1、2 材料與方法2.1 儀器與材料2.1.1 儀器微量呼吸檢壓儀(SKW一3型)及其成套反應(yīng)瓶與壓力計(jì)（上?？萍即髮W(xué)）、立式壓力蒸汽滅菌器BL-50A（上海東亞壓力容器制造有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱GHP-9160（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、PHS-3C型精密 pH 計(jì)（上海雷磁儀器廠）、無菌操作臺(tái)VS840-1（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、恒溫振蕩器HZ-9211KB（太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、精密溫度計(jì)（最小分度價(jià)0.1度，上海大學(xué)上海工大工貿(mào)總公司）、電子天平AL104（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、DF-101S集熱式恒溫加

2、熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、超聲波清洗儀（上海杰恩普超聲設(shè)備有限公司）、觸點(diǎn)式水銀溫控計(jì)(050上?？萍即髮W(xué)）、移液槍、56mm玻璃珠、橡膠管、燒杯、容量瓶、錐形瓶、9cm培養(yǎng)皿、洗耳球、塑料滴管、濾紙片。2.1.2 材料大腸埃希氏菌（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，Lot：A0219B）、250g蜂王漿（福建省神蜂科技開發(fā)有限公司，10-HDA1.8%，Lot：QS350126010001）、蛋白胨（生工生物工程(上海)股份有限公司，Lot：X0912Y100）、酵母提取物（生工生物工程(上海)股份有限公司，Lot：X0521L050）、瓊脂粉（生工生物工程(上海)股份有限公司，

3、Lot：LSC0702S7013J）NaCl（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Lot：20140810）、膽酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，Lot：TN111OQA14）、考馬斯亮藍(lán)G250（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Lot：No.20140805）、氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Lot：20130202）、凡士林（南京金陵石油化工公司化工一廠）、蒸餾水。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 1mol/LNaOH溶液和檢壓液的制備用電子天平精確稱取4.00±0.01g的NaOH固體置于100mL燒杯中，加入50mL蒸餾水溶解后移入100mL容量瓶。用少量的蒸餾水反復(fù)洗滌燒杯和玻

4、璃棒3次，將洗滌液移入容量瓶，最后用蒸餾水定容備用。用電子天平精確稱取2.50±0.01g膽酸鈉，0.1±0.001g考馬斯亮藍(lán)置于250mL燒杯中，加入250mL蒸餾水溶解，用保鮮膜封口備用。2.2.2 LB液體培養(yǎng)基和 LB瓊脂培養(yǎng)基的制備精確稱取酵母提取物5.00±0.01g，蛋白胨10.00±0.02g，NaCl 10.00±0.02g至250mL燒杯，加200mL蒸餾水溶解。用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0后將溶液轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶，再取少量的蒸餾水反復(fù)洗滌燒杯和玻璃棒3次，將洗滌液移入容量瓶，最后用蒸餾水定容搖勻。

5、用量筒分裝至10個(gè)100mL錐形瓶中。其中一瓶各加入1.21.5g瓊脂粉，用脫脂棉和報(bào)紙封口后，置于125的立式壓力蒸汽滅菌器滅菌20 min。將未加瓊脂粉的9瓶LB液體培養(yǎng)基置于常溫下冷卻備用，而有加瓊脂粉的培養(yǎng)基待冷卻到60左右時(shí)均勻的注入5個(gè)滅過菌的培養(yǎng)皿（用報(bào)紙包好，在125的立式壓力蒸汽滅菌器滅菌20 min，干燥），冷凝制成 LB瓊脂培養(yǎng)基，并用封口膜封口，備用。2.2.3 蜂王漿菌落總數(shù)的測定將電子天平用75%消毒酒精擦拭后置于無菌操作臺(tái)上。將10mL容量瓶（滅菌：用無水乙醇洗滌、擦拭、晾干）置于天平上，去皮，用移液槍移取1±0.01g蜂王漿于容量瓶內(nèi)，用滅菌生理鹽水（

6、8.5gNaCl+1000mL蒸餾水，在125的立式壓力蒸汽滅菌器滅菌20 min，冷卻）定容，振蕩搖勻，制成10倍稀釋液，備用。用移液槍吸取1mL的10倍稀釋液置于10mL容量瓶（滅菌：用無水乙醇洗滌、擦拭、晾干）中，再用滅菌生理鹽水定容，振蕩搖勻，制成100倍稀釋液，備用。用移液槍吸取1mL的100倍稀釋液置于10mL容量瓶（滅菌：用無水乙醇洗滌、擦拭、晾干）中，再用滅菌生理鹽水定容，振蕩搖勻，制成1000倍稀釋液，備用。另取1瓶100mL的LB液體培養(yǎng)基，用量筒分裝至4個(gè)25mL錐形瓶，各加入0.30.375g瓊脂粉，用脫脂棉和報(bào)紙封口后，置于125的立式壓力蒸汽滅菌器滅菌20 min。

7、冷卻至60左右分別加入1mL滅菌生理鹽水、10倍稀釋液、100倍稀釋液、1000倍稀釋液搖勻，迅速注入滅過菌的培養(yǎng)皿（用報(bào)紙包好，在125的立式壓力蒸汽滅菌器滅菌20 min，干燥）約1113mL。滅菌生理鹽水和每個(gè)稀釋液各做兩個(gè)培養(yǎng)皿。待瓊脂凝固后，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，翻轉(zhuǎn)平板，置于37.0±1的隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h±2h。之后用肉眼或放大鏡對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)（連成片的無效，相連的算一個(gè)），并求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。2.2.4 不同濃度梯度蜂王漿培養(yǎng)液的制備將電子天平用75%消毒酒精擦拭后置于無菌操作臺(tái)上。將100mL容量瓶（滅菌：用無水乙醇洗滌、擦拭、

8、晾干）置于天平上，去皮，用移液槍移取10.00±0.001g蜂王漿于容量瓶內(nèi)，用LB液體培養(yǎng)基定容，制成10mg/mL蜂王漿培養(yǎng)液，備用。用移液槍吸取2mL10mg/mL蜂王漿培養(yǎng)液置于10mL容量瓶（滅菌：用無水乙醇洗滌、擦拭、晾干）中，用LB液體培養(yǎng)基定容，振蕩搖勻，制成2mg/mL蜂王漿培養(yǎng)液，備用。再吸取4mL10mg/mL蜂王漿培養(yǎng)液置于10mL容量瓶中，用LB液體培養(yǎng)基定容，振蕩搖勻，制成4mg/mL蜂王漿培養(yǎng)液，備用。如此重復(fù)操作，制取濃度分別是2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL的蜂王漿培養(yǎng)液，備用。2.2.5 大腸埃希氏菌（大腸桿菌）的培養(yǎng)2.2.

9、5.1 大腸埃希氏菌凍干菌的復(fù)蘇開啟菌種前，用75%酒精棉球消毒西林瓶表面。在無菌操作臺(tái)上，用消毒過的鑷子按鋁蓋上的箭頭方向打開塑料蓋，撕開鋁蓋，打開西林瓶膠塞，加入0.3mL左右的復(fù)蘇液，用移液槍反復(fù)吹吸，將凍干菌溶解成懸液，然后用移液槍將懸液分別滴到5個(gè)LB瓊脂培養(yǎng)基，用滅菌過的推環(huán)將其均勻的涂于平板上。正放30min讓復(fù)蘇的大腸埃希氏菌充分吸附到培養(yǎng)基上，然后翻轉(zhuǎn)平板，置于37.0±1的隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h±1h。2.2.5.2 大腸埃希氏菌（大腸桿菌）母液的培養(yǎng)取其中一個(gè)復(fù)蘇后的培養(yǎng)基于無菌操作臺(tái)上，用滅菌過的接種環(huán)挑取典型菌落（單個(gè)存在且長勢(shì)較好），接種到滅

10、過菌的LB液體培養(yǎng)基。然后在37.0±1的恒溫恒溫振蕩器上培養(yǎng)12h獲得大腸埃希氏菌（大腸桿菌）母液。2.2.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)備的準(zhǔn)備232.2.6.1 微量呼吸檢壓儀調(diào)節(jié)往微量呼吸檢壓儀的水槽中注入蒸餾水，至水槽邊緣35cm，將旋轉(zhuǎn)觸點(diǎn)式水銀溫控計(jì)，將溫度調(diào)節(jié)到37，在水槽中插入校正過的精密溫度計(jì)，開啟儀器。待加熱燈自動(dòng)熄滅之后，觀察精密溫度計(jì)上的示數(shù)是否為37，如若不是則調(diào)節(jié)觸點(diǎn)式水銀溫控計(jì)，使溫度保持在37.0±0.05為止。2.2.6.2 微量呼吸檢壓儀的安裝及密閉性檢測用蒸餾水和無水乙醇清洗成套的反應(yīng)瓶與壓力計(jì)，并置于無菌操作臺(tái)內(nèi)紫外滅菌30min。取若干1015cm的

11、橡膠管，一段用玻璃珠塞好，從另一端注入配制好的檢壓液至溢出并保證管內(nèi)無氣泡，然后套進(jìn)每根壓力計(jì)的下端，用手輕輕擠壓橡皮管觀察液壓柱是否斷層，若出現(xiàn)斷層則拆下重新再裝，直至不出現(xiàn)斷層為止。接著取少量凡士林涂在反應(yīng)瓶側(cè)臂及壓力計(jì)的磨口處，再用橡皮筋固定好將反應(yīng)瓶與壓力計(jì)。將組合好的反應(yīng)瓶與壓力計(jì)安裝到鐵架上，并關(guān)閉三通活塞，迅速把反應(yīng)瓶放入37水浴中，壓力計(jì)內(nèi)的檢壓液快速左移。若兩壓力柱的液面保持一定液壓差則證明密閉系統(tǒng)良好，若無上述現(xiàn)象則說明密閉性不夠，需重新檢查各接口的密閉情況及其它可能原因，直至密閉性良好方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次檢測前都需要檢驗(yàn)裝置的密閉反應(yīng)系統(tǒng)是否良好。2.2.7 測量在不同濃度

12、梯度的王漿培養(yǎng)液中大腸桿菌的耗氧量取14套成套且滅過菌的反應(yīng)瓶與裝好檢壓液的壓力計(jì)置于無菌操作臺(tái)內(nèi)，用紫外燈照射30min。將反應(yīng)瓶取下，在反應(yīng)瓶F內(nèi)的小圓柱里加入0.5mL的1mol/LNaOH溶液并插入一小張濾紙條（2cm×0.5cm），在反應(yīng)瓶側(cè)臂S內(nèi)加入0.2mL不同濃度梯度的王漿培養(yǎng)液和0.1mL大腸埃希氏菌（大腸桿菌）母液，然后塞上橡膠塞并將反應(yīng)瓶與壓力計(jì)重新連接好。每個(gè)濃度梯度的王漿培養(yǎng)液做三組平行實(shí)驗(yàn)，另做兩組空白對(duì)照，即取0.2mL的LB液體培養(yǎng)基（不含王漿）和0.1mL大腸埃希氏菌（大腸桿菌）母液混合。然后將加好樣的反應(yīng)瓶和壓力計(jì)安放到微量呼吸檢壓儀，再次檢驗(yàn)密閉

13、反應(yīng)系統(tǒng)。確定密閉性良好后，打開三通閥，旋轉(zhuǎn)壓力架低端的旋鈕，使壓力計(jì)內(nèi)的兩減壓液面平行處于15uL刻度處后關(guān)閉三通閥開始測量。待測壓管開口端液面不再下降后方可記錄示數(shù)，并記錄每個(gè)配套的反應(yīng)瓶和壓力計(jì)的編號(hào)。測量結(jié)果如下：表1 微量呼吸檢壓儀的示數(shù)濃度（mg/mL）00222444666888編號(hào)1-12-13-14-15-16-17-18-19-110-111-112-113-114-1初始值1515151515151515151515151515末值5.35.02.32.42.50.40.20.16.56.76.98.28.07.82.2.8 確定大腸桿菌呼吸代謝的最適濃度按照2.2.4的

14、方法和步驟，制取濃度分別是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的蜂王漿培養(yǎng)液。再按照2.2.6和2.2.7的方法和步驟，測量出大腸桿菌在上述濃度中的耗氧量。測量結(jié)果如下：表2 微量呼吸檢壓儀的示數(shù)王漿濃度（mg/mL）11222333444555編號(hào)1-12-13-14-15-16-17-18-19-110-111-112-113-114-1初始值1515151515151515151515151515末值3.23.12.52.32.41.61.50.80.40.20.15.55.75.93 結(jié)果分析3.1 蜂王漿菌落總數(shù)的計(jì)數(shù) 圖1 對(duì)照組 圖2 對(duì)照組 圖3

15、 王漿濃度0.1g/mL 圖4 王漿濃度0.1g/mL 圖5 王漿濃度0.01g/mL 圖6 王漿濃度0.01g/mL 圖7 王漿濃度0.001g/mL 圖8 王漿濃度0.001g/mL 表3 蜂王漿中的菌落總數(shù)王漿濃度（g/mL）000.10.10.010.010.0010.001菌落數(shù)00000000由于蜂王漿本身呈酸性，且其中含有的10-HDA有具有較強(qiáng)的抑菌作用，結(jié)合表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測，樣品中幾乎不含任何微生物，故該樣品可直接用于本次實(shí)驗(yàn)無需再做滅菌處理。3.2 耗氧量的計(jì)算由表1、表2的數(shù)據(jù)可計(jì)算出不同濃度王漿培養(yǎng)液的測壓管開口端液面的平均下降量為：表4 測壓管開口端液面平均下降量

16、王漿濃度（mg/mL）01234568下降量9.8511.8512.613.7114.789.298.297.00因?yàn)榉磻?yīng)瓶中加入了NaOH溶液，所以大腸桿菌呼吸代謝所釋出的CO2被完全被吸收，故實(shí)驗(yàn)所記錄的容積變化，即為耗氧量的變化，其可用下列公式計(jì)算：Xo2=K·h （1）其中：Xo2為耗氧量(uL/h)，K為反應(yīng)瓶常數(shù)，h為測壓管開口端液面下降量。 （2）其中：K為反應(yīng)瓶常數(shù)，V（反應(yīng)瓶中氣體體積）為反應(yīng)瓶至測壓臂右端規(guī)定刻度之空間容積減去瓶中被測液體積和NaOH溶液、濾紙的體積，V加入反應(yīng)瓶中的溶液量，T0為273+水浴溫度（37），T為273， 為O2在37下液體中的溶解度

17、，P0在一個(gè)大氣壓下,壓力計(jì)中膽酸鈉液面應(yīng)呈現(xiàn)的高度，通常以1000計(jì)算。（273K就是零攝氏度）將表4的數(shù)據(jù)帶入公式（1）、（2），計(jì)算可得：表5 不同濃度梯度的王漿培養(yǎng)液中大腸桿菌的總耗氧量王漿濃度（mg/mL）01234568總耗氧量（uL）21.67 25.24 26.21 28.93 31.33 19.97 17.41 14.49 圖9 不同濃度梯度的王漿培養(yǎng)液中大腸桿菌的總耗氧量由表5我們可以看出，當(dāng)蜂王漿濃度大于5mg/mL時(shí)，大腸桿菌的總耗氧量（19.97uL）小于未加蜂王漿的大腸桿菌的總呼吸量（21.67uL），故我們可推出當(dāng)蜂王漿濃度大于5mg/mL時(shí)，大腸桿菌的呼吸代謝受到抑制。由圖9我們可以看出，當(dāng)蜂王漿濃度為4mg/mL時(shí)，大腸桿菌的耗氧量最大。故我們可以推測出，促進(jìn)大腸桿菌呼吸代謝的最適濃度為4mg/mL。4 結(jié)論與討論4.1 結(jié)論經(jīng)過實(shí)驗(yàn)以及對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，我們可以得出以下結(jié)論：當(dāng)蜂王漿濃度大