱酸型聚丙烯酸聚丙烯酸COOH（羧基）（羧基）OH（酚羥基）（酚羥基）不能小不能小4不能小于不能小于9.5國產(chǎn)國產(chǎn) #724幾種離子交換樹脂幾種離子交換樹脂2022-5-2174幾種離子交換樹脂幾種離子交換樹脂

31、類型類型 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 活性基團(tuán)活性基團(tuán) 使用使用 pH值值 商品號(hào)商品號(hào)強(qiáng)堿型強(qiáng)堿型交聯(lián)的交聯(lián)的聚苯乙烯聚苯乙烯N（CH3）3Cl（磺酸基）（磺酸基）014國產(chǎn)國產(chǎn) #717國產(chǎn)國產(chǎn) #201Amberlite1RA-400（410）(美美)Dowex 50(美美)Zerolit225(英英)神膠神膠801（日）（日）弱堿型弱堿型交聯(lián)的交聯(lián)的聚苯乙烯聚苯乙烯NH（CH3）2OHNH2 （CH3）OH07國產(chǎn)國產(chǎn) #704和和# 330Amberlite1R-45（410）(美美)Dowex 3(美美)Zerolit H2022-5-21751.2.21.2.2新型離子交換樹脂新型離子交換樹脂v大

32、孔離子交換樹脂大孔離子交換樹脂 大孔離子交換樹脂具有和大孔吸附劑相大孔離子交換樹脂具有和大孔吸附劑相同的骨架結(jié)構(gòu)，在大孔吸附劑合成后（加同的骨架結(jié)構(gòu)，在大孔吸附劑合成后（加入致孔劑），再引入化學(xué)功能基團(tuán)，便可入致孔劑），再引入化學(xué)功能基團(tuán)，便可得到大孔離子交換樹脂得到大孔離子交換樹脂2022-5-21761.2.31.2.3其它離子交換樹脂類型其它離子交換樹脂類型v兩性樹脂兩性樹脂：v均孔型離子交換樹脂均孔型離子交換樹脂：v螯合樹脂螯合樹脂：v* *多糖基離子交換樹脂多糖基離子交換樹脂：2022-5-2177主要的多糖基離子交換樹脂主要的多糖基離子交換樹脂（1 1）離子交換纖維素）離子交換纖維

33、素 a.a.樹脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團(tuán)的性質(zhì)可分樹脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團(tuán)的性質(zhì)可分為陽離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類為陽離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類 b.b.特點(diǎn)：骨架松散、親水性強(qiáng)，易吸收大分子；特點(diǎn)：骨架松散、親水性強(qiáng)，易吸收大分子；表面積大、交換容量大；吸附力弱、交換和洗脫表面積大、交換容量大；吸附力弱、交換和洗脫條件溫和；分辨率高條件溫和；分辨率高 c.c.常用的離子交換纖維素：常用的離子交換纖維素： 甲基磺酸纖維素（甲基磺酸纖維素（SMSMC C）、羧甲基纖維素（）、羧甲基纖維素（CMCMC C）、）、 二乙基氨基乙基纖維素（二乙基氨基乙基纖維素（DEAEDE

34、AEC C）、）、TEAETEAEC C2022-5-2178（2 2）葡聚糖凝膠離子交換樹脂）葡聚糖凝膠離子交換樹脂a.a.骨架為葡聚糖凝膠，如骨架為葡聚糖凝膠，如sepharosesepharose、sephadexsephadex，根據(jù)功能基團(tuán)的不同，亦可分為陽離子交換和陰根據(jù)功能基團(tuán)的不同，亦可分為陽離子交換和陰離子交換樹脂離子交換樹脂b.b.特點(diǎn)：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩特點(diǎn)：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率的功能，提高了分離的效率c.c.常用的葡聚糖凝膠離子交換樹脂：常用的葡聚糖凝膠離子交換樹脂：CM- sephadex C-25CM- se

35、phadex C-25、DEAE-sephadex A-25DEAE-sephadex A-25等等2022-5-2179PSPS：（1 1）離子交換樹脂：適用于無機(jī)離子交換和有機(jī)離子交換樹脂：適用于無機(jī)離子交換和有機(jī)酸、酸、aaaa、抗生素等小分子的提取、分離、抗生素等小分子的提取、分離（2 2）蛋白質(zhì)類生物大分子多糖基離子交換劑）蛋白質(zhì)類生物大分子多糖基離子交換劑a.a.親水性強(qiáng)提供微環(huán)境親水性強(qiáng)提供微環(huán)境b.b.孔徑較大提高實(shí)際交換容量孔徑較大提高實(shí)際交換容量c.c.粒度較小增加擴(kuò)散，減小阻力粒度較小增加擴(kuò)散，減小阻力d.d.電荷密度較低靜電作用小，避免失活；易洗脫電荷密度較低靜電作用小

36、，避免失活；易洗脫2022-5-21802.2.離子交換樹脂的理化性能離子交換樹脂的理化性能v外觀外觀：球形、淺色為宜，粒度大小為：球形、淺色為宜，粒度大小為16601660目目90%90%；v機(jī)械強(qiáng)度機(jī)械強(qiáng)度：90%90%；v含水量：含水量：0.3-0.7g/g 0.3-0.7g/g 樹脂；樹脂；v交換容量交換容量：重量交換容量、體積交換容量、工作：重量交換容量、體積交換容量、工作交換容量或稱表觀交換容量（在某一條件下）；交換容量或稱表觀交換容量（在某一條件下）；v穩(wěn)定性：化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性；穩(wěn)定性：化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性；v膨脹度膨脹度：交聯(lián)度交聯(lián)度、活性基團(tuán)的性質(zhì)與數(shù)量、活性、活性基團(tuán)的

37、性質(zhì)與數(shù)量、活性離子的性質(zhì)、介質(zhì)的性質(zhì)和濃度、骨架結(jié)構(gòu)；離子的性質(zhì)、介質(zhì)的性質(zhì)和濃度、骨架結(jié)構(gòu)；2022-5-21813.3.離子交換分離的理論基礎(chǔ)離子交換分離的理論基礎(chǔ)2022-5-21823.2離子交換離子交換 離子交換樹脂與含離子的溶液接觸時(shí)，樹脂上的反離子離子交換樹脂與含離子的溶液接觸時(shí)，樹脂上的反離子A+進(jìn)入溶液，而溶液中的進(jìn)入溶液，而溶液中的B+被樹脂被樹脂“吸附吸附”，即，即“化學(xué)吸附化學(xué)吸附”。（1）反應(yīng)可逆，平衡可迅速達(dá)到，且平衡移動(dòng)遵守質(zhì)量作用定）反應(yīng)可逆，平衡可迅速達(dá)到，且平衡移動(dòng)遵守質(zhì)量作用定律。如：律。如：B+濃度增加，平衡右移濃度增加，平衡右移（2）離子交換樹脂的選

38、擇性對(duì)溶液中不同離子具有不同）離子交換樹脂的選擇性對(duì)溶液中不同離子具有不同結(jié)合力結(jié)合力mnnmmnnmA,BBABAK外外相相樹樹脂脂樹樹脂脂外外相相 RBARAB選擇性系數(shù)選擇性系數(shù)： 2022-5-21833.3離子交換的選擇性v（1）離子交換常數(shù)：交換勢或交換系數(shù)）離子交換常數(shù)：交換勢或交換系數(shù)ssBABARABRKR-A、R-B表示結(jié)合在樹脂上的表示結(jié)合在樹脂上的A離子和離子和B離子濃度離子濃度AS、BS表示溶液中表示溶液中A離子和離子和B離子離子ssBAABARBRK/越大B越易被交換BAK2022-5-2184（2 2）影響離子交換選擇性的因素）影響離子交換選擇性的因素va.a.水

39、合離子半徑水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；：半徑越小，親和力越大；vb.b.離子化合價(jià)：離子化合價(jià)：高價(jià)離子易于被吸附；高價(jià)離子易于被吸附；vc.c.溶液溶液pHpH：影響交換基團(tuán)和交換離子的解離程度，但影響交換基團(tuán)和交換離子的解離程度，但不影響交換容量；不影響交換容量；vd.d.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度：越低越好；：越低越好；ve.e.有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑：不利于吸附；：不利于吸附；vf.f.交聯(lián)度、膨脹度、分子篩交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯(lián)度小，膨脹度大，吸附量減少；篩分能力增大；交聯(lián)度小，膨脹度大，吸附量減少； vg.g.樹脂與粒子間的輔助

40、力樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；和范德華力等輔助力；2022-5-2185對(duì)于強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，當(dāng)與金屬離子對(duì)于強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，當(dāng)與金屬離子M M+ +接觸時(shí)接觸時(shí): : HMSORMHSOR33選擇性系數(shù)值的大小選擇性系數(shù)值的大小表示樹脂對(duì)表示樹脂對(duì)金屬離子金屬離子M M+ +的親和的親和力的大小力的大小，它與，它與樹脂的類型樹脂的類型、離子的性質(zhì)與濃度以離子的性質(zhì)與濃度以及溶液的組成及溶液的組成有關(guān)有關(guān)。 為什么金屬離子為什么金屬離子(Na(Na+ +、K K+ +等等) )可以吸附在可以吸附在H-H-型強(qiáng)型強(qiáng)酸型陽離子交

41、換柱上，而后又可以用酸型陽離子交換柱上，而后又可以用HClHCl來再生強(qiáng)來再生強(qiáng)酸型陽離子交換柱酸型陽離子交換柱? ?2022-5-2186 實(shí)驗(yàn)表明，在常溫下，當(dāng)離子濃度不大時(shí)，強(qiáng)酸型陽實(shí)驗(yàn)表明，在常溫下，當(dāng)離子濃度不大時(shí)，強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂樹脂親和力大小有如下一些規(guī)律。離子交換樹脂樹脂親和力大小有如下一些規(guī)律。(1)(1)金屬離子的價(jià)數(shù)增大，親和力增大。如金屬離子的價(jià)數(shù)增大，親和力增大。如 NaNa+ + Ca Ca2+2+ Al Al3+3+ Th Th4+4+(2)(2)離子價(jià)數(shù)相同時(shí)，親和力大小隨著水合離子半徑的離子價(jià)數(shù)相同時(shí)，親和力大小隨著水合離子半徑的減少而增大。減少而增大。如

42、如1 1價(jià)離子：價(jià)離子：LiLi+ + H H+ + Na Na+ + NH NH4 4+ + K K+ + Rb Rb+ + Cs Cs+ + Tl Tl+ + Ag Ag+ +；2 2價(jià)離子：價(jià)離子：MgMg2+2+ Zn Zn2+2+ Co Co2+2+ Cu Cu2+2+ Cd Cd2+2+ Ni Ni2+2+ CaCa2+2+ Sr Sr2+2+ Pb Pb2+2+ Ba Ba2+2+。2022-5-21874.離子交換柱層析操作離子交換柱層析操作v樹脂的選擇樹脂的選擇v樹脂的預(yù)處理及轉(zhuǎn)型樹脂的預(yù)處理及轉(zhuǎn)型v裝柱及平衡（要保持均勻、無氣泡和斷層裝柱及平衡（要保持均勻、無氣泡和斷層v上

43、樣吸附：上樣吸附：v洗滌與洗脫：改變洗滌與洗脫：改變pH或離子強(qiáng)度或離子強(qiáng)度2022-5-21884.14.1樹脂的選擇樹脂的選擇（1 1）樹脂基本要求：）樹脂基本要求： 交換容量大、選擇性好、物理化學(xué)性質(zhì)交換容量大、選擇性好、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度好等穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度好等（2 2）樹脂類型的選擇）樹脂類型的選擇陰、陽離子交換樹脂的選擇被分離陰、陽離子交換樹脂的選擇被分離物所帶的電荷情況及穩(wěn)定性物所帶的電荷情況及穩(wěn)定性a.a.（+ +）陽）陽b.b.（- -）陰）陰2022-5-2189目的物酸堿性、樹脂離解狀態(tài)及選擇目的物酸堿性、樹脂離解狀態(tài)及選擇性、洗脫性、洗脫a.目的物具有較強(qiáng)的酸（或

44、堿）性目的物具有較強(qiáng)的酸（或堿）性 選弱堿（酸）性陰（或陽）離子交換樹脂選弱堿（酸）性陰（或陽）離子交換樹脂b.b.目的物具有較弱的酸（或堿）性目的物具有較弱的酸（或堿）性選強(qiáng)堿（酸）性陰（或陽）離子交換樹脂選強(qiáng)堿（酸）性陰（或陽）離子交換樹脂c.c.生物樣品習(xí)慣采用弱性樹脂生物樣品習(xí)慣采用弱性樹脂d.d.強(qiáng)樹脂，選擇性小，應(yīng)用廣泛；強(qiáng)樹脂，選擇性小，應(yīng)用廣泛； 弱樹脂，選擇性好，應(yīng)用窄弱樹脂，選擇性好，應(yīng)用窄2022-5-2190離子交換樹脂離子交換樹脂反離子反離子的選擇的選擇取決于結(jié)合力、實(shí)際需求取決于結(jié)合力、實(shí)際需求陽離子陽離子Na+、H+、NH4+；陰離子陰離子Cl-、OH-、一般來說

45、：一般來說：a.強(qiáng)陽強(qiáng)陽離子交換樹脂離子交換樹脂 Na+、H+ 弱陽弱陽離子交換樹脂離子交換樹脂 Na+b.強(qiáng)陰強(qiáng)陰離子交換樹脂離子交換樹脂 Cl-、OH- 弱陰弱陰離子交換樹脂離子交換樹脂 Cl-如：去水中如：去水中Ca2+ 鏈霉素（為一強(qiáng)堿性生物活性藥物，鏈霉素（為一強(qiáng)堿性生物活性藥物，pH4-5穩(wěn)定）穩(wěn)定）弱陽弱陽離子交換樹脂離子交換樹脂 Na+、中性溶液中吸附、酸溶液洗脫、中性溶液中吸附、酸溶液洗脫2022-5-21914.2樹脂預(yù)處理及轉(zhuǎn)型v物理處理：物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒；勻的樹脂顆粒；v化學(xué)處理：化學(xué)處理：轉(zhuǎn)型（氫型或鈉

46、型）轉(zhuǎn)型（氫型或鈉型） 陽離子樹脂陽離子樹脂 酸酸堿堿酸酸 陰離子樹脂陰離子樹脂 堿堿酸酸堿堿 最后以去離子水或緩沖液平衡最后以去離子水或緩沖液平衡2022-5-21924.3上樣吸附選擇性吸附（目的物結(jié)合力大，雜質(zhì)結(jié)合力?。┻x擇性吸附（目的物結(jié)合力大，雜質(zhì)結(jié)合力?。゛.a.使目的物帶上與反離子同類型的電荷且數(shù)量使目的物帶上與反離子同類型的電荷且數(shù)量大大b.b.使雜質(zhì)帶上與反離子相反的電荷或不帶電。使雜質(zhì)帶上與反離子相反的電荷或不帶電。2022-5-21934.4洗滌和洗脫v洗滌洗滌除雜除雜v洗脫洗脫離子交換完成后，將樹脂吸附的物質(zhì)重新離子交換完成后，將樹脂吸附的物質(zhì)重新轉(zhuǎn)入溶液的方法轉(zhuǎn)入溶液

47、的方法v洗脫方法洗脫方法（1）改變?nèi)芤海└淖內(nèi)芤簆H值值（2）改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度）改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度v洗脫方式：洗脫方式： 階段洗脫與梯度洗脫；動(dòng)態(tài)與靜態(tài)洗脫階段洗脫與梯度洗脫；動(dòng)態(tài)與靜態(tài)洗脫2022-5-2194Elution (ml)Protein (mg/ml)NaCl (mol/L)00.20.40.60.800.20.40.60.8104080120160200240Na ClProtein恒定洗脫恒定洗脫 2022-5-2195Volume (ml)Protein (mg/ml)NaCl (mol/L)00.10.20.30.400.20.40.60.80408012016020024

48、0NaClProtein分步洗脫分步洗脫 2022-5-2196Volume (ml)Protein（mg/ml)NaCl (mol/L)00.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.60.704080120160200240ProteinNaCl (c) (c) 梯度洗脫梯度洗脫2022-5-2197 洗脫一般采取分步淋洗或梯度淋洗，其中洗脫一般采取分步淋洗或梯度淋洗，其中分步洗脫，是指先采用洗脫能力較弱的溶液，分步洗脫，是指先采用洗脫能力較弱的溶液，使易洗脫組分流出，然后依次使用洗脫能力更使易洗脫組分流出，然后依次使用洗脫能力更強(qiáng)的溶液，洗脫較難洗脫的組分。強(qiáng)的

49、溶液，洗脫較難洗脫的組分。04080120160200 240 280320NaNO30.5mol/L2mol/L NaNO3Cl-Br-I-體 積 /mL圖 5-3 Cl-， Br-和 I-的 分 步 淋 洗濃度2022-5-21984.5樹脂再生v（1）定義：）定義： 是指使離子交換樹脂重新具有交換能力的過程是指使離子交換樹脂重新具有交換能力的過程v（2）方法：）方法： 酸性陽離子樹脂酸性陽離子樹脂 酸酸-堿堿-酸酸-緩沖溶液淋洗緩沖溶液淋洗 堿性陰離子樹脂堿性陰離子樹脂 堿堿-酸酸-堿堿-緩沖溶液淋洗緩沖溶液淋洗v（3）方式有：順流再生和逆流再生）方式有：順流再生和逆流再生2022-5-

50、21994.6離子交換應(yīng)用實(shí)例v離子交換法提取蛋白質(zhì)、氨基酸離子交換法提取蛋白質(zhì)、氨基酸v水處理（軟水、去離子水的制備）水處理（軟水、去離子水的制備）v抗生素的提取抗生素的提取v肝素的提取肝素的提取2022-5-21100(1)水的凈化水的凈化脫鹽脫鹽陽柱塔除氣陰柱混合柱去 離 子 水原 水原 水純 水返 洗酸堿排 出 液空 氣混合樹脂陰陽陰陽排出液懸浮混合圖 6-1 復(fù) 合 床 式 離 子 交 換 處 理 水 流 程 示 意 圖圖 6-2 混 合 床 式 處 理 水 示 意 圖 據(jù) 統(tǒng) 計(jì) ， 約 80%到 90%的 離 子 交 換 樹 脂 用 于 水 的凈 化 處 理 ， 其 中 兩 種 常 見 的 脫 鹽 如 下 圖 所 示 。2022-5-21101(2)氨基酸的分離氨基酸的分離 采用交換樹脂為采用交換樹脂為Dowo50,柱長柱長100cm，柱，柱徑徑0.9cm，Na+型樹脂淋洗劑采用型樹脂淋洗劑采用pH值逐步提高的值逐步提高的檸檬酸鈉緩沖液。檸檬酸鈉緩沖液。 （其中（其中Asp天冬氨酸，天冬氨酸，Thr蘇氨酸，蘇氨酸，Ser絲氨酸，絲氨酸，Glu谷氨酸，谷氨酸，Pro脯氨酸，脯氨酸，Gly