1、實驗原理實驗原理1 1、直接凝集反應(yīng)（原理）、直接凝集反應(yīng)（原理）將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的顆粒狀載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用。在小的顆粒狀載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用。在有電介質(zhì)存在的適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反有電介質(zhì)存在的適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。用做載體的微球可用天然的微粒性物質(zhì)，如人（應(yīng)。用做載體的微球可用天然的微粒性物質(zhì)，如人（O O型）和型）和動物（綿羊、家兔等）的紅細胞、活性炭顆?；蚬杷徜X顆粒等；動物（綿羊、家兔等）的紅細胞、活性炭顆粒或硅

2、酸鋁顆粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上的等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上的抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性比直接凝集反應(yīng)高得多。比直接凝集反應(yīng)高得多。+（二）材（二）材 料料（三）方（三）方 法（血型測定）法（血型測定）操作流程（三）方（三）方 法（法（細菌菌型測定）1.1.取一塊清潔取一塊清潔載玻片載玻片，用記號筆劃上，用記號筆劃上記號記號，在一側(cè)滴加，在一側(cè)滴加標(biāo)

3、標(biāo)準(zhǔn)的診斷血清準(zhǔn)的診斷血清一滴一滴, ,另一側(cè)滴加另一側(cè)滴加一滴生理鹽水一滴生理鹽水。2.2.用接種環(huán)無菌操作取適量的待測細菌用接種環(huán)無菌操作取適量的待測細菌, ,分別與標(biāo)準(zhǔn)診斷分別與標(biāo)準(zhǔn)診斷血清和生理鹽水混均。血清和生理鹽水混均。3.3.靜置室溫下數(shù)分鐘后，在白色背景下肉眼觀察，也可顯靜置室溫下數(shù)分鐘后，在白色背景下肉眼觀察，也可顯微鏡觀察。微鏡觀察。注意事項：注意事項：（1 1）生理鹽水、診斷血清要適量；）生理鹽水、診斷血清要適量；（2 2）待檢菌為腸道致病菌，注意無菌操作，玻片用后放）待檢菌為腸道致病菌，注意無菌操作，玻片用后放入消毒缸內(nèi)；入消毒缸內(nèi)；（3 3）用接種環(huán)取待檢菌時，不要挑

4、取瓊脂；待檢菌與生）用接種環(huán)取待檢菌時，不要挑取瓊脂；待檢菌與生理鹽水、診斷血清混勻時，不要涂得太寬，否則影響結(jié)理鹽水、診斷血清混勻時，不要涂得太寬，否則影響結(jié)果觀察。果觀察。（四）結(jié)果判斷結(jié)果分析結(jié)果分析人類人類ABOABO血型抗原是根據(jù)紅血型抗原是根據(jù)紅細胞膜上有無特異性抗原細胞膜上有無特異性抗原（凝集原）（凝集原）A A或或B B來劃分的來劃分的血液類型系統(tǒng)，將血型分血液類型系統(tǒng)，將血型分為為A A型、型、B B型、型、ABAB型、型、OO型四種。型四種。RBC膜膜抗原抗原無無血型血型ABABO抗抗A、抗、抗B)無無抗抗A抗抗B(血漿抗體血漿抗體 BAA和和B二 、沉淀反應(yīng)（雙向瓊脂擴散

5、試驗） 又稱雙向瓊脂擴散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)又稱雙向瓊脂擴散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。的一種沉淀反應(yīng)。 瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)通過，分子的擴散作用使分別兩處的抗原抗體通過，分子的擴散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀，可觀察到沉淀線。相遇，比例合適時形成沉淀，可觀察到沉淀線。 沉淀線的特征與位置取決于抗原分子的大沉淀線的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構(gòu)、擴散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體小、結(jié)構(gòu)、擴散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體存在多種體系時，會出現(xiàn)多條沉淀線。存在多種體系時，會出現(xiàn)多條沉淀線。 因此可用來檢查抗原和免

6、疫血清的特異性、因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點，因而應(yīng)用純度或濃度比較抗原之間的異同點，因而應(yīng)用范圍較廣。范圍較廣。（二）材料（二）材料玻片、瓊脂糖、抗原、抗體（玻片、瓊脂糖、抗原、抗體（0；1:2； 1:4； 1:8； 1:16）、微量加樣器、滴管、濕盒、）、微量加樣器、滴管、濕盒、水浴箱等。水浴箱等。（三） 操作步驟每孔加入每孔加入抗原抗原/ /抗體抗體10l10l注意事項注意事項 （1）打孔時，不要將瓊脂劃破； （2）加樣時，不要溢出孔外； （3）加樣用的吸管不要混用。Ag01/11/21/41/81/16AbAbAbAbAb（四）（四） 結(jié)果記錄結(jié)

7、果記錄用膠體金顆粒標(biāo)記已知抗體或抗原，檢測標(biāo)本中未用膠體金顆粒標(biāo)記已知抗體或抗原，檢測標(biāo)本中未知抗原或抗體的技術(shù)。知抗原或抗體的技術(shù)。（一）原理（一）原理以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細管作用使標(biāo)本中的抗待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標(biāo)記物的顯色（膠體金標(biāo)記物的顯色（20nm20nm的膠體金顆粒呈磚紅的膠體金顆粒呈磚紅色）達到檢測目的。色）達到檢測目的。 根據(jù)檢測裝置的不同，可分為膠體金斑點滲濾試根據(jù)檢測裝置的不同，可

8、分為膠體金斑點滲濾試驗和膠體金斑點免疫層析試驗。驗和膠體金斑點免疫層析試驗。膠體金斑點免疫層析試驗?zāi)z體金斑點免疫層析試驗將各種反應(yīng)試劑將各種反應(yīng)試劑( (抗體抗體) )附著在硝酸纖維素膜條上，檢測時附著在硝酸纖維素膜條上，檢測時將待檢標(biāo)本加在膜條的一端，使膜條上的膠體金標(biāo)記抗體將待檢標(biāo)本加在膜條的一端，使膜條上的膠體金標(biāo)記抗體溶解后，與標(biāo)本中的待測物質(zhì)反應(yīng)形成溶解后，與標(biāo)本中的待測物質(zhì)反應(yīng)形成ICIC，并通過毛細管，并通過毛細管作用在膜條上滲濾、移行，再與膜上另一種抗體反應(yīng)，再作用在膜條上滲濾、移行，再與膜上另一種抗體反應(yīng)，再后被截留、聚集在膜條的一定區(qū)域，形成有顏色的反應(yīng)條后被截留、聚集在膜

9、條的一定區(qū)域，形成有顏色的反應(yīng)條帶。帶。臨床上常用的有膠體金早孕診斷試劑條臨床上常用的有膠體金早孕診斷試劑條 用鼠抗用鼠抗-HCG-HCG單克隆抗體和兔抗鼠單克隆抗體和兔抗鼠1gG1gG多克隆抗體分多克隆抗體分別固相硝酸纖維膜和膠體金標(biāo)記的抗別固相硝酸纖維膜和膠體金標(biāo)記的抗-HCG-HCG單克隆抗體及單克隆抗體及其他試劑制成，應(yīng)用層析式雙抗體夾心法的原理檢測尿液其他試劑制成，應(yīng)用層析式雙抗體夾心法的原理檢測尿液中中HCGHCG，用于妊娠早期輔助診斷。，用于妊娠早期輔助診斷。C區(qū)區(qū)T區(qū)區(qū)吸水區(qū)吸水區(qū) 抗小鼠抗小鼠IgG抗體抗體(固定固定)抗抗-HCG抗體抗體(固定固定)膠體金膠體金-抗抗 -HC

10、G抗體抗體(小鼠小鼠IgG,游離游離)下端浸入尿液下端浸入尿液試紙條試紙條HCGC區(qū)區(qū)T區(qū)區(qū)抗抗-HCG + HCG + 膠體金膠體金-抗抗-HCGT區(qū)紅線區(qū)紅線C區(qū)紅線區(qū)紅線抗小鼠抗小鼠IgG + 膠體金膠體金-抗抗-HCG陽性陽性陰性陰性無效無效HCG(+) HCG(-)結(jié)論結(jié)論:實驗結(jié)果實驗結(jié)果(3(3種可能種可能) )（五）結(jié)果分析（五）結(jié)果分析人絨毛膜促性腺激素（人絨毛膜促性腺激素（HCGHCG）是受孕婦女體）是受孕婦女體內(nèi)產(chǎn)生的一種糖蛋白類激素，在受孕婦女內(nèi)產(chǎn)生的一種糖蛋白類激素，在受孕婦女血液和尿液中大量存在。卵子受精后第血液和尿液中大量存在。卵子受精后第6 6天天開始分泌開始分泌HCGHCG，一般，一般