1、食品安全與衛(wèi)生學(xué)實驗設(shè)計（09級食品質(zhì)量與安全專業(yè)）分組號:7設(shè)計者:魏俊瀟參與者:鄧捷冷嘉璐李笑曼時 間:12.05.14實驗一 “鮮肉的質(zhì)量評價”綜合實驗設(shè)計內(nèi)容：以市售雞肉樣品為目標(biāo)，參考課件、食品專業(yè)實驗指導(dǎo)教材、肉品檢驗相關(guān)教材、相關(guān)食品檢測國家標(biāo)，主要針對取樣方法、感官檢驗、理化分析（pH計測定酸度、硫酸銅法測球蛋白）、微生物檢驗（大腸菌群國標(biāo)法1/試管法）、獸藥的免疫學(xué)快速檢測（環(huán)丙沙星的間接競爭ELISA檢測方法）等內(nèi)容，從實驗準(zhǔn)備、試劑配制、到完成實驗的全過程設(shè)計一個詳盡合理的實驗流程，具體順序不做要求，但應(yīng)具體、有可操作性，并在規(guī)定的時間內(nèi)完成上述全部內(nèi)容，給出實驗結(jié)果和綜

2、合判定。（勿刪）一、實驗?zāi)康谋緦嶒災(zāi)M工廠化生產(chǎn)過程，從原料肉的驗收、品質(zhì)評定、產(chǎn)品加工到產(chǎn)品的感官評價，確定產(chǎn)品種類，提出實驗設(shè)計方案并實施，從中掌握主要肉類產(chǎn)品的基本生產(chǎn)工藝和加工制作方法，以提高解決實際問題的能力。二、實驗內(nèi)容1. 取樣方法先將檢樣進行表面消毒（沸水內(nèi)燙3s5s，或燒灼消毒），再用無菌剪子剪取檢樣深層肌肉25g，放入滅菌乳缽內(nèi)用滅菌剪子剪碎后，加滅菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入滅菌水225mL，混勻，即為110稀釋液。2. 感官檢驗 GB/T 5009.44-2003原理：肉在發(fā)生腐敗變質(zhì)時，會發(fā)生改變色澤、氣味和硬度的現(xiàn)象，并形成氣味。方法：雞肉的感官檢驗包括看、觸、嗅

3、和剖四部分。分別從顏色、氣味等方面入手。1. 視覺檢驗：自然光線下，觀察肉的表面狀態(tài)和色澤，以及有無血塊、霉斑污染物，然后用刀順肉纖維方向切開，觀察斷面色澤。2. 嗅覺檢查：常溫下嗅其氣味。3. 硬度檢測：用食指按壓肉表面，觸感其硬度指壓凹陷的速度，或是否恢復(fù)，表面干濕及是否發(fā)粘。3. 理化檢驗3.1 肉酸堿度（pH值）測定原理：肉類腐敗是蛋白質(zhì)分解成氨和胺等堿性物質(zhì)，使肉的酸度降低，肉的pH值變化在一定程度上反映了肉的新鮮度。 儀器與藥品：天平、刀、250mL燒杯、100mL三角瓶、100mL量筒、10mL燒杯、溫度計、濾紙、酸度計、pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。 方法：用酸度計測定肉浸液的pH值。.1

4、儀器校準(zhǔn)：（1）將“pHmv”開關(guān)撥到pH位置。（2）打開電源開頭指示燈亮，預(yù)熱30分鐘。（3）取下放蒸餾水的小燒杯，并用濾紙輕輕吸去玻璃電極上的多余水珠。在小燒杯內(nèi)入選擇好的，已知pH的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液。將電極浸入。注意使玻璃電極端部小球和甘汞電極的毛細(xì)孔浸在溶液中。輕輕搖動小燒杯使電極所接觸的溶液均勻。（4）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的pH，將量程開關(guān)擰到07或714處。（5）調(diào)節(jié)控溫鈕，使旋鈕指示的溫度與室溫同。（6）調(diào)節(jié)零點，使指針指在pH7處。（7）輕輕按下或稍許轉(zhuǎn)動讀數(shù)開關(guān)使開關(guān)卡住。調(diào)節(jié)定位旋鈕，使指針恰好指在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的pH數(shù)值處。放開讀數(shù)開關(guān)，重復(fù)操作，直至數(shù)值穩(wěn)定為止。（8）校整后，切勿再

5、旋動定位旋鈕，否則需重新校整。取下標(biāo)準(zhǔn)液小燒杯，用蒸餾水沖洗電極。 .2 測定：（1）將電極上多余的水珠吸干或用被測溶液沖洗二次，然后將電極浸入被測溶液中，并輕輕轉(zhuǎn)動或搖動小燒杯，使溶液均勻接觸電極。（2）被測溶液的溫度應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液的溫度相同。（3）校整零位，按下讀數(shù)開關(guān)，指針?biāo)傅臄?shù)值即是待測液的pH。若在量程pH07范圍內(nèi)測量時指針讀數(shù)超過刻度，則應(yīng)將量程開關(guān)置于pH714處再測量。（4）測量完畢，放開讀數(shù)開關(guān)后，指針必須指在pH7處，否則重新調(diào)整。（5）關(guān)閉電源，沖洗電極，并按照前述方法浸泡。.3 評定：評定標(biāo)準(zhǔn)見下表：pH值范圍評定結(jié)果pH1值6.06.5正常<5.9PSE肉

6、特征之一pH24值5.45.5正常>6.5DFD肉特征之一3.2 球蛋白沉淀實驗原理：肌肉中的球蛋白在水溶液中的溶解度隨pH值升高而增大在肉的腐敗過程中，pH值升高。蛋白質(zhì)在堿性溶液中能與重金屬離子形成沉淀。因此，可根據(jù)形成沉淀的情況判斷肉的新鮮度。 儀器與藥品：10%的硫酸銅溶液肉浸液的制備：將肉樣搗碎，混勻，稱取10.0g于錐形瓶內(nèi)，加入100mL蒸餾水，搖勻，浸漬30min，過濾即得到待測肉浸液。3.2.2 測定：在一支5mL試管中加入2mL肉浸液，在另一支試管中加入2mL蒸餾水作為對照。然后分別加入5滴10%硫酸銅溶液，充分振蕩后觀察。3.2.3 判斷：試管中液體呈淡藍色，并且透

7、明，是新鮮肉，液體輕度渾濁或少量混懸物為次鮮肉，液體渾濁并有白色沉淀為變質(zhì)。4 微生物檢驗大腸菌群國標(biāo)法4.1 原理：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。最可能數(shù)，MPN基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。4.2設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱：36±1 、冰箱：25、恒溫水浴箱：46±1、天平：感量0.1g、均質(zhì)器、無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶：容量500 mL、pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。4.3 培養(yǎng)

8、基和試劑4.3.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g；氯化鈉5.0g；乳糖5.0g；磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.75 g；磷酸二氫鉀(K2HPO4)2.75g；月桂基硫酸鈉0.1g；蒸餾水1000mL；pH 6.8±0.2；制法：將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121高壓滅菌15min。4.3.2煌綠乳糖膽鹽肉湯“成分：蛋白胨10.0g；乳糖10.0g；牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL；0.1%煌綠水溶液13.3mL；蒸餾水800mL；pH 7.2±0.1；制法：將蛋白胨、乳糖溶于約500

9、mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補足到1000mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121高壓滅菌15min。4.3.3磷酸鹽緩沖液：成分：磷酸二氫鉀(K2HPO4)34.0g；蒸餾水500mL；pH 7.2。制法：貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1

10、000mL，分裝于適宜容器中，121高壓滅菌15min。無菌生理鹽水:稱取8.5氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 高壓滅菌15 min。無菌1 mol/L NaOH：稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121高壓滅菌15min。無菌1 mol/L HCl：移取濃鹽酸90mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，121高壓滅菌15min。4.4 檢驗程序：4.5 操作步驟樣品的稀釋a.稱取25g樣品,放入盛有225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min10000r/min 均質(zhì)1min2min,或放入盛有225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式

11、均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。b.樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時分別用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)節(jié)。c.用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。d.根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。初發(fā)酵試驗：每個樣品，

12、選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36±1培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36±1培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告按上

13、述確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。 4.6 報告稀釋度1:1001:10001:10000CFU/g平均值第一個樣品第二個樣品5 環(huán)丙沙星的間接競爭ELISA檢測方法5.1 原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)

14、本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可用于定性或定量分析。5.2 方法5.2.1 雞肉樣品處理適量雞肉（去除脂肪），剪碎后放入組織研磨器中，制成勻漿狀；稱取1g，移入5或15ml離心管內(nèi)；加4mlPBS緩沖液，蓋嚴(yán)，劇烈振蕩10min；4000r/min離心10min，取上清于新管內(nèi)為預(yù)處理樣品溶液；取100L預(yù)處理樣品溶液/或試樣溶液，加100L保溫液，混勻后取50L用于檢測；樣品稀釋倍數(shù)按10倍計。 樣品脫脂將預(yù)處理樣品溶液加入等量水飽和的正己烷，充分振蕩后，4000r/min離心5min，棄去上層溶液及油脂，在下層清液中再加入水飽和的正己烷重復(fù)脫脂一次。最后小心吸去上層溶液及油脂，下層清液即為試樣

15、溶液 步驟：1) 用包被液將BSA-CPFX稀釋至1ug/mL包被酶標(biāo)板，100µl/孔, 4，過夜或37，2h；2) 用pH 7.4的PBST洗滌三次，250uL左右，手搖，每次45s；3) 環(huán)內(nèi)沙星腹水抗體（1mg/mL）用保溫液6萬倍稀釋；環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/mL）用保溫液按64、32、16、8、4、2、1、0 ng/ml稀釋；4) 先將各濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入一列孔中（50ul/孔），再統(tǒng)一加稀釋的腹水（50ul/孔），混勻后，37，45min；5) 用PBST洗滌三次，同上；6) 酶標(biāo)羊抗小鼠IgG（HRP-羊抗鼠IgG，二抗）用保溫液1：5000倍稀釋，每孔100µ

16、l，37溫育45min；用PBST洗滌四次，同上；7) 加入底物溶液，每孔100µl，37溫育20min，每孔滴加50µl終止液，酶聯(lián)檢測儀測定OD490值。 數(shù)據(jù)分析以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑制率（A標(biāo)/A0）×%為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)曲線的具體情況選擇最佳的擬合模型。其中A0為零標(biāo)準(zhǔn)品孔OD值，A標(biāo)為各濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔OD值。實驗二“生鮮牛乳質(zhì)量評價”綜合實驗設(shè)計內(nèi)容：以市售生鮮乳樣品為目標(biāo)，參考課件、食品專業(yè)實驗指導(dǎo)教材、乳品檢驗相關(guān)教材、相關(guān)食品檢測國家標(biāo)，主要針對取樣方法、感官檢驗、理化分析（相對密度、酒精實驗法測酸度）、微生物檢驗（菌落總數(shù)

17、、大腸菌群國標(biāo)法2/平板法、美藍還原試驗）、抗生素檢測（嗜熱鏈球菌抑制法/TTC法，乳酸鏈球菌由實驗室提供）、摻假乳實驗（摻淀粉、豆?jié){、堿、鹽、甲醛等，可做驗證實驗）等內(nèi)容，從實驗準(zhǔn)備、試劑配制、到完成實驗的全過程設(shè)計一個詳盡合理的實驗流程，具體順序不做要求，但應(yīng)具體、有可操作性，并在規(guī)定的時間內(nèi)完成上述全部內(nèi)容，給出實驗結(jié)果和綜合判定。一、實驗?zāi)康?了解生鮮乳樣的采集和保存方法，掌握乳新鮮度、密度、酸度、微生物含量、抗生素含量、摻假的檢驗方法。二、乳樣的采集和保存生鮮牛乳是指從正常飼養(yǎng)的、無傳染病和乳房炎的健康母牛乳房內(nèi)擠出的正常乳。采樣前必須充分?jǐn)嚢枋够旌暇鶆?。采用直?0mm鍍鎳金屬管或

18、玻璃管采樣，從不同深度采樣。采樣量若只測脂肪和酸度時50mL即可，若做全面分析取200300mL，樣品應(yīng)做兩個平行。快速冷卻保存： 05，12天；不做細(xì)菌學(xué)檢驗時可加防腐劑保存：每100mL乳加福爾馬林12滴可保存1015天；每100mL乳加H2O2 23滴，密閉，可保存610天。三、感官檢驗1. 檢驗方法1.1 色澤：白瓷皿中，檢查是否帶紅色、綠色或明顯的黃色；1.2氣味：加熱后，嗅其氣味；1.3滋味：品嘗；1.4組織狀態(tài)：燒杯中，靜止1h，小心倒入另一燒杯，看前一燒杯底是否有沉淀和絮狀物，再取一滴于大拇指上，檢查是否粘滑。1.5 雜質(zhì)：是否有豆渣、牛糞、昆蟲等雜質(zhì)。2. 判定標(biāo)準(zhǔn)色澤組織狀

19、態(tài)氣味滋味評定結(jié)果為乳白色或稍帶微黃色呈均勻的流體，無沉淀、凝塊和機械雜質(zhì)，無粘稠和濃厚現(xiàn)象具有乳特有的乳香味，無其他任何異味具有鮮乳獨具的純香味，滋味可口而稍甜，無其他任何異常滋味良質(zhì)鮮乳色澤較良質(zhì)鮮乳為差，白色中稍帶青色呈均勻的流體，無凝塊，但可見少量微小的顆粒，脂肪聚粘表層呈液化狀態(tài)乳中固有的香味稍使或有異味有微酸味(表明乳已開始酸敗)，或有其他輕微的異味次質(zhì)鮮乳呈淺粉色或顯著的黃綠色，或是色澤灰暗呈稠而不勻的溶液狀，有乳凝結(jié)成的致密凝塊或絮狀物有明顯的異味，如酸臭味、牛糞味、金屬味、魚腥味、汽油味等有酸味、咸味、苦劣質(zhì)鮮乳四、理化分析1 相對密度1.1 原理使用密度計檢測試樣，根據(jù)讀數(shù)

20、經(jīng)查表可得相對密度的結(jié)果。乳的密度是指在20時，一定體積的質(zhì)量與4同體積水的質(zhì)量之比。乳的比重是指在15時，一定體積的重量與同溫同體積水的重量之比。同溫度下：比重 密度 = 0.002乳的密度和比重均可用乳稠計測定，乳稠計有20/4（密度計）和15/15（比重計）兩種。本實驗中所用為乳密度計。乳密度（420）與乳稠計度數(shù)的關(guān)系式為：乳稠計度數(shù)=（420讀數(shù)-1.000）×1000例：乳密度（420）1.031，則其乳密度度數(shù)為31°，比重度數(shù)為31° + 2° = 33°1.2 儀器和設(shè)備 密度計：20 /4 ；玻璃圓筒或 200 mL250

21、mL 量筒：圓筒高度應(yīng)大于密度計的長度，其直徑大小應(yīng)使在沉入密度計時其周邊和圓筒內(nèi)壁的距離不小于 5 mm。 1.3 分析步驟取混勻并調(diào)節(jié)溫度為 10 25 的試樣，小心倒入玻璃圓筒內(nèi)，勿使其產(chǎn)生泡沫并測量試樣溫度。小心將密度計放入試樣中到相當(dāng)刻度 30°處，然后讓其自然浮動，但不能與筒內(nèi)壁接觸。靜置 2 min3 min，眼睛平視生乳液面的高度，讀取數(shù)值。根據(jù)試樣的溫度和密度計讀數(shù)查表換算成 20 時的度數(shù)。 1.4 測定值校正 若乳溫不是20時，則乳稠計讀數(shù)應(yīng)進行校正。1）計算法 溫度每升高或降低1時，乳密度在乳稠計刻度上減小或增加0.0002°2）查表法 根據(jù)牛乳溫度

22、和乳稠計讀數(shù)，查牛乳溫度換算見表5-1。將乳稠計讀數(shù)換算成20時的度數(shù)。1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)生鮮乳 特級1.030；一級1.029；二級1.028；消毒乳 1.0281.032表5-1 牛乳溫度換算表乳稠計度數(shù)鮮乳溫度（）1011121314151617181920212223242525262728293031323334353623.324.225.126.026.927.928.829.330.731.732.633.523.524.425.326.127.128.129.230.231.131.932.833.523.624.525.426.327.328.329.230.231.132.

23、133.134.023.724.725.626.527.528.529.430.431.332.333.334.323.924.925.726.627.628.629.630.631.532.533.534.524.025.025.926.827.828.829.830.731.732.733.734.724.225.226.127.028.029.030.031.032.033.034.034.924.425.426.327.328.329.330.331.232.233.234.235.224.625.626.527.528.529.530.531.532.533.534.535.624.

24、825.826.827.828.829.830.831.832.833.834.735.725.026.027.028.029.030.031.032.033.034.035.036.025.226.227.228.229.230.231.232.333.334.335.336.225.426.427.528.529.530.531.532.533.534.435.536.525.526.627.728.729.730.731.732.833.834.835.836.725.826.827.929.030.031.032.033.034.135.136.137.026.027.028.129.

25、230.231.232.233.334.335.336.337.32 酒精實驗法測酸度酒精試驗法 取12 mL 乳于試管中，加入等量的中性酒精（68%或70%或72%的酒精），迅速充分混合，如有絮狀物（蛋白沉淀）出現(xiàn)，即為酒精陽性乳，否則為酒精陰性乳。出現(xiàn)絮狀物表示酸度高，乳的酸度與酒精濃度見表5-2表5-2 乳的酸度與酒精濃度關(guān)系酒精濃度（%）出現(xiàn)絮狀物的酸度68707220 oT19 oT18 oT判定標(biāo)準(zhǔn)生鮮乳 特級18 oT；一級19 oT；二級20 oT；消毒乳18 oT2.1 原理以酚酞為指示液，用0.1000 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定100 g試樣至終點所消耗的氫氧化鈉溶液

26、體積，經(jīng)計算確定試樣的酸度。2.2 試劑和材料除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T 6682規(guī)定的三級水，中性乙醇乙醚混合液：取等體積的乙醇、乙醚混合后加3 滴酚酞指示液，以氫氧化鈉溶液（4g/L）滴至微紅色，氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（NaOH）：0.1000 mol/L，酚酞指示液：稱取0.5 g 酚酞溶于75 mL 體積分?jǐn)?shù)為95 %的乙醇中，并加入20mL水，然后滴加氫氧化鈉溶液（8.1）至微粉色，再加入水定容至100 mL。2.3 儀器和設(shè)備天平：感量為1 mg。15.2 電位滴定儀， 滴定管：分刻度為0.1 mL，水浴鍋。2.4 分析步驟稱取10 g（精確到0.00

27、1 g）已混勻的試樣，置于 150 mL 錐形瓶中，加 20 mL 新煮沸冷卻至室溫的水，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（14.2）電位滴定至pH 8.3 為終點；或于溶解混勻后的試樣中加入2.0 mL 酚酞指示液（14.3），混勻后用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（14.2）滴定至微紅色，并在30 s 內(nèi)不褪色，記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)，代入公式（2）中進行計算。五、微生物檢驗1. 菌落總數(shù)1.1 樣品的稀釋稱取 25 mL 樣品置盛有 225 mL無菌水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min，制成 1:10 的樣品勻液。1.2 用 1 mL 無菌吸管

28、或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩慢注于盛有 9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。1.3 按1.2操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用 1 次 1 mL 無菌吸管或吸頭。1.4 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇 2 個3 個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行 10 倍遞增稀釋時，吸取 1 mL 樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取 1 mL 空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。1.5 及時將 15

29、mL20 mL 冷卻至 46 的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于 46 ±1恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。1.6 培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ±1培養(yǎng) 48 h±2 h。水產(chǎn)品 30 ±1培養(yǎng) 72 h±3 h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約 4 mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按條件進行培養(yǎng)。1.7 菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。選

30、取菌落數(shù)在 30 CFU300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于 30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于 300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。2. 大腸菌群國標(biāo)法2/平板法大腸菌群平板計數(shù)法的檢驗程序見圖如下：2.1 稱取 25 mL 樣品,放入盛有225 mL無菌水

31、的無菌均質(zhì)杯內(nèi), 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min,制成 1:10 的樣 品勻液。 2.2 平板計數(shù)選取2個3個適宜的連續(xù)稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。及時將15 mL20 mL冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL4 mL VRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36 ±1 培養(yǎng)18 h24 h。2.3 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在 15 CFU150 CFU 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的

32、典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為 0.5 mm 或更大。2.4證實試驗從 VRBA 平板上挑取 10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于 BGLB 肉湯管內(nèi)，36 ±1 培養(yǎng) 24 h48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡 BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。2.5 大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的

33、大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。3. 美藍還原試驗3.1 原理本方法中所指牛乳衛(wèi)生質(zhì)量包括細(xì)菌的濃度和代謝強度以及體細(xì)胞代謝消耗一定量的所需要的時間。利用微生物及體細(xì)胞濃度愈大, 代謝愈旺盛, 單位時間內(nèi)消耗氧愈多, 美藍還原褪色時間相應(yīng)變短; 反之, 美藍褪色時間則相應(yīng)變長。在一定容量的牛乳內(nèi)加入定量的美藍,上覆少量消毒的液體石蠟以隔絕外界氧,在38水浴中靜置觀察美藍褪色時間的長短。 3.2 試劑和材料美蘭溶液分析天平: 感量0.1mg; 定溫浴槽(內(nèi)高不低于21cm); 試管: 18×1.8cm;

34、 金屬試管架; 吸管: 1和20ml。 玻璃器皿使用前均須進行滅菌，吸管上端須放有脫脂棉以防操作時唾液進入樣品。 3.3 操作方法 用消毒吸管吸取每個待測乳樣20ml,分別放入順序排列在試管架上、編有代號的試管中，再在每個試管內(nèi)加入美藍標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用一小張干凈硫酸紙蓋住管口，再用拇指壓緊，分別顛倒搖蕩混勻后，順序放在試管架上。在每個試管上部加入少許消毒液體石蠟封閉，然后將試管連同管架放入38恒溫浴槽中,應(yīng)使槽中水面不低于試管內(nèi)乳樣高度。記錄開始時間,經(jīng)常注意觀察每支試管的顏色變化。當(dāng)某一試管的顏色由藍變白(底部或表層余有少許藍色者也應(yīng)算其褪色完畢)即算褪色完畢,記錄其褪色時間。 3.4 結(jié)果

35、用小時和分鐘作為時間單位,表示每個樣品的美藍還原褪色時間。六、抗生素檢驗1. 活化菌種取一接種環(huán)嗜熱鏈球菌菌種，接種9mL滅菌脫脂乳中，置36士1恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h-15h后，置2-5冰箱保存?zhèn)溆茫?5h轉(zhuǎn)種一次。2. 測試菌液將經(jīng)過活化的嗜熱鏈球菌菌種接種滅菌脫脂乳，36士1恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h士1h，加入相同體積的滅菌脫脂乳混勻稀釋成測試菌液。3. 培養(yǎng)取檢樣9mL,置18mm×180mm試管內(nèi)，每份樣品另外做一份平行樣。同時再做陰性和陽性對照各一份，陽性對照管用9mL。青霉素G參照溶液，陰性對照管用9mL，滅菌脫脂乳。所有試劑置80士2水浴加熱5min，冷卻37以下，加

36、測試菌液1mL,輕輕旋轉(zhuǎn)試管混勻。36士1水浴培養(yǎng)2h，加4%TTC水溶液0.3mL,在旋轉(zhuǎn)混勻器上混合15s或振動試管混勻。36士1水浴培養(yǎng)30min，觀察顏色變化。如果顏色有變化，于水浴中繼續(xù)避光培養(yǎng)30min作最終觀察。觀察時要迅速，避免光照過久出現(xiàn)干擾。4. 判斷方法:在白色背景前觀察，試管中樣品呈乳的原色時，指示乳中有抗生素存在，為陽性結(jié)果。試管中樣品呈紅色為陰性結(jié)果，如最終觀察對象仍為可疑，建議重新檢測。七、摻假乳實驗1. 原理1.1 摻淀粉或米汁 為了提高牛乳的稠度和非脂固體的含量，往往在牛乳中加入淀粉或糊精，也有的直接加入米汁，對這類摻假可用碘淀粉反應(yīng)檢出。 反應(yīng)方程式: nI2+6n(C6H10O5) 2n(C18H30O15I) 當(dāng)?shù)庖号c淀粉接觸時，碘分子能進入淀粉分子的螺旋內(nèi)部，平均每六個葡萄糖單位(每圈螺旋)可以束縛一個碘分子，整個直鏈淀粉分子可以束縛大量的碘分子，這就形成了淀粉-碘的復(fù)合物顯藍色。對于支鏈淀粉(如糊精)則呈紅紫色。1.2 摻豆?jié){ 在牛乳中摻入豆?jié){，也是一種較為普遍的摻假行為。根據(jù)豆?jié){中含有皂角素，可在堿性中呈黃色反應(yīng)而判別。 (呈現(xiàn)微黃色可認(rèn)為摻入了10%以上的豆?jié){)1.3 摻食鹽 牛乳中摻入食鹽可以增加相對密度,提高非脂類固體的含量和重量?？梢圆捎孟跛徙y進行鑒別,呈